科研指标测定方法.doc

指标：1、品质指标硬度、色泽、褐变指数、失重率、腐烂率、可溶性固型物、呼吸强度、乙烯释放率、可滴定酸、Vc2、抗性指标抗氧化衰老的有：SOD CAT APX GSH MDA 原果胶（可溶性果胶）抗病相关指标有：PPO POD CHT GUL PAL总酚 类黄酮 木质素3、测定方法：褐变指数色泽失重率腐烂率呼吸强度乙烯释放率硬度可溶性固型物可滴定酸：试剂：0.1mol/LNaOH(4g纯+1000ml蒸馏水，邻苯二甲酸氢钾标定) 1%酚酞试剂（1g酚酞加入到100ml50%的乙醇溶液中溶解）方法：1、NaOH的标定： 准确称取105下烘干至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾0.6g ，加入50ml新煮沸过的冷水，振摇，使其尽量溶解，再滴加2滴1%酚酞指示剂，用配置的NaOH溶液标定，滴定至溶液呈粉红色。每1mlNaOH相当于20.42mg邻苯二甲酸氢钾，计算出NaOH滴定液的浓度。2、测定步骤：称10g苹果，研磨，转移到100ml容量瓶中，蒸馏水洗研钵3次再定容，摇匀，静置30min后过滤。吸取20ml滤液，转入三角瓶中，加入两滴1%酚酞试剂，用已标定的氢氧化钠溶液进行标定，滴定至溶液初现粉色并30秒内不退色为终点（PH8.1-8.3）,重复三次，再用蒸馏水作为滤液进行滴定作为空白对照。可定丁酸含量=【样品提取液总体积*氢氧化钠滴定液浓度*（滴定滤液消耗的氢氧化钠体积滴定蒸馏水消耗的氢氧化钠体积）】/（滴定时所取滤液体积*样品质量）Vc：试剂：5%钼酸铵溶液（称取5g钼酸铵溶于蒸馏水中，并定容至100ml）草酸-EDTA溶液（称取6.3g草酸和0.75gEDTA-Na2溶于蒸馏水中并定容至1000ml）5%H2SO4(体积分数) 偏磷酸-乙酸溶液（取棒状偏磷酸3g加20%冰醋酸48ml，溶解后加蒸馏水稀释至100ml,必要时过滤，在冰箱中可保存3天）Vc标准溶液（称取Vc100mg，置100ml容量瓶中，加适量草酸-EDTA溶液溶解后，在用该溶液定容到100ml，即成1mg/ml标准液，此溶液随配随用（如果纯度不够应进行标定）提取及测定：1、制作标准曲线： 7支25ml具塞试管，按下表加入各种试剂试剂 试管号 1 2 3 4 5 6 7Vc标准液/ml 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0草酸EDTA溶液/ml 5.0 4.9 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0偏磷酸-乙酸溶液/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.51:19H2SO4/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.05%钼酸铵/ml 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0Vc含量/mg 0 10 20 40 60 80 100加完试剂摇匀后，置30水浴中保温15min，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用1号空白管调零，在760nm波长下比色，记录吸光度，以Vc含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。2、提取及测定：称取5g果蔬组织，加5ml草酸-EDTA溶液研磨成匀浆，并仔细转入25ml容量瓶中，再用提取介质冲洗研钵，冲洗液一并倒入容量瓶中。取一部分匀浆液经3000g离心10min后，取1ml上清液与标准管同法测定，若样品显色液中出现沉淀，可过滤后进行比色，不影响测定结果。计算公式：Vc含量（mg*100g-1FW）=标准曲线上查的的Vc的量*样品提取液总体积/(测定时所用样品液体积*样品鲜重)注意：显色温度和加入显色剂后的时间要一致。