茚虫威亚致X浓度对茚虫威敏感性降低的棉铃虫生物学参数及解毒酶活性的影响.doc

茚虫威亚致X浓度对茚虫威敏感性降低的棉铃虫生物学参数及解毒酶活性的影响 月?():昆虫学报:.:./.基金项目:国家重点研发计划(?)作者简介:王芹芹?女?年月生?河南项城人?博士研究生?研究方向为杀虫剂毒理与害虫抗药性?:.?通讯作者?:.?.:?接受日期:茚虫威亚致死浓度对茚虫威敏感性降低的棉铃虫生物学参数及解毒酶活性的影响王芹芹?崔丽?王奇渊?王立?谢娜?袁会珠?芮昌辉?(.中国农业科学院植物保护研究所?农业部作物有害生物综合治理重点实验室?北京?.山东省泰安市岱岳区生态林业发展中心?山东泰安)摘要:【目的】本研究旨在明确茚虫威亚致死浓度对茚虫威敏感性降低的棉铃虫生物学参数及解毒酶活性的影响?以科学有效防治这一害虫?避免其对茚虫威的抗性快速发展?【方法】采用浸叶法测定了茚虫威对棉铃虫茚虫威抗性汰选种群()及其同源对照种群()龄幼虫的毒力?用两性生命表分析浓度茚虫威对种群当代()生命表参数的影响?并测定了浓度茚虫威处理后和种群棉铃虫龄幼虫体内解毒酶多功能氧化酶()、羧酸酯酶()和谷胱甘肽转移酶()及乙酰胆碱酯酶()的活性?【结果】茚虫威对棉铃虫种群和种群龄幼虫的分别为.和./?茚虫威处理种群后?的生长量、化蛹率、羽化率和成虫畸形率均显著低于未用药对照?而特定年龄生命期望值高于未用药对照?种群棉铃虫龄幼虫体内和活性与种群相比显著升高?活性显著降低?【结论】本研究结果表明棉铃虫种群在浓度茚虫威胁迫下存在明显的生长与繁殖不利性?同时对其也产生了适应能力?浓度茚虫威处理后?棉铃虫种群的和活性被显著诱导?说明这两种酶可能与棉铃虫对茚虫威产生抗药性密切相关?而活性被显著抑制?说明该酶可能参与了茚虫威转化成脱甲氧羰基代谢物()的活化过程?关键词:棉铃虫?茚虫威?生物学参数?亚致死浓度?酶活性?诱导效应:.:()?(:)?(.?.?):【】?.【】期王芹芹等:茚虫威亚致死浓度对茚虫威敏感性降低的棉铃虫生物学参数及解毒酶活性的影响().().()?()?()()().【】./?.?().【】.?.?().:?棉铃虫在田间的发生危害往往世代重叠严重?寄主广泛?且虫龄不整齐?这使得棉铃虫的防治适期和用药量不容易掌握?容易导致多次重复用药?因此田间棉铃虫在长期药剂选择压下对拟除虫菊酯、氨基甲酸酯类和多杀菌素等多种杀虫剂的抗性不断增强(.?.?.?.?)?等()和等()一致认为?尽管转抗虫棉的推广种植对缓解棉铃虫抗药性和防治问题发挥了良好作用?但由于其抗虫性存在时空表达差异及其他棉花害虫的化学防治需求?棉田化学防治仍然是不可或缺的手段之一?在实际生产中?害虫除了直接被杀虫剂杀死外?随着施药后时间的延长?杀虫剂将部分降解至浓度不足以杀死昆虫个体的亚致死浓度(陈羿渠等?)?害虫对杀虫剂产生抗性往往是伴随着杀虫剂对其的选择作用而出现的一种胁迫进化现象?亚致死浓度可引起害虫生态学、生殖力的变化、抗药性的发展、药剂代谢能力变动等一系列亚致死效应(.?.?)?茚虫威作为新颖的噁二嗪类杀虫剂?其杀虫活性高?对环境和作物安全(李富根等?冯青等?沈娟等?)?已在我国使用数十年?据田间抗性监测报道?随着田间推广应用?我国云南中部田间小菜蛾对茚虫威的抗性处于低抗性水平(尹艳琼等?)?陕西杨凌、宝鸡和渭南个地区田间小菜蛾种群对茚虫威尚未产生明显抗性(殷劭鑫等?)?同属于鳞翅目害虫的棉铃虫对茚虫威的抗药性鲜有报道?王芹芹等()报道了邯郸棉铃虫对茚虫威已达.倍?齐浩亮()连续用茚虫威汰选处理棉铃虫代后?对茚虫威的敏感性仅降低倍多?