高级植物生理学教学大纲(山东农业大学).doc

高级植物生理学教学大纲第一讲 绪论一 植物生理学的定义和研究内容1 生长发育和形态建成2 物质与能量代谢3 信息传递和信号转导二 植物生理学的诞生与发展1 植物生理学的孕育阶段荷兰人海尔蒙的柳枝试验：(90kg土壤；2.27kg柳枝；5年后，柳树重76.7kg，而土壤损失仅几十克)。1771年，光合作用的发现2 植物生理学的诞生与成长阶段从1840年李比希矿质营养学说的建立到19世纪末德国植物生理学家Sachs and Pfeffer的两部植物生理学专著的问世。3 植物生理学发展、分化与壮大阶段A农业化学从植物生理学分化成一门独立学科B生物化学独立成一门学科；对植物生理学的冲击。分子生物学异军突起。 C卡尔文循环，C4途径和CAM；弄清了光合膜上许多功能性色素蛋白的三维立体结构，将结构与功能的研究推向了微观世界。D细胞全能性组织培养，为植物细胞工程和基因工程的大力发展创造了条件。E光周期现象光敏色素，调控几十种生理过程。F关于植物激素的研究，激素测定方法：HPLC和ELISA。J逆境生理：活性氧，逆境蛋白，如上所述，分子生物学的迅速发展对传统的植物生理学提出了严峻的挑战和机遇；权威性的国际植物生理学评论刊物 Anuual Review of Plant Physiology 从1985年起改为 Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，2002年改为Anuual Review of Plant Biology目前，植物整体生理学的研究正借助现代生物化学和分子生物学的成就而以新的面貌出现，如关于物质如何由源端装入和库端卸出的机理；关于源库之间信息交换的机理；关于物质与信息交换的“高速公路”维管束结构与功能的研究，都取得了令人瞩目的成就。mRNA的运输成花素问题的解决等。 三植物生理与农业生产（一） 作物产量形成与高产理论50年代掀起的“绿色革命”，改良品种的主要特点是矮杆或半矮杆，株型紧凑，叶片直立，耐肥性强。将高光效特性与其它优良性状结合在一起，形成新的超高产品种。“光合午休”与产量形成期叶片光合功能的早衰。（二） 环境生理与作物抗逆性渗透调节的研究。根系化学信号在北方土层较深厚的地区，通过抗旱品种和栽培措施的综合运用，已能在不进行灌溉的条件下，使小麦每hm2产量达6t以上。（三） 设施农业中的作物生理学“白色革命”。光照不足；CO2不足；温度波动大；土壤营养状况失衡；连作障害；（四） 植物生理学与育种学相结合作物生理育种广谱适应性水稻新品种，既耐强光，又有一定的耐阴性。胚芽鞘长度耐旱品种；耐土壤脊薄；优良品质；主要的参考文献：1. 植物生理学通讯；植物学通报 2. 植物生理与分子生物学，余叔文主编；植物生物化学与分子生物学，科学出版社3. 国内学术刊物：中国科学；科学通报；植物生理学报；植物学报；作物学报；中国农业科学；园艺学报；林业科学等 4 国外文献（农大图书馆数据库）第二讲 光合作用研究进展一 概述(略讲)二光合作用的气孔限制与非气孔限制1 蒸腾和光合过程中水气与CO2扩散阻力的分析气孔结构；保卫细胞的结构；水气与CO2扩散途径2 扩散阻力与导度的测定原理；与欧姆定律类比3 光合作用的气孔限制与非气孔限制的概念4 气孔限制值的计算5 逆境条件下光合作用的气孔限制与非气孔限制三光合作用机理（一） 叶绿体类囊体膜脂 高等植物类囊体膜脂主要有5种：单半乳糖基甘油二酯（monogalatosydiglyceride, MGDG）,双半乳糖基甘油二酯（digalactosydiglceride, DGDG）, 磷酸酰甘油（phosphatidylglycerol, PG）, 硫代异鼠李糖基甘油二酯（sulphoquinovosyldiglyceride, SQDG）, 磷酸酰胆碱（phosphatidylcholine, PC）。与动物细胞膜及植物其他组织细胞膜相比，类囊体膜脂组成有以下几个特点： 主要由不带电荷的糖脂组成，MGDG和DGDG占膜脂的75。 主要磷脂组分是阴离子脂类PG（约10）。 含有特有的带负电荷的硫脂SQDG，（约10）。补：类囊体膜脂的分子生物学研究进展，特别是PG的功能（二） 光合色素与色素蛋白复合体1 光合电子转递的顺序：QA和QB是两种特殊结合态的质醌，结合QB的蛋白是许多除草剂的结合位点，如DCMU可以阻断QA向QB传递电子。2 光系统II复合体的结构：它包括三部分，近侧天线系统CP43和CP47两个色素蛋白复合体围腰绕PSII。远侧天线系统主要由LHCII捕光复合体。由两个32kD多肽组成的D1D2蛋白，其中包括着原初供体Yz; P680; Pheo; QA; QB;由33，23及17kD三种外周多肽以及与放氧有关的锰簇和CI与钙离子组成的水氧化放氧系统。3 光系统I复合体的结构由P700，电子受体和捕光天线三部分组成。它们都结合在蛋白亚基上。