GSH：试剂：50g/L三氯乙酸（5g三氯乙酸和蒸馏水溶解稀释至100ml，再加入186mgEDTA-Na2.2H2O）0.1mol/LPH7.7磷酸钠缓冲液和0.1mol/LPH6.8磷酸钠缓冲液 4mmol/L二硫代硝基苯甲酸（15.8mgDTNB，用0.1mol/L、PH6.8磷酸缓冲液溶解，定容至10ml，摇匀，4保存）100umol/L还原性谷胱甘肽标准液（3g还原型谷胱甘肽加入少量无水乙醇用蒸馏水定容至100ml）实验步骤：1、标准曲线制作：取六只试管编号，按下表加入各种试剂，混匀，于25保温反应10min，以0号管为参比调零，测定显色液在波长412nm处的吸光度值，以吸光度值为纵坐标，还原型谷胱甘肽为横坐标，绘制标准曲线。项目 管号 0 1 2 3 4 5还原型谷胱甘肽标液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸馏水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0PH7.7磷酸缓冲液/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0DTNB试剂/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5相当于还原型谷胱甘肽物质的量/umol 0 20 40 60 80 1002、提取和测定：5g果实加入经预冷的三氯乙酸，在冰浴下研磨匀浆，于4、12000xg离心20min，收集上清液测定。取一只试管，依次加入1ml蒸馏水、1mlPH7.7磷酸缓冲液和0.5mlDTNB，混匀即为绘制标准曲线的0号管溶液，此液作为参比调零。另取两支试管，分别加入1ml上清液、1mlPH7.7磷酸缓冲液，然后向一只管中加入0.5mlDTNB，向另一支管中加入0.5mlPH6.8磷酸缓冲液。将两只管置于25下保温反应10min，迅速测定显色液在波长412nm下的吸光度值，分别记作ODs和ODc。重复三次。根据ODs-ODc的差值从标准曲线上查的还原型谷胱甘肽含量，计算每克果实中还原型谷胱甘肽的含量：还原型谷胱甘肽含量=（标准曲线上查得的值*样品提取液总体积）/（吸取样品液体积*样品质量）注意：先做样品本底对照。MDA：试剂：100g/L三氯乙酸（称取10g三氯乙酸蒸馏水溶解稀释至100ml）6.7g/L硫代巴比妥酸（称取0.67g硫代巴比妥酸，用100ml0.05mol/L氢氧化钠溶解）测定步骤：称取1g果蔬样品，加入5ml三氯乙酸溶液，研磨匀浆于410000g离心20min，收集上清液低温保存备用。取2ml上清液，对照空白管中加入2ml三氯乙酸代替提取液，分别加入2ml0.67%硫代巴比妥酸，混合后在沸水浴中煮沸20min，取出冷却后再离心一次，分别测定上清液在450nm、532nm、600nm波长处的吸光度值，重复三次。计算：丙二醛含量（umol/L）=6.45*(OD532-OD600)-0.56*OD450每克果蔬中丙二醛的含量=丙二醛含量*样品提取液总体积/(测定时所取样品液体积*样品质量*1000) 注意：出现负值，表明糖的影响很大，需做预实验确定适宜的条件。原果胶（可溶性果胶）：试剂：1.5g/L咔唑-乙醇溶液（称取0.15g咔唑加入无水乙醇溶解并稀释至100ml） 100ug/ml半乳糖醛酸标准液（称取10mg半乳糖醛酸M=194,用蒸馏水溶解定容至100ml） 浓硫酸 95%乙醇 0.5mol/L硫酸溶液测定步骤：1、制作标准曲线：取6支25ml具塞刻度试管，编号，按下表加入半乳糖醛酸标准液，然后小心地沿管壁加入6ml浓硫酸，在沸水浴中加热20min，取出冷却至室温后，各加入0.2ml1.5g/L咔唑-乙醇溶液，摇匀，在暗处放置30min后，测定反应液在波长530nm处的吸光度值，并以吸光度值为纵坐标，半乳糖醛酸质量（ug）为横坐标，绘制标准曲线求出方程。项目 管号 0 1 2 3 4 5半乳糖醛酸标准液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸馏水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0相当于半乳糖醛酸的量/ug 0 20 40 60 80 1002、提取测定：（1）可溶性果胶提取：称取1g果蔬组织，研磨成匀浆转入50ml刻度离心管中，加入25ml95%乙醇，在沸水浴上加热30min，以除去样品中糖分及其他物质，注意在煮沸过程中要及时补加95%乙醇。