尚没有产生抗药性?相对于其他常规杀虫剂?棉铃虫对茚虫威的抗性发展比较缓慢?且茚虫威与氰氟虫腙()、高效氯氟氰菊酯()、毒死蜱()、乙基多杀菌素()、氯虫苯甲酰胺()、氟虫脲()、溴虫腈()、甲氧虫酰肼()未表现出交互抗性(齐浩亮?)?在害虫抗性治理上有可能成为比较理想的替代药剂品种?结合我们在田间开展的棉铃虫对茚虫威的抗性监测结果表明?茚虫威推广使用多年的棉铃虫田间种群?总体上尚处于低抗或敏感性降低状况(未发表数据)?因此?茚虫威有利于作为替代昆虫学报卷药剂进行推广使用?为了更透切地了解棉铃虫对茚虫威抗性发展中有可能存在的生物学特性上的变化?不同于以往研究报道多是利用已存在比较严重的抗药性害虫开展生物学参数的考察?本研究选择仅表现为敏感性降低的棉铃虫茚虫威抗性汰选种群(即种群)及其同源对照种群(即种群)?在亚致死浓度茚虫威选择压下进行亚致死效应研究?阐明害虫对杀虫剂抗性发展初期相关的生物学因素和主要解毒酶的作用?为延缓其抗药性的发展、制定合理的用药策略、延长茚虫威的使用寿命提供科学依据?材料与方法.试验材料.供试虫源:同源对照种群()为年采自河北省邯郸市并在本实验室长期用人工饲料饲养的未接触杀虫剂的种群?茚虫威抗性汰选种群()由同源对照种群经过茚虫威代次选育(齐浩亮?)?再经室内饲养至今?棉铃虫饲养及实验条件:温度?相对湿度?光周期?棉铃虫室内饲养技术参照范贤林等的方法(范贤林等?)?有所改进?具体饲养方法:将带卵纱布放入保鲜袋中度过卵期?将初孵幼虫挑入紫外灭菌的白色透明小酱杯中?一次性放入人工饲料?饲养至化蛹?将蛹挑入培养皿中集中度过蛹期?将带蛹培养皿放入成虫笼中?让其羽化后的成虫随时交配产卵?收集纱布?用.次氯酸钠水溶液消毒纱布遍?清水冲洗遍?晾干后将消毒后的带卵纱布放入保鲜袋中待其孵化?.供试药剂和试剂:茚虫威()原药?以色列马克西姆化学公司?考马斯亮蓝?二硫硝基苯甲酸()、醋酸萘酯()、固蓝盐()?公司?十二烷基硫酸钠()?华美生物工程公司?牛血清蛋白()?中国科学院东方仪器设备公司?毒扁豆碱()?东京化成工业株式会社?磷酸、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、甘油?国药集团化学试剂有限公司?碳酸氢钠?天津市江天化工技术有限公司?丙酮、乙醇?北京化工厂?.主要仪器:微型离心机(美国公司)?孔酶标板(美国公司)?光吸收酶标仪(美国公司)?台式恒温振荡器(美国精骐有限公司)?.茚虫威对棉铃虫龄幼虫的毒力测定采用叶片药膜法?分别测定茚虫威对同源对照种群()和茚虫威抗性选育种群()的毒力?茚虫威原药先溶于二甲基甲酰胺()中?配制的母液?然后以.的曲拉通稀释?配制个药剂浓度?将用打孔器打成直径的油菜叶碟在药液中浸渍?取出晾干放入孔盒中?接入大小一致的棉铃虫龄初幼虫?每处理头?次重复?在下后检查死亡虫数?以解剖针轻触虫体?不能正常反应视为死亡?抗性倍数()试验种群/相对敏感种群?棉铃虫抗性水平分级:敏感(.)、低水平抗性(.)、中等水平抗性(.)(崔丽等?)?.亚致死浓度茚虫威处理棉铃虫龄幼虫后的生长量采用浸叶法:挑选生长一致的棉铃虫龄初幼虫?单头称重?并记录体重?用.曲拉通和药剂亚致死浓度处理过的叶片对种群和种群棉铃虫处理后?依次对存活幼虫进行称重?生长量处理后体重处理前体重?.亚致死浓度茚虫威处理棉铃虫龄幼虫后生命表参数的观察选取棉铃虫种群的龄初幼虫若干头分别编号?一组为处理组()?一组为对照组()?称重记录?分别用茚虫威处理过的叶片和无毒叶片饲喂处理组和对照组后?将对应编号的活虫进行称重并记录?