PSIA和PSIB两个大亚基，是由叶绿体基因编码的分子量为83kD和82kD的两多肽。P700，原初电子受体A0，A1及Fx, 都存在此大亚基中。小亚基PSIC也是由叶绿体基因编码的9kD多肽，它是铁硫中心FA和FB的所在部位。三个小亚基PSID，PSIE和PSIF由核基因编码。4 细胞色素b/f复合体是一种多亚基膜蛋白，它由4个多肽，即细胞色素f, 细胞色素b6, Rieske和一个17kD多肽。它们在膜的疏水区，分子结构尚不清楚。磷酸化了的LHCII在横向运动时，会伴随Cytb6/f从基粒到间质类囊体的同步移动，由此参与光能在两个光系统之间的均衡分配。5 ATP酶（三） 叶绿素荧光是光合作用的探针1 叶绿素荧光的发现2 叶绿素荧光的来源及量子产量。激发态的命运：放热，分子间能量传递，荧光与磷光发射3 叶绿素荧光诱导动力学及其测量荧光猝灭使荧光产量从它的最大值（Fm）下降的各种过程：光化学猝灭和非光化学猝灭（能量猝灭，状态猝灭和光抑制猝灭）（四） 光合作用的光抑制与光保护机制1 光抑制现象、衡量指标2 PSII光抑制、PSI光抑制3 叶黄素循环、光呼吸和Mehler反应在光保护中的作用4 D1蛋白与可逆失活叶绿素荧光是光合作用的探针一叶绿素荧光的发现： Brewster(1834)在观察一束太阳光通过月桂叶片的乙醇提取液时，在反射光方向看到的是红色，而不是绿色。 1852年，Stokes认为这是一种光发射现象，命名为荧光（fluorescence）。二叶绿素荧光的来源及其量子产量通常色素分子是处于能量的最低状态基态，吸收一个光量子后，会引起原子结构内电子分布的重新排列。其中一个低能的电子获得能量而成为激发态（图）。激发态的命运：1.色素分子间能量传递光化学反应（光合作用） 2.放热，又称非辐射能量耗散 3发射荧光与磷光 chlb到chla的传递效率几乎达100，故检测不出chlb的荧光。植物体内发射的荧光大部分类自PSII天线色素系统（chla）,而PSI色素系统基本不发射荧光。Chlorophyll-a fluorescence 在理论上，荧光量子产量（f）的定义为： f=F/Ia F-发射荧光量子总数 Ia-吸收光量子总数f的大小取决于各种去激途径的竞争。 若Kf、Kh、Kt、Kq和Kp分别代表荧光、热耗散、激发能传递、荧光猝灭和光化学反应的去激速度常数，则chla荧光量子产量（f）与各种K的关系如下： fKf/Kf+Kh+Kt+Kq+Kp 在以上各种去激途径中，f受Kp的影响最大。 在弱光下，PSII原初电子受体QA处于完全氧化状态（即PSII反应中心开放），这时： KpKf+Kh+Kq+Kt 则所吸收的光量子90以上用于光化学反应，结果得最小的f（约0.6%） 在饱和光下, 当QA完全还原时(即PSII反应中心关闭)，此时 Kp0，其f最大（约3，肉眼难以观测到）。由此可见，体内荧光去激途径仅占总去激途径的一小部分。在溶液中，f可达30。 四叶绿素荧光诱导动力学及其测量 叶绿素荧光诱导现象是1931年由德国Kautsky首先发现的，所以又称Kautsky效应。叶绿素荧光诱导动力学是指，当暗适应的绿色植物材料转到光下时，其体内叶绿素荧光强度会产生有规律的随时间的变化（图）。 非调制式荧光仪： 可把荧光诱导动力学曲线划分为：O点（原点）I（偏转）D（小坑）P（最高峰）S（半稳态）M（次峰）T（终点）这几相（phase）。其中从OP相为快速上升阶段（约12秒），从PS相为荧光慢速下降（猝灭）阶段（45分钟）。荧光猝灭使荧光产量从它的最大值（Fm）下降的各种过程。分为两大类： 光化学猝灭（qP）, 代表被开放的PSII反应中心捕获并转化为化学能的那部分能量。 非光化学猝灭（qN）, 代表各种非光化学去激过程所耗散的能量。叶绿素荧光参数： Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm, PSII最大光化学效率（暗适应后）。0.830 qp=(Fm-Fs)/(Fm-Fo), 光化学猝灭 qN=(Fm-Fm)/(Fm-Fo), 非光化学猝灭 NPQ（Fm-Fm）/Fm=Fm/Fm-1PSII=(FM-Fs)/Fm, PSII光化学效率（作用光下）ETR0.84PSIIPFD/2， 总线性电子传递速率。植物光合作用的光抑制一光抑制的概念光合作用的光抑制（Photoinhibition of photosynthesis）是指植物在强光下光合效率下降的现象。表示光抑制的指标有两种： 量子效率；PSII的光化学效率（Fv/Fm） 两个指标之间有密切的关系，在发生光抑制时量子效率被抑制的程度与PSII光化学效率下降的程度是一致的，两者是很好的直线关系。 量子效率通常用弱光下Pn-PFD曲线的斜率来表示（图）: 在弱光下，Pn与植物所吸收的光量子数为一直线关系，但当PFD超过某一范围之后，曲线向下弯曲，表明光量子有明显的过剩。 1 .在低光强下，光量子尚未出现过剩时具有最高的光合效率，暗反应速率处于最低的运转状态，但并非限制因素。 