自然抗性相关巨噬细胞蛋白1基因多态性与肺结核易感性的研究.doc

自然抗性相关巨噬细胞蛋白1基因多态性与肺结核易感性的研究 ?论著?基金项目:国家自然科学基金资助项目 (30271144):100071?京,军事医学科学院微生物与流?病研究所流?病教研室(刘玮、吴晓明、赵秋敏、张泮河、杨红、曹务春);解放军第三九医院(张翠英);解放军第九一医院(田?);解放军总参谋部第三防疫队(李春芝、杨淑梅)通信作者:曹务春自然抗性相关巨噬细胞蛋白1基因多态性与肺结核?感性的研究刘玮张翠英田?李春芝吴晓明赵秋敏张泮河杨淑梅杨红曹务春【摘要】目的探讨自然抗性相关巨噬细胞蛋白1基因(NRAMP1)多态性与中国汉族人群肺结核发病的关系。 方法采用以医院为基础的病例对照研究设计,用聚合酶链反应2限制性片段长度多态性分析(PCR2RFLP)法检测NRAMP1基因中INT 4、D543N及3UTR3个多态性位点的基因型,并对结核病相关危险因素进?问卷调查,应用SPSS软件进?单因素和多因素非条件logistic回归分析。 xx?4月至xx?6月选择110例肺结核病例,平均?龄为(2813)岁;对照组为180名健康体检者,平均?龄为(279)岁。 对NRAMP1基因各多态性位点进?单因素分析。 结果病例组D543N G/A及3UTR TGTG+/del基因型频率显著高于对照组,OR值(95%CI)分别为2122(11034178)和1193(11143126)。 病例组和对照INT4各基因型频率比较差异无显著性。 多因素分析调整?史和疫苗接种史2个因素后,D543N G/A及3UTR TGTG+/del基因型仍与结核病显著相关,调整OR值(95%CI)分别为3104(11128127)和2136(11204164),而病例和对照组INT4位点多态性比较差异未见显著性。 结论NRAMP1基因D543N及3UTR位点多态性可能是汉族人群肺结核的?感因素。 【关键词】结核,肺;阳离子转运蛋白质类;基因;多态性,限制性片段长度A case2control studyon natural2resistance2associated macrophageprotein1gene polymorphisms andsusceptibility to pulmonary tuberculosisL IUWei3,ZHANG Cui2ying,TIAN Lei,L IChun2zhi,WUXiao2ming,ZHAO Qiu2min,ZHANG Pan2he,YANG Shu2mei,YANG Hong,CAO Wu2chun13Beijing Instituteof Microbiologyand Epidemiology,Beijing100071,China【Abstract】ObjectiveTo investigateassociation betweenthe natural2resistance2associatedmacrophage protein1(NRAMP1)gene polymorphismsand susceptibility topulmonarytuberculosis(TB)inChinese Han population1MethodsHospital2based case2control studydesign wasadopted1Polymerase chainreaction(PCR)and restriction fragment lengthpolymorphism(RFLP)technique wereused totype threeNRAMP1polymorphisms(INT4,D543N and3UTR)1Information onrelated factorsof tuberculosiswascollected usinga pre2tested standardquestionnaire1Univariate andmultivariate unconditionallogisticanalyses wereconducted usingSPSS forwindow softwarepackage1Totally,110cases ofTB wereselectedduring Aprilxxto Junexx,with anaverage ageof(27171217)years1Also,180cases ofhealthycontrol wereselected,aged(2713912)years inaverage1Locus ofNRAMP1polymorphism wasanalysedwith univariatemethod1ResultsUnivariate analysisdemonstrated thatthe