用于计算亚致死浓度处理后的生长量?随后立即转移至无毒人工饲料中放入指形管(每管放入头虫?编号对应)?每隔观察每头棉铃虫存活及龄期并记录?待其化蛹单头称重并记录蛹重?重新放入对应的指形管中培养待蛹羽化?记录羽化时间和畸形与否?判断雌雄并记录?用蜂蜜水喂养成虫?每天准确记录成虫生长状况?直至成虫死亡?试虫饲养环境条件:温度?相对湿度?光周期?.亚致死浓度茚虫威处理棉铃虫龄幼虫后的酶活性测定.酶液制备:分别用亚致死浓度茚虫威处理同源对照种群和汰选种群?取存活的棉铃虫龄幼虫头()加入./缓冲液含/?/?/?/和(/)的甘油?.冰浴中整体研磨匀浆?匀浆液/期王芹芹等:茚虫威亚致死浓度对茚虫威敏感性降低的棉铃虫生物学参数及解毒酶活性的影响离心?上清液作为酶源?重复次?酶源作为多功能氧化酶()、谷胱甘肽转移酶()和乙酰胆碱酯酶()活性测定的酶液?将酶源用./的缓冲液(.)稀释倍或倍作为羧酸酯酶()活性测定的酶液?每处理重复次?.多功能氧化酶脱甲基()活性测定:采用昆虫多功能氧化酶()酶联免疫分析试剂盒?购自华佰泰生物科技有限公司(王芹芹等?)?.谷胱甘肽转移酶()活性测定:参考等()和等()的方法?在离心管中依次加入./的缓冲液(含/?.)?./的?./的和.酶液?空白对照中加入./的缓冲液(含/?.)?在下连续测定内值的变化?重复次?.羧酸酯酶()活性测定:参照()的方法?略有改动?每个待测酶液设置个浓度?在离心管中分别加入?.?.和.酶液?以及相应的./的缓冲液(.).?.?.和.?然后在每个离心管中加入./底物(含/的毒扁豆碱)?混匀后置于的摇床上反应?最后加入.显色液(现配现用)?摇匀后静置?用酶标仪测定下的值?重复次?.乙酰胆碱酯酶()活性测定:参考等()的方法?略有改动?每个待测酶液设置个浓度?在离心管中分别加入?.?.和.酶液?对应各浓度酶液分别加入./缓冲液(.).?.?.和?然后在每个离心管中加入.底物(现配现用)?混匀后置于的摇床上震荡反应?最后加入./的毒扁豆碱溶液?在下测定值?重复次?.总蛋白含量测定:采用()的考马斯亮蓝()方法测定总蛋白含量测定?.数据分析采用.软件计算毒力回归方程和致死中浓度?酶活力测定结果以及当代的生物学参数观察数据用进行统计?进行方差分析?制图软件制图?棉铃虫供试种群的各阶段年龄时间、存活、生长等原始数据参照年龄阶段两性生命表理论(.?)进行统计?并用程序计算相关生命表参数(?)如特定年龄阶段存活率()、特定年龄阶段生命期望值()?是指试虫从卵存活到年龄龄期的概率?在本文指龄试虫从处理后活到年龄龄期的概率?是指在年龄龄期的个体可以继续存活的期望值?在本文指龄试虫从处理后在年龄龄期的个体可以继续存活的期望值?生命表统计分析数据参数数据使用制图软件作图?生命表参数的平均值和标准误用技术(?)来估算?计算棉铃虫发育历期种群参数间的差异显著性可以用()程序(?)?酶比活力(/?)/()?其中为酶促反应酶液总体积()?为蛋白质含量(/)?为反应总时间()?生长抑制率(生长量处理生长量)/生长量?结果.棉铃虫选育种群对茚虫威的敏感性利用浸叶法进行毒力测定?确定茚虫威对棉铃虫龄幼虫的致死中浓度()和亚致死浓度?结果显示(表)?对照种群(种群)的值为./?种群的值为./?相应的种群和种群的亚致死浓度分别为.和./?经过代次茚虫威抗性选育并在室内饲养至今的棉铃虫种群(种群)?与同源对照种群相比?值提高了.倍?表现出敏感性显著降低?但尚未达到抗性水平()?.浓度茚虫威处理茚虫威选育种群龄幼虫后代的生物学参数特征浓度茚虫威处理种群棉铃虫龄幼虫后的生物学参数如表所示?