2在光合速率达最大值时，光合效率降至最低值，暗反应速率成为限制因素，光能处于最大的过剩状态。当出现光抑制现象时，量子效率降低，即Pn-PFD初始斜率（直线斜率）减小，但最大光合速率仍可达到对照水平（图）。 光抑制的另一个特征是PSII光化学效率的降低，可以用Fv/Fm表示，易于测定。Fv/Fm表示PSII进行光化学电子传递的效率。光抑制与光破坏不同，发生光破坏时，特别是严重的光破坏，常出现光漂白（Bleaching）。叶绿素或类胡萝卜素遭破坏光氧化现象。强光结合其他逆境条件下易于发生。二光抑制的普遍性 光强的日变化，年变化和冠层中光强的瞬时变化都不同程度地引起光抑制。1 水生浮游藻类及底栖植物长期适应弱光，略高于其生长环境的光强即导致光抑制和光合功能的降低。2 喜阴陆生植物，如热带雨林中生长的蕨类植物从低光强转至高光强下几分钟，其光饱和的光合速率，量子效率即下降。3 林下晃动着的光斑，可导致林下阴生植物的光抑制4 在低光强下生长的阳生植物，若遇到突然的强光，也会产生光抑制。5 作物“午睡”过程中的光抑制。6 逆境条件下光抑制，如干旱，高温，低温等。三光抑制与光破坏的机理 从光抑制到光破坏或光氧化，是过剩光能对植物光合机构的不利影响循序出现的一系列过程。一般来说，光抑制不一定导致光破坏，往往是光合功能的下调（dong-regulation）；只有严重的光抑制才会引起光合机构破坏，D1蛋白的降解是PSII失活的主要原因。1 PSII反应中心光破坏一般认为光抑制主要发生在PSII反应中心，可分别由PSII供体侧和受体侧诱导发生。A 受体侧导致的光抑制：如果P680被强光激发，形成离子对P680+pheo-, pheo-来不及把电子传递给QA（PSII受体侧电子传递受阻），这时，P680+pheo-离子对发生电荷重组，产生一部分3P680（三线态P680），并与O2反应生成1O2。高度活泼的单线态氧可依次攻击位于D2蛋白的pheo-和P680本身，使PSII反应中心失去电荷分离能力，最终引起D1蛋白（QB）蛋白分解。B 供体侧导致的光抑制：水光解受阻时，Z不能将电子传给P680，增加了P680的寿命。由于P680具强氧化性可氧化胡萝卜素。此外，P680还可氧化D1蛋白肽链中的组氨酸残基和叶绿素等。C D1蛋白的周转：不少实验表明，PSII反应中心破坏伴随着D1蛋白的降解。D1蛋白对强光很敏感，在体内周转十分迅速，半衰期约10分钟。D1蛋白的降解受光调控，但分子机理仍不清楚。涉及到蛋白质磷酸化和去磷酸化等。氯霉素蛋白质合成抑制剂，可加剧光抑制。D 有氧和无氧条件下的光抑制： 无氧条件下，光抑制部位比较专一，仅在PSII反应中心或D1蛋白上。 有氧条件下，不专一，严重时类囊体多肽普遍降解，有许多反应和破坏可能是次生的。2 PSI光抑制特点 多年来人们一直认为，在完整叶片内光系统II（PSII）是发生光抑制、光氧化的主要部位，而光系统I（PSI）则相当稳定。光合作用的光抑制几乎变成了“PSII光抑制”的同义词。因为，有关完整叶片内光系统I光抑制的报道很少。但是，近年来的研究表明，在低温弱光条件下，冷敏感植物完整叶片也易发生光抑制，光抑制的主要部位是PSI。PSI的光氧化破坏对光照状况的依赖程度与PSII有明显的区别。一般而言，光照愈强，PSII的光抑制和光破坏愈严重；而PSI的低温光抑制则在较弱的光照条件下更明显，推测其光抑制的机理应与PSII有所不同。当PSI发生光抑制时，位于PSII与PSI之间的电子传递体处于高度还原状态从而加剧PSII光抑制。此外与失活的PSII反应中心能在较短时间内恢复不同，失活的PSI往往需要几天才能恢复功能。因此，从植物生理学的角度看，PSI光抑制对植物的危害似乎比PSII光抑制更大。 PSI反应中心色素P700存在于由PsaA和PsaB基因编码蛋白组成的二聚体上。人们推测，低温可能首先使PSI反应中心复合体的外周保护性蛋白与反应中心复合物分离。同时，低温导致冷敏感植物CO2同化能力下降，光下还原力不能被及时利用，O2 在PSI的受体侧被还原为O2- 。因为温度依赖性的保护机制在低温下丧失，O2-及其它活性氧积累并攻击电子受体Fe-S中心FA/FB和Fx，P700和次级电子受体A1也可能发生光破坏。失活的电子受体启动PsaB基因编码蛋白降解，PSI功能丧失。PSI功能的恢复需要外周蛋白的重新合成及其与PSI反应中心复合物的重组。在分离的类囊体膜上，PSI与PSII一样，即使在非冷害温度条件下也易于发生光抑制。由此看来，完整叶片PSI在非冷害温度条件下的相对稳定不是PSI复合体的本来特征，而是有赖于光破坏防御机制的存在，它在分离类囊体膜时失去了。依赖活性氧清除酶系的水水循环可能在完整叶片内对于防御光破坏具重要的作用，所谓水水循环是指叶绿体内由H2O光解产生的电子经由PSI将O2还原为O-2（即Mehler反应），并进一步在超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、谷胱甘肽还原酶（GR）等的参与下再将O-2还原为H2O的过程，但是该循环在低温下维持电子传递的能力如何尚不清楚。