取出冷却至室温，于8000r/min离心5min，弃去上清液，再加入95%乙醇在沸水浴上加热，如此重复3-5次。然后将沉淀放入试管中，加入20ml蒸馏水，在50水浴中保温30min，以溶解果胶。取出冷却至室温后，于8000r/min下离心15min，将上清液移入100ml容量瓶中，用少量水洗涤沉淀，离心后一并将上清液移入容量瓶中，加蒸馏水至刻度，此溶液即为可溶性果胶。（2）原果胶提取：将上述遗留的沉淀物，保留在刻度离心管仲，再向其中加入25ml0.5mol/L硫酸溶液，在沸水浴中加热1h以水解原果胶，取出冷却至室温后，于8000r/min下离心15min,将上清液移入100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，此为原果胶测定液。（3）测定：吸取1ml提取液，加入到25ml刻度试管中，按标准曲线的操作步骤进行测定，重复三次。计算：根据吸光度值查得半乳糖醛酸质量，计算每克果蔬中果胶含量，以半乳糖醛酸质量分数表示。半乳糖醛酸含量=查得的半乳糖醛酸量*样品提取液总体积/(测定时所取样品液体积*样品质量) 注意：检验糖分是否除尽的方法：取0.5ml提取液置于试管中，加入2-3滴50g/L-萘酚的乙醇溶液，充分混合，此时溶液稍有白色沉淀，然后使试管稍稍倾斜，用吸管沿管壁加入1ml浓硫酸（注意水层与硫酸层不可混合）。待试管静置后，若在两层的界面上产生紫红色环，则证明提取液中含有糖分总酚：试剂：钨酸钠(Na2WO42H2O)、钼酸钠(Na2MoO42H2O)、硫酸锂(Li2SO4)、磷酸(H3PO485%)、磷钼酸(24MoO3P2O5xH2O)、碳酸钠(Na2CO3)、盐酸和溴水为分析纯。一水合没食子酸标样为Sigma -Aldrich 公司产品。水为蒸馏水。1.1.2 FC 显色剂:称取50.0 g 钨酸钠和12.5 g 钼酸钠, 用350 mL 蒸馏水溶于1 000 mL 回流瓶中, 加入25 mL 磷酸和50 mL 盐酸, 混匀, 微沸回流2 h, 加入75.0 g 硫酸锂、25 mL 蒸馏水和数滴溴水, 开口沸腾约15min( 至溴水挥尽为止) , 冷却, 定容至500mL,过滤, 置棕色瓶中保存备用。使用时加入1 倍蒸馏水稀释。1.1.3 FD 显色剂:称取100.0 g 钨酸钠和20.0 g 磷钼酸, 溶于200 mL 蒸馏水, 加入50 mL 磷酸, 加热回流2 h, 冷却, 定容至1 L。1.1.4 7.5%碳酸钠溶液：称取37.5 g 碳酸钠, 溶于250 mL 温水, 混匀, 冷却, 定容至500 mL。1.1.5 一水合没食子酸标准溶液:称取0.110 g 一水合没食子酸, 用蒸馏水溶解、定容至100 mL, 此溶液质量浓度为1 000 mg/L。分别吸取此溶液0.0、1.0、2.0 、3.0、4.0、5.0 mL 至100 mL 容量瓶中, 用蒸馏水定容至刻度, 所得一水合没食子酸标准溶液的质量浓度分别为0.0、10、20、30、40、50 mg/L。取试样适量( 葡萄酒吸取2mL,葡萄和柿子称取2 g 匀浆, 其他水果称取5 g 匀浆) ,用80 mL 蒸馏水洗入100 mL 容量瓶中, 至100 沸水浴中保温30 min, 取出, 冷却, 定容, 过滤, 滤液备用。使用5 mL 刻度吸管吸取1.0 mL 滤液( 若多酚含量过高, 可适当稀释) 或一水合没食子酸标准溶液, 分别用刻度吸管加入FC 显色剂或FD 显色剂及7.5%碳酸钠溶液, 用蒸馏水定容至10 mL,混匀, 室温显色( 下同) , 测定765 nm 吸光度, 根据稀释倍数和从标准曲线中查出的浓度, 计算样品多酚含量。对于FD 法, 最佳的测定条件为分别吸取1 mL 滤液、1 mL FD 显色剂、2 mL 7.5%碳酸钠溶液和6 mL 蒸馏水, 于10 mL离心管中混匀, 室温下显色3060 min, 测定765 nm吸光度。对于FC 法, 最佳测定条件为分别吸取1 mL 滤液、1 mL FC 显色剂、3 mL 7.5%碳酸钠溶液和5 mL蒸馏水, 于10 mL 离心管中混匀, 显色3060 min, 测定765 nm 吸光度。