总体来看?用处理种群龄幼虫后?其生长量(体重增加量)小于?差异极显著(.)?其化蛹率和羽化率也显著低于?然而值得注意的是其成虫畸形率显著低于(.)?表为浓度茚虫威处理种群的生命表发育历期?其中龄和龄幼虫期显著延长(分别为.和.)?蛹期有一定程度延长?但差异不昆虫学报卷表不同棉铃虫种群龄幼虫对茚虫威的敏感性种群斜率标准误(/)()(/)()抗性倍数.(.).(.).(.).(.).:同源对照种群?:茚虫威抗性汰选种群.图同.:置信区间.抗性倍数是相对种群的比值?.表亚致死浓度茚虫威处理棉铃虫茚虫威抗性汰选种群()龄幼虫后代的生物学参数()生物学参数值生长量(体重增加量)()().蛹重(/头)(/).羽化率().雌虫比例().化蛹率().成虫畸形率().表中数据为平均值标准误?.:未受药剂处理的种群对照组?:茚虫威处理后的种群处理组.表及图同.表亚致死浓度茚虫威处理棉铃虫茚虫威抗性汰选种群()龄幼虫对代发育历期和平均寿命的影响()参数个体数平均值标准误个体数平均值标准误值龄幼虫期().龄幼虫期().龄幼虫期().龄幼虫期().蛹期().成虫期().平均寿命().)?然而种群在处理当代?其平均寿命显著低于种群(.)?图和图分别为两个种群代的特定龄期的存活率和生命期望值?从图可知?试虫在龄幼虫期到蛹期的存活率均低于试虫?表明亚致死浓度茚虫威降低了试虫的存活率?同时在各个体之间复杂的生长发育阶段形成了大量的时间重叠?的试虫存活时间相比试虫个别有所延长?最长可以达?而对照最长为?从图可知?随着年龄的增长?生命期望值会随之降低?的试虫生命期望值略高于的试虫?表明茚虫威药剂再次胁迫下会使得试虫产生一定的耐药性?结合观察的成虫畸形率来看?亚致死浓度茚虫威处理种群后?成虫畸形率显著低于未处理对照组?进一步说明了棉铃虫对茚虫威具有一定的抗性风险?期王芹芹等:茚虫威亚致死浓度对茚虫威敏感性降低的棉铃虫生物学参数及解毒酶活性的影响图浓度茚虫威对棉铃虫茚虫威抗性汰选种群()及其对照种群()龄幼虫特定年龄阶段存活率()的影响.()()():分别为龄幼虫?:蛹?:雌成虫?:雄成虫.图同.图浓度茚虫威对棉铃虫茚虫威抗性汰选种群()及其对照种群()龄幼虫特定年龄阶段生命期望值()的影响.()()()昆虫学报卷.浓度茚虫威对解毒酶及乙酰胆碱酯酶活性的诱导效应如图所示?对茚虫威抗性汰选种群()和同源对照种群()?分别以相应的处理的叶片饲喂种群和种群的棉铃虫?以.的曲拉通水溶液处理的叶片饲喂棉铃虫作为对照?种群在茚虫威处理后?其解毒酶活性均有显著的诱导效应?其中谷胱甘肽转移酶()活性和多功能氧化酶()活性被显著诱导增强?羧酸酯酶()活性被显著抑制?进一步表明棉铃虫对茚虫威的抗性与和活性升高有关?图茚虫威处理对不同种群棉铃虫龄幼虫解毒酶和乙酰胆碱酯酶的比活力的影响.:羧酸酯酶?:乙酰胆碱酯酶?:谷胱甘肽转移酶?:多功能氧化酶.图中数据为平均值标准误?柱上不同小写字母示不同处理间差异显著(.?氏新复极差法)?星号表示种群的处理组和对照组间差异显著(.?检验)?.(.?)?(.?).讨论杀虫剂的亚致死效应作为一种普遍现象广泛存在于农业生态系统中?研究杀虫剂的亚致死效应对于合理使用杀虫剂将具有积极意义?茚虫威这一新型药剂处理不同的鳞翅目害虫如斜纹夜蛾、甜菜夜蛾和棉铃虫后?其抗性增长的快慢?一方面与药剂选择压有关?另一方面与昆虫自身生物学特性有关(王建军等?王伟等?齐浩亮?)?杀虫剂的亚致死效应指亚致死或低致死剂量(或浓度)的杀虫剂处理昆虫后?存活试虫所表现出的神经生理、行为特性、生长发育、繁殖、免疫等方面的变化?