此外，围绕PSI的电子传递在耗散过剩光能和维持跨膜pH梯度，使PSII功能下调从而保护PSI的假说值得进一研究。所以，冷敏感植物的抗冷性可能在很大程度上取决于防御机制在低温条件下能否继续发挥作用。四光破坏的防御机制（一） 减少光能的吸收：叶片变小、变厚，被毛，蜡质层等。叶片、叶绿体的运动，天线的减少，CO2同化能力的提高。（二） 过剩光能的耗散：光能被捕获后主要有三条相互竞争的出路：光化学电子传递、叶绿素荧光发射和热耗散。叶绿素荧光只消耗很少一部分光能；光化学途径产生的化学能通过碳同化、光呼吸、Mehler反应和N素还原来消耗；光能过剩时，热耗散就称为耗散过剩光能的主要途径。1 状态转换与光能分配：通常当吸收的光能在两个光系统之间的分配处于平衡时，光能转换效率最高。远红光（700nm）下，PSI吸收的光能大于PSII，可诱导激发能向PSII的分配比例增加，称为“状态I”；红光（650nm）下，PSII吸收的光能多于PSI，激发能向PSI分配的比例增加，称为“状态II”。这就是状态转换，与PSII复合体蛋白可逆的磷酸化有关。2 PSII反应中心功能的下调：光合机构内约2030的PSII反应中心呈非活性状态，主要特征是QA氧化速率极低（Fo升高），几乎不能进行QA至QB的电子传递，称为失活的反应中心。这类失活的反应中心仍能进行电荷分离，但已失去放氧功能，主要进行热耗散以保护有活性的反应中心。3 依赖叶黄素循环的非发射能量耗散早在50年代，Saporhnikov等发现了叶黄素循环，直到1987年，Demmig和他的同事们提出此循环具有光保护功能后，才成为人们研究的热门课题。所谓的叶黄素循环是指光能过剩时，双环氧的紫黄质（Violaxanthin,简称V）在紫黄质脱环氧化酶（VDE）的催化下，经过中间物单环氧的玉米黄质（Antheraxanthin,简称A）转化为无环氧的玉米黄质（Zeaxanthin,简称Z）；在暗处，则反应在环氧化酶的作用下朝相反的方向进行，形成一个循环。(1)直接作用：Z或A直接猝灭叶绿素的单线激发态(2)间接作用：类囊体膜的流动性随着玉米黄质的增加而增加，通过膜的固化使PSII复合体稳定，有利于叶绿素分子与玉米黄质分子靠近聚集；Z或促进LHCII构象改变，这二者都有利于热耗散。 VDE：分子量约为40kD,可被DTT（二硫苏糖醇）抑制，由此可断定该酶含二硫键。已有45的cDNA克隆。 受温度的影响，在5时，Z的形成被抑制，如果此时进行强光处理，则引起严重的光抑制。Z的形成与低温下植物的冷敏感性有关。 玉米黄质环氧化酶的分离工作至今尚未见报道。4 光呼吸5 Mehler反应与水水循环第三讲 植物激素及其分析技术 植物激素的特点：产生于植物体的特定部位，是植物在正常发育过程中或特殊环境影响下的微量代谢产物；不是植物的营养物质，在很低的浓度下即可对植物的生长发育产生显著的调控作用。五大类：IAA，GA，CTK，ABA，Eth其它“植物激素”：油菜素甾体类，多胺类化合物，茉莉酸类化合物一植物激素研究的某些进展1 研究方法上的突破 过去研究激素的生理作用及其作用机理，多采用外源施加或内源水平的检测，有很大的局限性，会受到吸收、运转和内外因素的干扰。此外，对于激素引起的生理效应来说，仅仅在有激素受体分布的细胞内的激素浓度才有效。近10年来，由于分子生物学和遗传学手段的运用，有较大发展：A 通过在自然界筛选或化学诱变的方法，得到了适合不同研究目的的突变体和营养缺陷型。B 通过基因工程的方法，成功地从农杆菌和假单孢菌中克隆出IAA和CTK的代谢基因，获得了转基因植物，使人们有可能改变植物体内IAA和CTK的浓度和分布，重新检测各种生理现象。C 在激素受体、激素感应和信号传导方面；在激素对基因的调控、激素确切的生理作用等方面都取得了重要进展。原有的五大类激素的种类在增多，例如IAA有4种，GA有108种，CTK有20多种，BR，PA，茉莉酸，寡糖素，水杨酸 膨压素，系统素等。2激素生物合成的新进展 现在已知IAA的生物合成不一定要经过色氨酸，应用拟南芥营养缺陷型的实验表明：IAA可由吲哚直接转化而来，色氨酸途径和非色氨酸途径并存。 同样，应用豌豆和玉米的单基因突变体为材料，现已查明在108种GA中，许多都是相互转化而来，只有几种才控制生长发育的关键，如GA1，GA3，GA4，GA7等。 类胡萝卜素是ABA的前体。3激素受体的研究 过去曾错误地认为，激素本身可以直接作用于DNA，使基因活化，从而引起生理反应。实际上，激素首先必须与其受体相结合，引起受体蛋白的激活，激活了的受体将引起某些特定的反应，如离子的吸收或释放，特定蛋白的磷酸化和去磷酸化（激素的信号转导），最终导致特定基因的表达。 IAA的受体蛋白的研究较快，已分离出数种，其中有三种位于质膜上。