D543N G/A and3UTRTGTG+/del genotypeourred morefrequently inthe casesthan inthe controls,with crudeodds ratios(OR)(95%CI)of2122(11034178)and1193(11143126),respectively1No significantassociationwas observedbetween TBand INT4polymorphisms1In multivariateanalysis,associationsof TBand D543NG/A and3UTR TGTG+/del genotypesremained,adjusted forexposure historyand bacilleCamette2Gurin immunization1Adjusted OR(95%CI)was3104(11128127)and2136(11204164),respectively1Still,no significantassociation betweenINT4polymorphismsandTB wasfound1ConclusionPolymorphisms ofD543N and3UTR locusin NRAMP1gene mightaffect theirsusceptibility toTB inChineseHanpopulation1【Key words】Tuberculosis,pulmonary;Cation transportproteins;Gene;Polymorphism,restrictionfragmentlenght?804中华预防医学杂志xx?11月第37卷第6期Chin JPrev Med,Novemberxx,Vol37,No.6中华预防医学杂志肺结核是危害人类健康的重要传染病之一。 2000?第四次全国结核病流?病学抽样调查结果显示,我国现有肺结核患者450万人,约占全球总病例数的1/4。 以往国内结核病的研究主要集中在致病菌及环境因素对发病的影响,近?来随着基因组流?病学的发展,宿主?感基因在疾病发生与发展中的作用日益受到人们的重视,自然抗性相关巨噬细胞蛋白1(natural2resistance2associated macrophageprotein1,NRAMP1)基因就是其中主要的候选?感基因之一。 研究结果表明,NRAMP1基因中存在多个多态性位点,其?同的基因型可能影响宿主对结核分支杆菌的抵抗?1。 在非洲人群中进?的肺结核病例对照研究结果显示,NRAMP1基因多态性与肺结核发病有关,并且基因型分布频率存在人种差异2。 我们选取NRAMP1基因中3个多态性位点:INT4(intron4,第4内含子处的GC置换)、D543N(15外显子第543位点处的GA置换)及3UTR(3端非翻译区的TGTG缺失),应用病例对照研究设计探讨我国汉族人群中NRAMP1基因多态性与肺结核发病的关系,以期为我国结核病防治提供新的思?。 对象与方法 一、病例的选择从xx?4月至xx?6月在解放军309医院和91医院选择确诊的成?男性汉族肺结核患者,诊断按国家统一标准进?,即痰菌阳性同时X线胸片有肺结核特征病灶;或痰菌阴性,但X线胸片示活动性肺结核征象,PPD试验强阳性并具有明显结核病的临床体征。 同时排除肺炎、肺癌、尘肺、糖?病和肿瘤等免疫功能低下者。 对照组则选取与病例无血缘关系的男性汉族健康部队人员,所有对照均经胸部X线检查,排除肺结核病史。 二、方法1.问卷调查:设计统一的调查问卷,内容包括?龄、籍贯、入伍时间、居住地、文化程度、婚姻状况和经济收入,与结核发病有关的危险因素包括吸烟、饮酒状况、营养状况、居住环境、健身活动、结核?史及卡介苗接种史以及既往病史,所有研究对象均由专业人员进?现场问卷调查,并检查是否接种卡介苗,同时留取抗凝血备用。 21基因多态性检测方法: (1)基因组DNA的提取:取抗凝血加入2倍体积的?巴细胞分离液(?京欣经科公司),用水平离心机以1500r/min离心30min收集白细胞,用PBS洗涤2遍。 用全血基因组快速提取试剂盒(博大公司)提取白细胞中的基因组DNA。 (2)聚合酶链反应(PCR):参考文献2设计引物,均由上海博亚公司合成。 INT4扩增引物为52TCTCTGGCTGAAGGCTCTCCPCR23和52TGTGCTATCAGTTGAGCCTC23。 反应体系总体积为30l,其中含模板DNA100ng,215mmol/LMgCl2,1U Taq酶,上游引物与下游引物各015mol/L。 反应在PE2400PCR仪上进?,循环参数为:96预变性1min,94变性45s,55退火45s,72延伸45s,共30个循环。 