柱子、流动相注意事项.doc

HPLC使用注意事项及HPLC柱子使用经验之谈HPLC使用注意事项1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。8.堵塞导致压力太大，按预柱混合器中的过滤器管路过滤器单向阀检查并清洗。清洗方法；以异丙醇作溶剂冲洗：放在异丙醇中间用超声波清洗；用10稀硝酸清洗。9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。高效液相色谱常见故障的断定及解决诊状可能的原因解决方法(一)保留时间变化1.柱温变化柱恒温，必要时需配置恒温箱2.等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.缓冲液容量不够用25mmol/L的缓冲液4.柱污染每天冲洗柱5.柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相6.柱快达到寿命采用保护柱(二)保留时间缩短1.流速增加检查泵,重新设定流速2.样品超载降低样品量3.键合相流失流动相PH值保持在37.5检查柱的方向4.流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀5.温度增加柱恒温(三)保留时间延长1.流速下降管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化3.键合相流失同前(二)34.流动相组成变化同前(二)45.温度降低同前(二)5(四)出现肩峰或分*1.样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂3.柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.进样器损坏更换进样器转子(五)鬼峰1.进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.样品中未知物处理样品3.柱未平衡重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)每天新配,用抗氧化剂5.水污染(反相)通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水(六)基线噪声1.气泡(尖锐峰)流动相脱气,加柱后背压2.污染(随机噪声)清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂3.检测器灯连续噪声更换氘灯4.电干扰(偶然噪声)采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)5.检测器中有气泡流动相脱气,加柱后背压(七)峰拖尾1.柱超载降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相2.峰干扰清洁样品,调整流动相3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品4.同前(四)4同前(四)45.同前(四)35.同前(四)36.死体积或柱外体积过大连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管7.柱效下降用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱(八)峰展宽1.进样体积过大同(四)12.在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低扩散3.数据系统采样速率太慢设定速率应是每峰大于10点4.检测器时间常数过大设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高增加柱温,采用低粘度流动相6.检测池体积过大用小体积池,卸下热交换器7.保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8.柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小9.样品过载进小浓度小体积样品液相色谱柱使用经验谈色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。1、样品的前处理：a、最好使用流动相溶解样品。b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。c、使用0.45祄的过滤膜过滤除去微粒杂质。2、流动相的配制：液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。2、流动相流速的选择：因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1mlmin，对于内径为4.0mm柱，流速0.8mlmin为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。注意：a由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。b对于正相柱推荐使用沸程为30-60的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。c含水流动相最*在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。d流动相要求使用0.45祄滤膜过滤，除去微粒杂质。e使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能HPLC的常用术语第一部分色谱曲线1、romatogram）：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图，或者通色谱图（ch过适当的方法观察到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的分布图。2、（色谱）峰（chromatographicpeak）：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。此主题相关图片如下：此主题相关图片如下：3、峰底（peakbase）：峰的起点与终点之间的连接的直线（图1中的CD）。4、峰高（h，peakheight）：色谱峰最大值点到峰底的距离（图1中的BE）。5、峰宽（W，peakwidth）：在峰两侧拐点（图1中的F，G）处所作切线与峰底相交两点的距离（图1中的KL）。