4激素对基因表达的调控5转基因植物二植物激素的免疫测定技术（一） 植物激素的测定方法1 生物鉴定法：确定某种物质是否是植物生长物质，最终仍然需要生物鉴定法。结合利用植物突变体，生物鉴定仍然有一定灵敏度。2 物理化学方法（HPLC，气质联用）等。往往存在以下缺点：A 经过繁琐的提取与纯化步骤之后，激素的损失颇大。B 灵敏度低，尤其是用于CTK和种类繁多的GA类。C 不能用于准确的定位分析。D 需要使用昂贵的分析仪器和耗费大量的有机溶剂。3 免疫检测技术具有如下优点：A 灵敏度高，所需样品量极少。B 专一性高，例如用两种不同的ABA抗体可分别对游离态及结合态ABA进行测定，还制成免疫亲和层析柱纯化样品中的ABA。C 可对激素进行组织化学定位。D 能从初步纯化的提取液中同时测定多种激素。E 耗时短，易于对大批量样品进行同步测定。F 能有效测定激素载体、受体蛋白和有关酶的活性。(三) 抗体抗原反应的概述 抗体和抗原之间高度专一的匹配与结合是其反应的最根本的特性。 抗原的概念：凡能刺激哺乳类、鸟类、两栖类和鱼类等动物产生抗体，并能与这些抗体进行专一性结合的物质，称为抗原（antigen）或完全抗原。它必须具备两种性质：免疫原性与反应原性1 免疫原性表示引起免疫响应的能力，可用特异免疫球蛋白的形成或致敏淋巴细胞的产生来衡量。2 反应原性表示被特异球蛋白识别从而被结合的能力。 有些物质，例如ABA、GA，其分子量都低于500，将这些激素分子单独注入哺乳动物体内，通常不会引起免疫反应，即缺乏免疫原性。然而，它们能与相应的抗体结合，具反应原性。因此，称为半抗原。 如果将这些半抗原分子先与某种蛋白质分子偶联，然后再注入动物体内，就可以引起免疫响应，形成能与这种半抗原分子专一结合的抗体。 抗体的概念：抗体（antibody）是在抗原诱导下，由哺乳动物等免疫体系产生的，主要存在于血清中，是球蛋白。以Ig表示抗体。 免疫球蛋白（Ig）的基本结构如图： 由四条多肽链构成，即两条相同的重链（H）和两条相同的轻链（L）。（四） 抗植物激素抗体的制备1载体蛋白：牛血清蛋白（BSA）是最常用的，分子量约为70000，具有大量的反应基团，如氨基、羧基等；人血清蛋白（HAS）等。2植物激素分子的偶联部位：四大类激素的分子都有两个或两个以上的基团，可供直接地或通过一个化学“桥”再与BSA偶联成免疫原。3 免疫原的设计要点：首先，要根据检测的需要，选用合适的半抗原免疫决定簇。偶联部位要远离这个决定簇。4 免疫检测常用的示踪物：抗体与抗原之间的专一结合是免疫检测的基础，它决定着反应的特异性，但不能决定检测的灵敏性。现今，一般常用放射性元素3H、辣根过氧化酶（HRP）、碱性磷酸酶（AKP）等标记植物激素。辣根过氧化酶：辣根是制作此酶的主要原料，从50kg肉质根约可提取200mg HRP。它是一种复合酶，由无色的主酶深棕色的辅基组成。HRP能使过氧化氢中的氧释放出来，与底物（供氢体）中的氢结合成水，同时使无色的供氢体氧化成有色的产物。邻苯二胺可作为底物。（五）RIA与竞争性ELISA的原理RIARadioimmunoassay, 放射免疫检测法ELISAEnzyme linked immunosorbent assay, 酶联免疫吸附检测法, RIA与ELISA不仅利用了免疫学上抗体与抗原之间反应的高度特异性，而且还利用了标记抗原（Ag*）与非标记抗原（Ag）对抗体（Ab）发生竞争性抑制反应时可检测的高度灵敏性。当Ag*和Ab的量保持恒定，并且Ag*与Ag之和大于Ab的结合容量，则Ag*-Ab复合物的形成受Ag含量所抑制。如果样品中的Ag含量高，则Ag-Ab复合物的形成会增加，Ag*-Ab复合物的形成必定相应减少，反之亦然。附页植物激素突变体1 发现与鉴别：1956年发现玉米中天然存在的矮化的GA突变体。直到1973年从番茄中发现易于萎焉的ABA突变体，从开始利用突变体。 人工诱变方法：化学诱变、电离辐射、插入突变。筛选方法是突变体筛选成败的关键，最好的例子是正选择法，即在一定的培养条件下，只有所期望的突变体能够成活。 插入突变是利用分子生物学的方法将一段已知序列的DNA插入基因组，而产生的突变体。有两种方法：转座子插入法和农杆菌中的TDNA插入法。2突变体的分类A 合成型突变体影响内源激素的水平。常见的合成型突变体是激素的生物合成途径被阻断，也有过量产生某种激素的合成型突变体。B 应答型突变体影响激素的应答。干旱胁迫下植物根与地上部间的信息传递早期的观点：干旱对生长和发育的影响只是水分亏缺对植物的直接损伤效应。现在的观点：在水分亏缺造成植物的各种损伤现象出现之前，植物就对干旱做出适应性的调节反应，以使植物本身做出最优化的选择。植物根与地上部间通讯的信号：水信号、化学信号和电信号1水信号：是指由于土壤水分含量的下降引起叶片水分状况的变化， 进而影响到植物的生理功能。2化学信号：是指能够感知和传递土壤干旱信息到地上部反应部位， 进而影响植物生长发育进程的某种激素或除水以外的某 些化学物质。 