纤维素分解菌的分离

生命科学学院微生物学教研室 YJH 纤维素分解微生物的分离 微生物学教研室杨继红 生命科学学院微生物学教研室 YJH 纤维素分解微生物的分离 纤维素纤维素酶产纤维素酶的微生物纤维素分解微生物的分离 生命科学学院微生物学教研室 YJH 纤维素 cellulose 生命科学学院微生物学教研室 YJH 纤维素与淀粉的比较 生命科学学院微生物学教研室 YJH 纤维素酶 cellulase 纤维素酶 cellulase 是指能水解纤维素 1 4葡萄糖苷键 使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶总称 纤维素酶是由三种酶组成的诱导型复合酶系 包括 葡聚糖内切酶 EC3 2 1 4 也称Cen酶 随机切割纤维素多糖链内部的无定型区 产生不同长度的寡糖和新链的末端 葡聚糖外切酶 EC3 2 1 91 也称Cex酶 作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端 释放葡萄糖或纤维二糖 葡萄糖苷酶 EC2 1 21 也称CB酶或纤维二糖酶 水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖 生命科学学院微生物学教研室 YJH 纤维素水解机制 生命科学学院微生物学教研室 YJH 纤维素水解机制 生命科学学院微生物学教研室 YJH 产纤维素酶的微生物 纤维素酶来源非常广泛 昆虫 微生物 细菌 放线菌 真菌等 都能产生纤维素酶 通过微生物发酵方法是大规模制备纤维素酶的有效途径 不同微生物合成的纤维素酶在组成上有显著的差异 对纤维素的酶解能力也不大相同 放线菌的纤维素酶产量极低 研究很少 细菌的产量也不高 主要是葡聚糖内切酶 且大多数对结晶纤维素没有活性 所产生酶是胞内酶或吸附在菌壁上 很少能分泌到细胞外 增加提取纯化难度 在工业上很少应用 丝状真菌具有产酶诸多优点 产生纤维素酶为胞外酶 便于酶的分离和提取 产酶效率高 且产生纤维素酶的酶系结构较为合理 同时可产生许多半纤维素酶 果胶酶 淀粉酶等 生命科学学院微生物学教研室 YJH 纤维素分解微生物的分离 土壤样品 增菌培养 梯度稀释 筛选培养 挑选菌落 1 2 3 4 5 接种到选择性培养基 增菌培养液 接种到选择性培养基 在筛选培养基上 生命科学学院微生物学教研室 YJH 1 采集土壤样品 采集土壤样品应选择富含纤维素的环境树林中多年落叶形成的腐殖土树林中多年积累的枯枝败叶将富含纤维素的物质埋在土壤中30d左右 再从滤纸上筛选纤维素分解菌 生命科学学院微生物学教研室 YJH 2 土壤样品增菌培养 称取从富含纤维素的环境中采集的土壤样品1g 接种到装有30mL选择培养基中的三角瓶中 在恒温摇床上以200r m30 培养1 2d 直至液体培养基变浑浊 吸取培养液5m转接种到另一装有30mL选择培养基中的三角瓶中 在恒温摇床上以200r m30 培养1 2d 直至液体培养基变浑浊 纤维素粉5gNaNO31gNa2HPO4 7H2O1 2gKH2PO40 9gMgSO4 7H2O0 5gKCl0 5g酵母膏0 5g水解酪素0 5g用蒸馏水定容至1000mL 选择性培养基 生命科学学院微生物学教研室 YJH 3 梯度稀释增菌培养液 取6支无菌1 5mL离心管 分别标记为10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 依次放置在离心管架上 生命科学学院微生物学教研室 YJH 3 梯度稀释增菌培养液 无菌操作在每支无菌1 5mL离心管加入0 9mL无菌生理盐水 生命科学学院微生物学教研室 YJH 3 梯度稀释增菌培养液 无菌操作吸取经过连续二次增菌的培养液0 1mL 加入盛有0 9mL无菌生理盐水标记为10 1的离心管中 用加样器反复吹吸20次 充分混合均匀 得到10 1增菌液 生命科学学院微生物学教研室 YJH 3 梯度稀释增菌培养液 无菌操作吸取10 1增菌液0 1mL 加入盛有0 9mL无菌生理盐水标记为10 2的离心管中 用加样器反复吹吸20次 充分混合均匀 得到10 2增菌液 生命科学学院微生物学教研室 YJH 3 梯度稀释增菌培养液 依次连续稀释得到10 3 10 4 10 5 10 6增菌液 生命科学学院微生物学教研室 YJH 4 筛选培养 霉菌筛选培养基 CMC Na5g酵母膏1gKH2PO40 25g琼脂20g土豆汁100mL刚果红0 1g用蒸馏水定容至1000mL 细菌筛选培养基 CMC Na5gMgSO40 3gK2HPO41gNaH2PO41g蛋白胨1g琼脂20g刚果红0 2g用蒸馏水定容至1000mL 生命科学学院微生物学教研室 YJH 筛选原理 刚果红 Congored 化学名二苯基 4 4 二 偶氮 2 1 氨基萘 4 磺酸钠 刚果红可与多糖 如纤维素 合成红色复合物 却不与纤维素水解后产物发生这步反应 通过向含纤维素的培养基加入刚果红 若存在纤维素分解细菌 则在以这个细菌为中心出现透明圈 即细菌分解了纤维素 使之无法与刚果红合成红色复合物 生命科学学院微生物学教研室 YJH 4 筛选培养 取已经倒好的筛选培养基固体平板18个 每三个一组 分别标记为10 1 10 2 10 3