总酚含量测定:参照王军节：1 g 果皮组织与预冷的5 mL 1 %HCl - 甲醇溶液充分研磨提取,然后在4 下,8 000 r/ min 离心10 min后,取上清液直接用于比色,样品重复测3 次,酚类含量以OD280 / gFW 表示.类黄酮: 试剂：1%盐酸-甲醇溶液（取1ml浓盐酸加入到99ml甲醇中，摇匀，于4预冷）提取及测定：称取2g果肉组织，加入少许经预冷的1%盐酸-甲醇溶液，冰浴研磨匀浆，转入20ml刻度试管中，用1%盐酸-甲醇溶液冲洗研钵，一并转移到试管中，定容至刻度，混匀，于4避光提取20min，期间摇动数次，然后过滤，收集滤液待用。以1%盐酸-甲醇溶液做参比调零，取滤液分别于波长280nm、325nm处测定溶液吸光度值，OD280表示总酚含量，OD325表示类黄酮含量。注意：此测定方法仅能判断样品之间总酚、类黄酮的相对含量，若要准确含量，可以用不同浓度没食子酸做标准曲线，计算总分物质含量，用芦丁制作标准曲线，计算类黄酮含量。木质素：参照Morrison (1972) 法12 并修改。1 g 果肉组织与预冷的4 mL 体积分数95 %乙醇研磨,4 下12000 g 离心10 min ,沉淀物用体积分数95 %乙醇冲洗3 次,再用乙醇正己烷体积比= 1 2 冲洗3 次,然后加1 mL 2 mol/ L NaOH 中止反应。再加2mL冰醋酸和0.1 mL 7.5 mol/ L 盐酸羟胺,离心,取上清0.5 mL ,用冰醋酸定容至10 mL ,280 nm 下测定样品吸光值,样品重复测3 次。木质素含量以OD280 / g(鲜重) 表示。SOD：试剂：0.1mol/LPH7.8磷酸钠缓冲液 提取缓冲液（5gPVP和35ul-巯基乙醇加入到0.1mol/LPH7.8磷酸缓冲液定容至100ml,摇匀，低温4贮藏备用。）50mmol/LPH7.8磷酸钠缓冲液 130mmol/L L-蛋氨酸（称取1.94gL-蛋氨酸，用50mmol/LPH7.8磷酸缓冲液溶解定容至100ml,充分混匀，先用现配，低温避光保存，可使用1-2天） 750umol/L氮蓝四唑溶液（称取61.3mgNBT,用蒸馏水溶解，定容至100ml,充分混匀，现用现配，低温避光保存，可用2-3天）100umol/LEDTA-Na2溶液（称取37.2mgEDTA-Na，用蒸馏水溶解，定容至100ml,使用时稀释100倍，低温避光保存，可用8-10天）20umol/L核黄素溶液（称取73.2mg核黄素，蒸馏水溶解，定容至100ml,使用时稀释100倍，低温避光保存，随配随用（黑纸包好）。提取及测定：5g果蔬样品，加入5ml提取缓冲液，在冰浴下研磨成匀浆，转入离心管中，于412000*g离心30min，收集上清液，低温保存备用。取5支试管，按照下表加入各种溶液，注意最后加入核黄素。其中3支为测定管，其余两支为对照管，混匀后，将一只对照管置于暗处，其他各管置于4000lx日光灯下反应15min后立即取出，置于暗处终止反应。以不照光管做空白参比调零，于560nm处分别测定其它各管的吸光度值。试剂 用量/ml 终浓度（比色时）50mmol/LPH7.8磷酸缓冲液 1.7 130mmol/L蛋氨酸溶液 0.3 13mmol/L750umol/L氮蓝四唑溶液 0.3 75umol/L100umol/LEDTA-Na2溶液 0.3 10umol/L20umol/L核黄素溶液 0.3 2umol/L酶液 0.1 对照两支管以缓冲液代替总体积 3ml显色反应后，分别记录样品管反应混合液的吸光度值（ODs）和照光对照管反应混合液的吸光度值（ODc）,以每分钟每克果蔬的反应体系对氮蓝四唑光化还原的抑制为50%为一个SOD活性单位（U）表示。SOD活性=（ODc-ODs）*样品提取液总体积/(0.5*ODc*测定时所取样品液总体积*光反应时间*样品质量) 注意：需要通过预实验摸索显色反应所需时间，温度以25为宜，低时适当延长时间，高时缩短时间。CAT ：试剂：0.1mol/LPH7.5磷酸钠缓冲液 50mmol/LPH7.5磷酸缓冲液 提取缓冲液（5gPVP 和-巯基乙醇用0.1mol/L磷酸缓冲液溶解定容至100ml,低温4贮藏备用。）