沉默GRP78基因对人卵巢癌SKOV3细胞侵袭力的抑制作用.doc

沉默GRP78基因对人卵巢癌SKOV3细胞侵袭力的抑制作用【摘要】目的 探讨RNA干涉技术(RNAi)沉默葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因对人卵巢癌SKOV3细胞侵袭力的影响，阐明GRP78基因沉默对SKOV3细胞侵袭力抑制作用的生物学机制。方法 设计并构建pSilencerTM3.0H1GRP78 siRNA重组质粒，脂质体介导转染至SKOV3细胞。RTPCR和Western印迹法检测GRP78基因表达;RTPCR检测MMP2、MMP9 mRNA表达;Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭力;Transwell小室迁移实验检测细胞迁移率。结果 RTPCR及Western印迹检测转染GRP78 siRNA重组质粒SKOV3细胞GRP78基因表达抑制;RTPCR结果显示与对照组相比转染GRP78 siRNA重组质粒SKOV3细胞MMP2、MMP9 mRNA表达降低;Transwell小室侵袭实验和迁移实验结果显示转染GRP78 siRNA重组质粒SKOV3细胞穿透细胞数(P0.05)和迁移率均明显降低(P0.05);而与未转染组和转染空质粒组相比，转染pSH1SiGRP78质粒组(17.346.27)明显降低(P0.05);而与未转染组和转染空质粒组相比，转染pSH1SiGRP78质粒组(37.197.15)明显降低(P0.05)。3 讨 论卵巢肿瘤细胞侵袭和转移是影响预后的重要因素，积极寻找有价值的可以抑制侵袭和转移是卵巢癌防治领域研究的热点问题，虽然国内外学者进行了大量的研究，但仍未达到理想效果。GRP78作为重要的内质网分子伴侣，除参与蛋白质的折叠和转运外，在细胞的凋亡、细胞生存、肿瘤的耐药及肿瘤免疫方面有重要作用7,8。大量研究结果表明，GRP78在多种肿瘤组织如神经胶质瘤、肺癌、胃癌、乳腺癌等均呈现高表达。对GRP78在肿瘤中作用的研究主要集中在肿瘤耐药和肿瘤免疫上，而针对GRP78在肿瘤细胞侵袭和转移方面的研究较少，该方面研究正逐步引起广大学者的关注。RNA干涉(RNAi)是存在于真核生物体内的一种自我保护现象，具备抵抗外界导入或病毒基因mRNA侵害及降解自身异常基因的作用9。苏荣健等10通过RNAi技术特异下调肝癌细胞株GRP78的表达，发现抑制GRP78表达可抑制肝癌细胞体外侵袭和迁移的能力。Chiu等11研究发现GRP78在头颈部肿瘤中呈高表达，通过RNAi技术下调GRP78的表达可抑制肿瘤细胞的体外侵袭力。本研究采用RNAi技术下调人卵巢癌SKOV3细胞GRP78的基因表达，发现抑制GRP78基因表达的能降低SKOV3细胞侵袭力和迁移力，同时与肿瘤细胞侵袭密切相关的MMP2和MMP9 mRNA的表达均降低，说明GRP78在卵巢癌SKOV3细胞的侵袭迁移中具有重要作用。研究发现机体对肿瘤细胞蛋白水解失去调控是恶性肿瘤细胞具备向周围正常组织细胞侵袭的原因之一12,13。近年来基于对卵巢癌侵袭和转移机制问题进行的研究结果表明细胞外基质降解正是其侵袭和转移的重要途径，而MMPs在降解ECM的同时，还参与了原发肿瘤的形成、血管的形成和诱导肿瘤免疫耐受14。LeroryDudal发现具有高度侵袭力的卵巢癌SKOV3细胞中MMP2高表达，研究证实MMP2在肿瘤细胞降解ECM过程中起到重要作用，同时指出MMP2在促进肿瘤血管发生和生长中具有重要作用15。本研究结果显示，抑制SKOV3细胞GRP78基因表达，可降低MMP2和MMP9 mRNA表达，说明了GRP78影响卵巢癌SKOV3细胞的侵袭力与细胞外基质降解异常有关。综上，本研究中构建的GRP78 siRNA表达质粒能有效抑制SKOV3细胞GRP78的基因表达，抑制GRP78基因表达可降低MMP2和MMP9 mRNA表达，并明显抑制肿瘤细胞体外侵袭迁移能力。GRP78可促进蛋白的折叠与装配，保护细胞免受有害因素侵害，其对肿瘤细胞侵袭和转移作用的机制尚不清楚，仍需进一步探讨中。【参考文献】 1 Hata K，Nakayama K，Fujiwaki R,et al.Expression of the angopoietin1，angopoietin2，Tie2 and vascular endotheial growth factor gene in epithelial ovarian cancerJ.Gynecol Oncol，2004;93(1):21522.2 Lee AS.The glucoseregulated proteins:stress induction and clinical applicationsJ.Trends Biochem Sci，2001;26(8):50410.3 Jamora C，Dennert G，Lee AS,et al.Inhibition of tumor progression by suppression of stress protein GRP78/BiP pinduction in fibrosarcoma B/C 10MEJ.Proc Natl Acad Sci USA，1996;93(15):76904.4 Fu Y，Lee AS.Glucose regulated proteins in cancer progression，drug resistance and immunotherapyJ.Cancer Biol Ther，2006;5(7):7414.5 Zhang J，Jiang Y，Jia Z,et al.Association of elevated GRP78 expression with increased lymph node metastasis and poor prognosis in patients with gastric cancerJ.Clin Exp Metastasis，2006;23(78):401410.6 GonzalezGronow M，Cuchacovich M，Llanos C,et al.Prostate cancer cell proliferation in vitro is modulated by antibodies against glucoseregulated protein78 isolated from patient serumJ.Cancer Res，2006;66(23):1142431.7 Dong D，Ni M，Li J,et al.Critical role of the stress chaperone GRP78/BiP in tumor proliferation，survival，and tumor angiogenesis in transgeneinduced mammary tumor developmentJ.Cancer Res，2008;68(2):498505.8 Yang GH，Li S，Pestka JJ，et al.Downregulation of the endoplasmic reticulum chaperone GRP78/BiP by vomitoxin (Deoxynivalenol)J.Toxicol Appl Phamacol，2000;162(3):20717.9 Miliner J.RNA interference for treating cancers caused by viral infectionJ.Expert Opin Biol Ther，2003;3(3):45967.10 苏荣健，李 贞，程留芳，等.特异性下调葡萄糖调节蛋白78表达对肝细胞癌侵袭和转移能力的影响J.细胞生物学杂志，2007;29(6):88994.11 Chiu CC,Lin CY，Lee LY，et al.Glucoseregulated protein78 regulates multiple malignant phenotypes in head and neck cancer and may serve as a molecular target of therapeutic interventionJ.Mol Cancer Ther，2008;7(9):27882797.12 StallingMann M，Radisky D.Matrix metalloproteinaseinduced malignancy in mammary epithelial cellsJ.Cell Tissues Organs，2007;185(13):10410.13 周洪澜，李路江，王医术，等.MMP9及其抑制因子TIMP1在膀胱癌中的表达及意义J.吉林大学学报(医学版)，2007;33(6):105760.14 Herrera CA，Xu L，Bucana CD,et al.Expression of metastasisrelated genes in human epithelial ovarian tumorsJ.Int J Oncol，2002;20(1):513.15 LeroyDudal J，Demeilliers C，Gallet O,et al.Transmigration of human ovarian adenocarcin