6、半高峰宽（Wh/2，peakwithdathalfheight）：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离（图1中的HJ）。7、峰面积（A，peakarea）：峰与峰底之间的面积（图1中的CHEJDC）。8、拖尾峰（tailingpeak）：后沿较前沿平缓的不对称的峰。9、前伸峰（leadingpeak）：前沿较后沿平缓的不对称的峰。（又叫伸舌峰、前延峰）10、假峰（ghostpeak）：除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并不代表具体某一组分，容易给定性、定量带来误差。（又叫鬼峰）11、畸峰（distrortedpeak）：形状不对称的色谱峰，前伸峰、拖尾峰都属于这类。12、反峰（negativepeak）：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。柱的使用和维护注意事项(推荐)色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。2.应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶饱和，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要5075ml。下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100200祃四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋白质污染。阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、甲醇、水依次冲洗。保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出12mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱（530mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH29范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔45天开机冲洗15分钟。高效液相色谱仪常规分析操作步骤及规程高效液相色谱仪操作步骤：1)过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。2)对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。3)打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。4)进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。5)有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min。6)调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。7)设计走样方法。点击file，选取selectusersandmethods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击newmethod。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。8)进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。9)关机时，先关计算机，再关液相色谱。10)填写登记本，由负责人签字。注意事项：1)流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。2)柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。3)所有过柱子的液体均需严格的过滤。4）压力不能太大，最好不要超过2000psi流动相注意事项高效液相色谱的流动相通常是各种低沸点溶剂和水溶液。它是影响分离的一个非常重要因素。在实际工作中，流动相的选择和优化是确定色谱分析的主要工作。一、 流动相溶剂的选择1.所选用的流动相溶剂要有一定的化学稳定性，不与固定相和样品组分起反应，其纯度和化学特性必须满足色谱过程的稳定性和重复性的要求。2.溶剂应当不干扰检测器的工作，溶剂应与检测器匹配，选择不影响检测器正常工作应选择在测定波长范围内无吸收的流动相。3.在制备分离中, 溶剂应当易于除去, 不干扰对分离组分的回收。4.溶剂的粘度要小，保证合适的柱压降。5.从实用角度考虑，溶剂应当价格低廉，容易购得，使用安全，纯度要高。二、流动相溶剂使用的注意事项1.流动相溶剂应选择HPLC的溶剂或依此为标准的溶剂。流动相使用前用0.45m滤膜过滤、脱气，清除微粒和灰尘。 在送液泵内，为了防止杂物（固体）进入流路，装有吸滤器，但网孔径为10m，比此更小的颗粒仍然可通过，这会导致流路和柱子堵塞和污染。为此，建议常用0.45m滤膜过滤。流动相溶剂须经脱气，如不脱气，在溶剂混合时，或压力温度变化时容易产生大量气泡，会导致泵误动作和输液不畅，检测器产生噪声信号等。2.流动相恢复到室温后使用。流动相温度与室温相差时，流动相在恢复到室温前，基线水平很难稳定，特别是发生漂移，也容易产生气泡等现象。水与有机溶剂混合时，混合液变化大，往往会与室温相差很大，务必注意。3.做HPLC流动相的试剂应用HPLC级的、水应用二次蒸馏水，水相流动相需经常更换，防止长菌变质。使用去离子水、针剂水、纯净水（炊用）并不合适、尤其是做梯度洗脱时，水中的不纯物会成为鬼峰，从而干扰分析结果。4.流动相的pH值过高或过低，流动相使用纯水，使用高浓度磷酸盐缓冲溶液，使用离子对试剂等，均可能造成色谱柱填料被化学破坏，这种对色谱柱固定相及键合相的破坏通常是不可修复的5.用缓冲盐做流动相时，在使用前和使用后都要用水清洗流路，绝对禁止将缓冲溶液留在流路中静置过夜或更长时间。6.若需要使用含盐的流动相，使用前请务必过滤。并且使用该含盐流动相前，色谱柱需先用低比例有机相（有机相含量应不低于10%）的溶液冲洗，以免缓冲盐析出。流动相若为蒸馏水或含盐的缓冲液，建议现用现配，以免流动相因滋生微生物而造成柱填料的污染。7.进行梯度实验时要注意梯度变化过程中流动相的互溶性，避免因流动相不互溶而导致的缓冲盐析出问题。反相系统更换正相系统或正相系统更换反相系统时，用异丙醇置换系统内的储存流动相后在接柱子。8.在更换两种互不相溶的流动相时，中间要用异丙醇溶液清洗过渡。例如：先用甲醇水做流动相，然后在用正己烷做流动相时，一定要先用