20mmol/LH2O2溶液（227ul的30%H2O2溶液用50mmol/L磷酸缓冲液稀释至100ml,先用现配，低温避光保存）测定步骤：称取5g果蔬样品，加入5ml提取缓冲液，冰浴下研磨至匀浆，于4、12000*g离心30min,收集上清液，即为酶提取液。酶促反应体系由2.9ml20mmol/LH2O2溶液和100ul酶提取液组成。以蒸馏水为参比空白，在反应15s时开始记录反应体系在波长240nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔30s记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据，重复三次。制作反应体系吸光度值随时间变化的曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值OD240。然后以每克果蔬样品每分钟吸光度值减少0.01为一个过氧化氢酶活性单位，单位是0.01OD240/min*g。计算公式：OD240*样品提取液总体积/(0.01*测定时所取样品液体积*样品质量)APX：试剂：0.1mol/LPH7.5磷酸钾缓冲液 50mmol/LPH7.5磷酸钾缓冲液 提取缓冲液（2.9mgEDTA、17.6mg抗环血酸和2gPVPP,用0.1mol/L磷酸钾缓冲液溶解定容至100ml,4预冷保存）反应缓冲液（2.9mgEDTA和8.8mg抗环血酸，用50mmol/L磷酸钾缓冲液溶解定容至100ml,4预冷保存）2mmol/LH2O2(1.14ml30%H2O2,用蒸馏水稀释至100ml,混匀，即得2mmol/LH2O2溶液)提取测定：5g果蔬样品加入5ml经4预冷的提取缓冲液，冰浴研磨匀浆后，在412000*g离心30min，收集上清液，即为酶提取液。取一只试管依次加入2.6ml反应缓冲液和0.1ml酶提取液，最后加入0.3ml2mmol/LH2O2溶液启动酶反应，立即混匀，并开始计时。从启动后15s开始记录反应体系在290nm处吸光度值，每隔30s记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。以蒸馏水为参比调零。重复三次。计算：制作OD290随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度值变化OD290，然后以每克样品APX酶促反应体系在波长290nm处吸光度值降低0.01为一个酶活性单位，单位是0.01OD290/min*gmF计算公式：APX活性=OD290*样品提取液总体积/(0.01*测定时所取样品提取液体积*样品质量) 注意：预先测试以确定反应条件PPO：试剂：0.1mol/LPH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液 提取缓冲液（340mgPEG6000、4gPVPP和1mlTritonX-100用0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液稀释至100ml）50mmol/L邻苯二酚溶液（275mg邻苯二酚，用0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液溶解稀释至50ml）提取测定：5g果蔬样品，加入5ml提取缓冲液，在冰浴下研磨至匀浆，于4、12000*g下离心30min，收集上清液，即为酶提取液，低温保存备用。取一只试管，加入4ml50mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液和1ml50mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100ul酶提取液，同时立即开始计时，将反应混合液倒入比色杯中，置于分管光度计样品室中，以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在波长420nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔1min记录一次，连续测定，至少获取六个点的数据。