Blackman和Davies把一株玉米的根分成两部分并分别栽植在两个容器中，其中半边根系所在的土壤保持良好的灌水，而另半边根系所在的土壤则停止浇水而使其逐渐变干。这样处理对植株叶片的水分状况没有明显的影响，但气孔导性却明显下降。 Passioura和同事用根系加压的方法打破土壤干旱和叶片水分供应下降之间的联系。加压植株在干旱时尽管叶片水分状况没有变化，但气孔导性仍然下降。 切除干旱土壤中的半边根时与重新浇水的结果一样。可能的解释：干旱土壤中的根系产生的某种化学信号阻止了叶片的伸展和气孔导度。因此，除去这部分根，也就除去了这部分根系产生的化学信号。确认根源逆境化学信号，应满足下列条件：（1） 信号强度（浓度）的变化是对根系周围土壤环境变化作出的即时响应，并且能定量反映土壤环境的变化。（2） 信号物质浓度的变化能在数量和时间上解释由其引发的地上部生理过程的变化。（3） 地上部生理过程的改变只对信号物质的浓度而不是通量（浓度与蒸腾流速的乘积）的响应。（4） 地上部叶片具有快速代谢该物质的能力。二根系产生的ABA可能是根源逆境信号物质1 ABA的来源：根源，叶源，保卫细胞自身合成。2 ABA的作用机理：快速响应过程：数分钟至数十分钟，如气孔运动对ABA的响应。基本轮廓：ABAGC质膜上的受体信号转导GC内部信息即转变成第二信使激活多种离子通道和酶类GC释放质子质膜超极化增加膜的负电位抑制K内向通道气孔关闭。慢速响应：与生理过程改变有关的基因表达。第四讲 细胞信号转导1.胞外刺激信号传递；2. 跨膜信号转换; 3. 胞内信号转导第五讲 植物发育与衰老生理(省略)1花器官发育的分子机制及其调控（ABC模型）；2光敏色素及其分子生物学；3植物次生代谢与天然物质;4植物的活性氧代谢及其分子生物学。第六讲 环境生理一 渗透胁迫与渗透调节（一） 渗透调节 是指细胞渗透势变化所表现出的调节作用。 Osmoregulation or Turgor regulation 意为通过细胞增加或减少溶质调节细胞渗透势以期与细胞外渗透势平衡。如微生物。 Osmotic adjustment 指高等植物对水分亏缺反应时溶质的积累。（二） 渗透调节能力的判断1 以水势为横坐标，膨压为纵坐标作图，其相关直线斜率越小，渗透调节能力越大。2 以渗透势s为纵坐标，以RWC的对数为横坐标作图，其相关的直线是否有折点，或折点所示的渗透势表示有无渗透调节能力或能力的大小。3 s= 0s100-s100, 即对照的饱和渗透势减去处理的饱和渗透势。（三） 相容性物质（渗透调节物质）1 外界环境进入植物细胞的无机离子，K，Cl-,NO-32 细胞内合成的有机溶质：脯氨酸（proline）,甜菜碱，可溶性糖A 分子量小，易溶于水。B 在生理pH范围内不带净电荷。C 必须能为细胞膜所保持。D 引起酶变化的作用最小。E 生产迅速。渗调蛋白：无论是干旱还是盐渍都能诱导出一些逆境蛋白。如osmotin,可能作为蛋白质的分子拌侣。 甜菜碱 ：是一类季铵化合物，化学名称为N甲基代氨基酸。植物中的甜菜碱主要有12种，研究最多的是甘氨酸甜菜碱（glycinebetaine），简称甜菜碱（betaine）。生物合成：甜菜碱是以胆碱为底物经两部酶催化生成，即： 胆碱（1）甜菜碱醛（2）甜菜碱催化上述途径反应（2）的甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase, BADH）。甜菜碱合成酶的分子生物学 甜菜碱合成由核基因控制。叶绿体的BADH由具有两个等位基因的单链核基因编码。已经有转基因植物。甜菜碱的生理功能：11 参与细胞渗透调节作用 溶质区域化理论 甜菜碱只有区域化地分布在占有细胞体积很小的细胞质中，在渗透胁迫条件下，其积累的浓度才有可能起主要的渗透调节作用。12 参与稳定生物大分子的结构与功能 （1）甜菜碱对光合放氧即PSII外周多肽的稳定起作用。（2）对有氧呼吸和能量代谢也有良好的保护作用。13 影响离子在细胞内的分布：可能调节膜载体蛋白或通道活性14 其它相容性物质的特殊功能：参与羟自由基的清除；相容性物质的作用机制两种主要假说1 表面结合假说：其主要思想是，相容性物质与蛋白质表面特别是疏水表面结合，提高蛋白质表面水化程度。Schobert认为，蛋白质表面的疏水区域是非常脆弱或敏感的部分，因为结合在这里的水分子结合能力非常弱，细胞在水分胁迫环境中将首先脱去这部分水。相容性物质与蛋白质疏水区域结合后，将其转化为亲水表面。2 溶质排除假说：这一假说认为，在蛋白质溶液中，相容性物质将首先溶解在大量的自由水中（从而提高蛋白质分子表面的水化程度），而不是溶在蛋白质或其它生物大分子表面的结合水中，不参与与生物大分子的直接作用。(四)水孔蛋白1 水孔蛋白的发现和概念 人们很早就注意到动植物的一些细胞、组织具有独特的水分转运能力。如种子萌发时的吸水膨胀、花粉管伸长等。 