一般评价的是药剂处理当代及随后子代的影响?关于杀虫剂亚致死效应的研究长期以来多以室内选育的抗性种群或田间抗性品系与敏感品系作为研究对象?如等()和等()研究表明杀虫剂亚致死浓度处理后对昆虫生长发育、繁殖力及抗性等有相应程度的负面影响?等()使用多杀菌素亚致死浓度连续代诱导小菜蛾?小菜蛾的种群增长受到抑制?其繁殖力、内禀增长率、周限增长率、净增殖率等参数均有一定程度下降?关于杀虫剂抗性适合度的研期王芹芹等:茚虫威亚致死浓度对茚虫威敏感性降低的棉铃虫生物学参数及解毒酶活性的影响究也多以田间抗性和室内筛选抗性为研究对象?抗性适合度比较的是对某药剂已经具备稳定抗性水平的种群与相应敏感种群之间生理或行为等方面的差异?如刘泽文等()研究田间采集的抗吡虫啉褐飞虱发现?该种群与敏感品系相比?相对适合度有明显下降?表现出繁殖不利现象?陈朗杰等()通过对氯虫苯甲酰胺抗性品系与敏感品系的橘小实蝇的种群生物学参数进行比较?发现高抗性品系的繁殖力和世代增长量皆受到了抑制?中抗品系尤为明显?本研究的研究对象种群为茚虫威选择压下连续汰选棉铃虫种群?经过室内代次汰选后的敏感性降低.倍(齐浩亮?)?此后一直在室内饲养至今?经毒力测定发现该种群对茚虫威的敏感性降低?至今仍维持在.倍(表)?表明其对该杀虫剂的敏感性降低并不随着茚虫威选择压的失去而减弱或消失?实验室已发表的研究结果显示?无药剂选择压力下利用两性生命表分析经过茚虫威汰选后的种群抗性适合度的变化?发现种群相比同源对照种群处于竞争劣势?抗性适合度降低?这有可能有利于延缓抗性发展(.?)?但在茚虫威亚致死浓度的作用下?仅对杀虫剂存在敏感性降低的种群是否存在生物学参数变化等亚致死效应?尚无文献报道?研究茚虫威亚致死浓度对茚虫威敏感性降低的棉铃虫是否存在亚致死效应?可进一步阐明棉铃虫种群在抗性发展初期再次受茚虫威药剂胁迫后?其生长发育、生理生化相关的变化特征?为更全面地评价棉铃虫对茚虫威的抗性发展、制定科学用药策略、延长茚虫威的使用寿命提供科学依据?本研究测定和分析了茚虫威亚致死浓度对棉铃虫种群龄幼虫当代()的生物学参数?结果显示用亚致死浓度茚虫威处理后成虫羽化率和化蛹率显著降低?种群存在明显的生长与繁殖不利性(表)?这与等()的结论一致?同时值得注意的是成虫畸形率显著低于?生命期望值略高(表?图)?这表明药剂胁迫下种群已经产生了对低浓度茚虫威药剂的适应能力?对低浓度茚虫威药剂的适应能力这一生物学特性的产生可能与棉铃虫对茚虫威的敏感性降低及其稳定性有关?以相应种群的茚虫威浓度处理同源对照种群和茚虫威汰选种群的龄幼虫?处理后对种解毒酶活性均出现诱导效应?与活性较种群被显著诱导增强?活性则被显著抑制?茚虫威汰选种群的活性的诱导率最高?其次是活性(图)?我们的研究结果印证了文献报道即和的活性变化与棉铃虫的抗药性变化有关(.?.?)?即和的活性增强主导了棉铃虫对茚虫威的抗性?酯酶参与茚虫威的活化已被诸多文献报道(.?王建军和董红刚?刘辉等?.?)?本研究所用的对茚虫威敏感性降低的棉铃虫种群的活性被显著抑制(图)?进一步说明了酯酶可能参与了茚虫威转化成活性更高的脱甲氧羰基代谢物(?)的活化过程?本项研究针对茚虫威对棉铃虫的亚致死效应?首先针对棉铃虫对茚虫威抗性发展相对比较缓慢的特点?以仅存在敏感性显著降低的棉铃虫为研究对象?研究结果表明?种群用茚虫威处理()后的生长量、化蛹率、羽化率及平均寿命均显著低于种群对照组()?值得注意的是?种群()成虫畸形率显著低于?生命期望值相比略高?我们推测该种群已经产生了对低浓度茚虫威药剂的适应能力?因此?在害虫的抗药性治理中需要针对具体