重复三次。制作吸光度值随时间变化的曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值OD420，以每克果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1为一个活性单位，单位是OD420/min*g，计算公式：U=OD420*样品提取液总体积/测定时所取样品液体积*样品质量)注意：做预实验，确定酶促反应呈线性变化的时间段，以在以后的测定中只需测完线性变化阶段以节省时间。POD ：试剂：0.1mol/LPH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液（母液A为200mmol/L醋酸溶液，量取11.55ml冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000ml;母液B为200mmol/L醋酸钠溶液，量取16.4g无水醋酸钠或称取27.2g三水合乙酸钠，用蒸馏水溶解定容至1000ml;取68ml母液A和432ml母液B，混合后调节PH至5.5，加蒸馏水稀释至1000ml）提取缓冲液（称取340mgPEG6000、4gPVPP和1mlTritonX-100用0.1mol/L乙酸乙酸钠缓冲液稀释至100ml）25mmol/L愈创木酚溶液（取50mmol/L愈创木酚，用50mmol/LPH5.5乙酸乙酸钠缓冲液稀释至100ml）0.5mol/LH2O2溶液（取1.42ml30%H2O2浓度约为17.6mol/L溶液,用50mmol/LPH5.5乙酸乙酸钠缓冲液稀释至50ml,现用现配，避光保存。）提取及测定：称取5g果蔬组织，加入5ml提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于412000*g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。取一只试管，加入3ml25mmol/L愈创木酚溶液和0.5ml酶液，再加入200ul0.5mol/LH2O2溶液迅速混合启动反应，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室，以蒸馏水为参比，在反应15s开始记录反应体系在波长470nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔1min记录一次，至少获取六个点的数据，重复三次。制作吸光度值随时间变化的曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值OD470，以每克果蔬样品每分钟吸光度变化值增加1时为一个过氧化物酶活性单位，单位是OD470/min*g计算公式：U=OD470*样品提取液总体积/(测定时所取样品液体积*样品质量)GLU ：试剂：0.1mol/LPH5.2乙酸乙酸钠缓冲液，见附录；提取缓冲液（称取29mgEDTA，吸取35ul-巯基乙醇，加入到0.1mol/LPH5.2乙酸乙酸钠缓冲液中，定容至100ml,低温贮藏备用。）50mmol/LPH5.2乙酸乙酸钠缓冲液 10g/L胶状几丁质（称取1g几丁质，加入4ml经4预冷的丙酮在冰浴通风条件下充分研磨，期间可适当加入丙酮，应充分研细，然后边研磨边缓缓加入30ml浓盐酸，几分钟后完全溶解，于48000g离心15min，收集上清液，将上清液缓缓加入到剧烈搅拌的50%乙醇溶液中至少是上清液体积5倍以上，充分搅拌后静置使胶状几丁质沉淀析出，通过过滤弃去上清液，收集胶状几丁质沉淀。用去离子水反复冲洗至PH=7.0后，定容至100ml，即配置成10g/L胶状几丁质悬浮液，避光保存于冰箱中。）