把一系列Mr为2500030000，选择性地高效转运水分子的膜水通道蛋白称为水孔蛋白（aquaporins, AQPs）。水孔蛋白是被称为MIP（major intrinsic protein）的通道蛋白家族中的一个类群。2 水孔蛋白的种类与结构种类：Johson等于1990年首次在植物液胞膜上发现一种Mr为27000的高丰度蛋白，被称之为液胞膜内在蛋白（tonoplast intrinsic protein, TIP）。不久，又从细胞质膜上发现了于TIP同源的膜内在蛋白（plasma membrane intrisic proteion, PIP）。结构： “水漏”模型 “水漏”模型在保持水孔蛋白两个重复单元对称性的前提下，依据B和E环都为典型的疏水结构，使两环分别从膜两侧埋入膜内。通过分子折叠，B和E环形成一狭窄的孔道。3 水孔蛋白功能的调节（1） 蛋白水平的调节：快速调节水孔蛋白转运的一个重要方式是水孔蛋白的磷酸化。可被蛋白激酶磷酸化。（2） 基因水平的调节由于TIP基因的特殊表达方式而产生不同的同工型，以适应不同类型细胞液胞的特殊生理环境，植物在特定的生理条件下，特别是水分胁迫时，为了增加整株水平的水导度，植物有可能合成新的水孔蛋白，尤其增加定位于质膜上的水孔蛋白的合成。4 水孔蛋白的生理意义（1） 参与种子萌发（2） 参与植物的渗透调节（3） 参与维管束水分运输：水分进出导管（4） 水分共质体运输的理论依据二 植物对温度逆境的适应 温度逆境是造成植物地域分布的主要限制因子。农学家们力求找到植物温度抗逆性的生理指标和分子标记，用于农作物品种的抗逆性选育。（一） 生物膜系统对温度逆境的适应 人们用生物膜功能发生突变的温度作为逆境高温或低温的标志。1 膜质相变：植物对逆境的适应在于减轻或避免膜质相变的发生。主要依据有：（1） 冷敏感植物的线粒体氧化酶活化能的折点温度于冷害温度一致。（2） 冷敏感植物比抗冷植物有较多的饱和脂肪酸。（3） 不饱和脂肪酸组成的少量差别能带来化学品脂肪酸混合物相变温度的较大变化。（不饱和指数不饱和键，不饱和脂肪酸的比例）。2 膜质不饱和化维持膜的流动性 在进行植物脂肪酸不饱和基因工程之前，必须了解与脂肪酸生物合成，与脂肪酸不饱和化有关的生化途径及其酶类。3 自由基与活性氧的清除（二） 植物温度诱导蛋白：有100多种低温诱导蛋白1 抗冻蛋白：从生活在两极冰水中的鱼类血液中发现的抗冻蛋白，是一种能降低细胞间隙体液冰点的糖蛋白（糖多肽）。2 热激蛋白（heat shock protein）是一类在机体受到高温逆境刺激后大量表达的蛋白。其中有很大一部分属于监护蛋白（chaperone）。HSP90（CPn90）。 监护蛋白是一类辅助蛋白分子，主要参与生物体内新生肽的运输、折叠、组装、定位以及变性蛋白的复性和降解。通过控制底物的结合与释放来协助目标蛋白的折叠与组装，向亚细胞器的运输，或结合并稳定目标蛋白质的不稳定构型。但监护蛋白本身不参与到目标蛋白的重终结构中。A CPn60与CPn70的作用呈现接力性：新生肽一旦从核糖体上露出几个氨基酸残基的片段，CPn70就马上与之结合，防止其发生聚集，形成二级结构CPn60三级结构。B 有机体在受到热激伤害，体内变性蛋白急剧增加，CPn60和CPn70可与变性蛋白结合，维持它们的可溶状态，在有Mg+和ATP的存在下使解折叠的蛋白质重新折叠成有活性的构象，或者降解。3 胚胎发育晚期丰富蛋白（late embryogenesis abundant protein, Lea） 在已发现的植物低温诱导蛋白中，Lea占据多数。这是一种在植物胚胎发育晚期种子脱水时丰富表达的蛋白质。它们多数是高度亲水的，并且在沸水稳定的可溶性蛋白。 脱水是细胞在胞为结冰时必须忍受的次生胁迫，这类蛋白在低温诱导下的出现有助于提高植物在冰冻时忍受胁迫的能力。多数也为干旱或外源ABA所诱导。三 盐害及其机理（一）盐胁迫对植物的伤害1盐胁迫对植物形态发育的整体影响盐分抑制植物组织和器官的生长，加速发育进程，缩短营养生长期和开花期，减少禾本科植物的分蘖数和籽粒数等。长时间处于盐胁迫下，植物的叶面积缩小。生长受抑制，光合下降，能耗增加，加速衰老，植物最终因饥饿和缺水而死亡。2. 从细胞水平上看，盐胁迫对植物 的伤害主要由于两个方面：渗透伤害和盐离子毒害渗透伤害：土壤中盐分降低植物吸水能力，植物生长减慢。盐离子毒害： 盐分随蒸腾流进入叶肉细胞，对细胞造成伤害，进一步降低植物生长。（1）土壤中较高的盐离子浓度导致植物水分亏缺-渗透胁迫当环境中盐分浓度过高时，介质的水势下降，水分的有效性降低，造成植物吸水困难，对植物形成渗透胁迫。近年来以提高植物抗旱能力为目的的基因工程研究表明：转基因植株在提高了抗旱能力的同时，耐盐能力也得以提高，表明盐胁迫对植物可产生渗透胁迫效应。（2） 植物吸收较多的盐离子所带来的离子毒害-盐害 正常生理状况下，植物细胞的胞质内维持着较高的K+/Na+比值。