30g/L脱盐蜗牛酶（称取0.6g脱盐蜗牛酶，溶解到20ml0.mol/LPH5.2乙酸乙酸钠缓冲液中，低温避光保存）0.6mol/L四硼酸钾溶液（称取9.71g5水四硼酸钾，用蒸馏水溶解定容至50ml）对二甲氨基苯甲醛储备液（称取10g对二甲氨甲苯甲醛溶于87.5ml冰醋酸和12.5ml10mol/L盐酸混合液中，于4保存，使用前用冰醋酸稀释5倍）0.1mol/LN-乙酰葡萄糖胺标准液（称取2.2mgN-乙酰葡萄糖胺，用少量乙醇溶解后，用蒸馏水在稀释，定容至100ml）提取及测定:1、标准曲线的制作：取6支具塞试管，按下表加如试剂项目 管号 0 1 2 3 4 5 0.1mol/LN-乙酰葡萄糖胺/ml 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5蒸馏水/ml 1.5 1.2 0.9 0.6 0.3 00.6mol/L四硼酸钾/ml 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2相当于N-乙酰葡萄糖胺物质的量/umol 0 30 60 90 120 150 加入0.2ml0.6mol/L四硼酸钾溶液，将试管置于沸水浴中煮沸5min，然后迅速冷却，冷却后加入2ml用冰醋酸稀释5倍的对二甲氨基苯甲醛溶液，再在37保温培养20min进行显色反应。以0号管为参比空白，于波长585nm处测定显色液的吸光度值，以吸光度为纵坐标，N-乙酰葡萄糖胺的量为横坐标，制作标准曲线，求得方程。2、提取及测定：称取10g果蔬样品，加入10ml预冷的提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，转入离心管中，在412000g下离心30min，收集上清液，低温保存备用。将上清液盛到透析袋中，置于蒸馏水中，于4透析过夜。然后410000g下离心15min，收集上清液备用，若浓度过低，可通过冷冻干燥进行浓缩。取两只试管，分别加入0.5ml50mmol/LPH5.2乙酸-乙酸钠缓冲液，0.5ml10g/L胶状几丁质悬浮液，然后一支反应管中加入0.5ml酶提取液，另一支管中加入0.5ml经煮沸5min的酶液作为对照，混匀。将反应管置于37保温培养1h,后，加入0.1ml30g/L脱盐蜗牛酶，混合继续在37保温培养1h，以释放生成N-乙酰葡萄糖胺单体，保温后取出，立即加入0.2ml0.6mol/L四硼酸钾溶液，并在沸水浴中煮沸30分钟，然后迅速冷却，冷却后按制作标准曲线的方法操作。重复三次。根据样品管反应液与对照管反应液吸光度值的差值，在标准曲线上查出相应N-乙酰葡萄糖胺的量，记作n，以每秒钟每克样品中酶分解胶状几丁质产生1*10-9mol/LN-乙酰葡萄糖胺作为一个几丁质酶活性单位，单位是1*10-9mol/s*gmF,计算公式：U=n*样品提取液总体积*1000/（测定时所取样品液体积*酶促反应时间*样品质量）注意：也可以用丙酮沉淀、透析法或凝胶过滤法对样品提取液进行脱盐处理，也可以直接测定粗提取液中几丁质酶活性。CHT ：试剂：0.1mol/LPH5.2乙酸-乙酸钠缓冲液（母液配制方法见附录，取105ml母液A和395ml母液B混合后，调节PH值到5.2，稀释至1000ml）提取缓冲液（称取29mgEDTA、0.1gL-抗坏血酸，吸取35ul-巯基乙醇，加入到0.1mol/L乙酸钠缓冲液中，定容至100ml，摇溶，低温4保存）4g/L昆布多糖溶液（称取100mg昆布多糖加入到25ml0.1mol/L醋酸缓冲液中，溶解后低温储备备用）3,5-二硝基水杨酸试剂（1、配制500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液，2、配制262ml的2mol/LNaOH溶液 3、称取6.3g的3,5-二硝基水杨酸 4、称取5g结晶酚 5、称取5g亚硫酸钠，最后，将上述2、3、4、5各成分加入到1中，搅拌使之溶解，待冷却后转入到1000ml容量瓶中，并用蒸馏水定容至刻度，贮于棕色瓶中备用，切勿使二氧化碳进入，若溶液浑浊可过滤后使用）1mg/ml葡萄糖标准液（准确称取100mg分析纯葡萄糖预先在80烘干至恒重，用少量蒸馏水溶解后，转移到100ml容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。）提取及测定：1、标准曲线的制作：取7支具塞刻度试管25ml,按下表加入试剂项目 管号 0 1 2 3 4 5 61mg/ml葡萄糖标准液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2蒸馏水/ml 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.83,5-二硝基水杨酸/ml 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5相当于葡萄糖的质量/mg 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2精确加完各种试剂后，将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，在用蒸馏水稀释至25ml，混匀，在540nm处，用0号管做参比调零，测定显色液的吸光度值，以吸光度为纵坐标，葡萄糖质量为横坐标，绘制标准曲线，求得方程。提取及测定：称取10g果蔬样品组织，加入10ml经预冷的提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，转入离心管，在412000g下离心30min。收集上清液，低温保存备用。取两只试管，分别加入100ul4g/L的昆布多糖溶液，然后像一支试管中加入100ul酶液，向另一支试管中加入100ul经煮沸5min的酶液作对照，混匀，将反应管置于37保温反应40min，保温后向各管中加入1.8ml蒸馏水和1.5mlDNS试剂，在沸水浴中加热3min，在用蒸馏水将反应液稀释至25ml，混匀测定混合液在540nm处吸光度值，重复三次。根据样品管反应液和对照管反应液的吸光度值的差值，在标准曲线上查的葡萄糖质量m，以每秒每克样品中酶分解昆布多糖产生1*10-9mol葡萄糖为一个-1,3葡聚糖酶活性单位，单位是1*10-9mol/s*g计算公式：m*样品提取液总体积*106/(测定时所取样品液体积*酶促反应时间*样品质量) 注意：在制备酶液时加入的L-抗坏血酸可作为还原剂保护酶的活性，也可以使用5mmol/L还原型谷胱甘肽保护酶活性。PAL：试剂：0.1mol/LPH8.8硼酸硼砂缓冲液（母液配制方法见附录，取66.67ml母液A和33.33ml母液B，混匀，调节PH至8.8，稀释至200ml）50mmol/LPH8.8硼酸硼砂缓冲液 提取缓冲液（取4gPVP、58mgEDTA、35ul-巯基乙醇加入到0.1mol/L硼酸缓冲液中溶解定容至100ml，低温4保存备用）20mmol/L L-苯丙氨酸溶液（称取330mgL-苯丙氨酸，用50mmol/L硼酸缓冲液溶解定容至100ml）6mol/L盐酸溶液（取10ml浓盐酸，稀释到20ml）提取及测定：称取5克果蔬样品，加入5ml提取缓冲液，冰浴研磨成匀浆，转入离心管，于412000*g下离心30min，收集上清液，低温保存备用。取两只试管，都分别加入3ml50mmol/L硼酸缓冲液，0.5ml20mmol/LL-苯丙氨酸溶液。向一支试管中加入0.5ml酶提取液，向另一支试管中加入0.5ml经煮沸5min的失活酶作为对照。然后将两只管置于37保温60min，保温结束时，立即向两支试管中分别加入0.1ml6mol/L盐酸溶液以终止反应。以蒸馏水为参比调零，分别测定样品反应管和对照反应管中溶液在波长290nm处的吸光度值，重复三次。根据反应液的吸光度值差，计算苯丙氨酸解氨酶活性，以每小时每克果蔬酶促反应体系吸光度增加0.01为一个PAL活性单位（U），表示为0.01OD290/h*gmF计算公式：PAL活性=（样品管反应液吸光度值-对照管反应液吸光度值）*样品提取液总体积/(0.01*测定时所取样品提取液体积*酶促反应时间*样品质量)注意：原装的-巯基乙醇的浓度大约为14.3mmol/L，EDTA的相对分子质量为292.25，L-苯丙氨酸为165.19，浓盐酸为浓度为12mmol/L缓冲液的配制：1、 乙酸-乙酸钠缓冲液（0.1mol/L）：将两种母液混合后，用蒸馏水稀释至200ml。母液A（0.2mol/L乙酸溶液）:量取11.55ml冰醋酸，稀释至1000ml母液B(0.2mol/L乙酸钠溶液)：称取16.4g无水碳酸钠（M=82.04）或称取27.22g三水合乙酸钠（M=136.0