生长于高盐环境中的植物在一段时间后体内会积累一定浓度的盐分，当胞内Na+离子浓度大于100mM时，可使细胞原生质凝聚，破坏其胶体性质，甚至改变细胞质的pH值，破坏酶的结构，使其生理活性降低，造成代谢紊乱，蛋白质合成受阻，分解加剧。总结 盐胁迫对植物的伤害主要有渗透胁迫和离子毒害两个方面造成植物生长受抑制最初由根系外部盐分所引起的渗透胁迫造成。随后生长的进一步降低是盐分进入植物细胞造成伤害所致。盐胁迫对植物的伤害还导致一些次级伤害如氧化胁迫伤害等。-植物的抗盐性是一个非常复杂的问题。(二) 植物抗盐的生理机制1、稀盐盐生植物的抗盐机理形态学上的适应； 即茎或叶的肉质化茎或叶的薄壁细胞组织大量增生，细胞数目增多，体积增大，可以吸收和储存大量水分，既可以克服植物在盐渍条件下由于吸水困难造成的水分不足，又可将吸收到体内的盐分稀释，保持低水平。生理上的适应： 具有渗透调节和离子区域化渗透调节： 植物适应盐胁迫的主要生理机制之一离子区域化： 盐生植物通过将Na+区域划入液泡，使植物抵抗外界的低水势而得以吸水。2、泌盐盐生植物的抗盐机理泌盐是盐生植物适应盐渍环境的一条重要途径-滨藜、柽柳. 此类植物的叶片和茎部的表皮细胞在发育过程中分化成盐腺，通过盐腺把吸收到体内的盐分排出体外3、拒盐植物的抗盐机理拒盐机制包括以下几个过程：u 植物根部对离子的选择性吸收u 把吸收到地上部的Na+储存在根、茎基部、叶鞘等的薄壁细胞中，从而阻止Na+向地上部运输。u 通过韧皮部将吸收到地上部的Na+向下 运输，运回根部最后分泌到环境中。（三）植物抗盐的分子机制参与植物耐盐的基因根据功能分为三类：1具有渗透或保护功能的基因；2控制盐分吸收、转运的基因；3使植物在盐土中加快生长的基因。具有渗透或保护功能的基因；基因产物的功能：高浓度时具有渗透调节功能，低浓度时起保护作用。主要是指盐胁迫下，一些没有毒性的溶质浓度增加，提高渗透调节能力，维持细胞膨压。使植物适应盐、干旱等胁迫。含氮的可溶性溶质：如脯氨酸，甘氨酸甜菜碱。可溶性糖：如蔗糖、棉籽糖。直链多元醇如甘露醇、山梨糖醇、环多元醇。起保护作用的基因：保护性蛋白包括：胚胎发育晚期丰富蛋白（LEAs) 及与它相近的蛋白（their close relative)和干旱素；这些蛋白随水分胁迫产生，在干旱后的恢复过程中起作用。但他们具体生化机制还不此外清除活性氧的酶类包括SOD、CAT等在植物适应盐胁迫的环境中起重要作用；控制盐分吸收、转运的基因；控制离子转运的膜蛋白：离子通道和转运体；活跃的转运是通过同向或返向转运体来完成的 ，需消耗能量，由电化学势梯度驱动，同时藕联H+离子 需由质膜上质子泵完成。Na+ 如何进入细胞？在转运体和离子通道的作用下通过细胞膜，转运体工作时由P型H+-ATPase驱动， H+-ATPase水解ATP将H+泵到细胞壁。通过液泡膜由V型H+-ATPase或H+-PPiase驱动。Na+ 进入细胞后的去向1. 可以协同其他离子进入相邻细胞2. Na+外排3. 被区域化进入液泡Na+外排基因- SOS1高等植物Na+的外排机制主要与质膜Na+/H+反向转运器的活动有关。所需能量主要来源于质膜H+-ATPase水解ATP释放的能量将H+从胞外泵入细胞，在质膜两侧产生质子电化学势梯度，促使Na+/H+反向转运器利用质子从胞外沿电化学梯度运往胞内产生的能量将Na+逆着浓度梯度。质膜上的Na+/H+逆向转运蛋白基因最初从酵母中克隆得到。在植物中，Shi 等人已从拟南芥中克隆到SOS1 基因，它编码的蛋白与细菌和真菌的质膜Na+/H+反向转运蛋白具有非常高的同源性。Na+区域化基因- NHX1液泡的Na+区域化是由液泡膜上的Na+/H+反向转运器介导的。此过程由液泡膜上的H+-ATP ase 和H+-Ppiase产生的跨膜电化学势差驱动，促使Na+逆着电化学势差区域化到液泡膜内。Na+/H+反向转运器（Na+/H+ antiporter：Na+/H+反向转运器最早由P.Mitchell 及其合作者于1974年发现，是一类催化Na+（Li+）与H+交换调节胞内pH、细胞容积和胞质中离子平衡的膜蛋白，广泛存在于低等细菌到高等植物及人类细胞的细胞质膜及许多细胞器膜上。到目前为止，Na+/H+反向转运器的研究已经有30多年的历史，研究者已在许多种植物、藻类上检测到Na+/H+反向转运器活性，并且有些物种基因已克隆并定位；Na+/H+反向转运器的蛋白结构特点。研究发现，Na+/H+反向转运器在N端包含10-12跨膜区，跨膜区6和7高度保守。因此这一部分被认为是Na+/H+反向转运器转运Na+、H+的区域。但是也有人认为它的功能区在三维结构上是高度保守的，在离子转运中起作用的是它的三维结构，而不是蛋白序列。Na+/H+反向转运器C端有个很大的疏水区，在整个家族中他们的相似性很小。3、控制细胞和组织生长速率的基因控制植物生长的基因涉及信号途径的基因包括感受器、激素、转录引子、蛋白激酶、蛋白磷酸酶及其他信号分子如钙结合蛋白等。这类基因同样作用于其他胁迫如干旱、低温等。一些抗盐基因只是盐胁迫反