D543N与3UTR的扩增引物相同,上游引物为52GCATCTCCCCAATTCATGGT23,下游引物为52AACTGTCCCACTCTATCCTG23。 反应体系同INT4,循环参数为:95预变性5min,94变性30s,58退火30s,72延伸30s,共5个循环,之后94变性30s,53退火30s,72延伸30s,共30个循环。 (3)限制性酶切分析:参考文献1,取各位点的PCR产物进?限制性酶切分型。 所有限制性内切酶均购自大连宝生物公司,按产品说明书进?操作。 取酶切后样品经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳,015g/ml溴化乙啶染色后,在紫外灯下观察并记录结果。 (4)基因的克隆与测序:将PCR回收产物克隆入pUC18载体,重组质粒送至?京六合通公司测序,以验证PCR产物的正确性。 3.统计分析:资?的整?录入与分析均采用SPSS (1010)软件进?,首先对各基因型频率及各潜在危险因素与肺结核发病的关系分别进?单因素分析,计算粗OR值及95%可信区间。 然后将是否发病作因变?,各基因型作为自变?,单因素分析中有显著意义的相关危险因素作为协变?,进?多因素非条件logistic回归分析,计算调整OR值及其95%可信限。 所有统计过程均使用双侧检验。 结果1.病例与对照组一般情况比较:病例110例,平均?龄为(2813)岁。 对照180例,平均?龄(279)岁。 经统计分析,两组在?龄、籍贯、婚姻状况及文化程度等方面差异无显著性,具有可比性。 21相关因素的单因素分析结果:对结核病相关危险因素进?单因素分析,结果显示,?史与接种史在两组中的分布差异有显著性(P=01028,P 其他因素在两组中分布差异无显著性(表1)。 表1肺结核相关环境因素的单因素分析结果变?病例组(110例)对照组(180例)2值P值?史4185401028有13/1036/129无90/103123/129接种史12194601000有38/9792/147无59/9755/147抽烟状况1150901219是66/11085/162否44/11077/162健身活动4121501239极少参加21/10432/15212次/周49/10485/1523次/周17/10422/152每天参加17/10413/152肉类摄入1172701631每天有52/10982/156经常有46/10961/156很少有11/10913/156饮酒状况0118401668?喝或偶尔99/108148/159经常或每天9/10811/159注:斜线前数字为回答该问题的人数,斜线后数字为回答该项问题的总人数31NRAMP1基因多态性与肺结核关联的单因素分析结果显示,病例组中D543N G/A与3UTRTGTG+/del基因型均高于对照组,OR值分别为2122(95%CI为11034178)和1193(95%CI为11143126)。 INT4各基因型在两组中的分布无显著性差异,OR值为1169(95%CI为01873126),见表2。 表2自然抗性相关巨噬细胞蛋白1基因多态性与肺结核关系的单因素分析结果多态性位点病例组(110例)对照组(180例)OR值(95%CI)2值P值INT42140801121G/G891501100G/C21211169(01873126)D543N4116901041G/G931581100G/A17132122(11034178)3UTR6106301048TGTG+/+671261100TGTG+/del41401193(11143126)TGTGdel/del240194(01175127)注:因个别对照样品未获得明确酶切结果,视为缺失41NRAMP1基因多态性位点与肺结核关联的多因素非条件logistic回归分析结果:以是否发病作为因变?,各位点基因型为自变?,单因素分析中有显著意义的?史和接种史为协变?,进?多因素非条件logistic回归分析。 结果显示,调整?史和接种史2个因素后,D543N G/A及3UTR TGTG+/del基因型仍与结核发病显著性相关,调整OR值分别为3104(95%CI为11128127)和2136(95%CI为11204164)。 而INT4各基因型与结核发病间仍无显著性关联(P=01216),见表3。 表3自然抗性相关巨噬细胞蛋白1基因多态性与肺结核关系的多因素logistic回归分析结果模型变?调整OR值95%P值INT4G/C1100INT4INT4G/G01590126113401216模型接种史01300117015401000?史517211691913601005D543N G/G1100D543N D543N G/A31041112812701030模型接种史01260114014901000?史5138115818130010073UTR TGTG+/+11003UTR3UTR TGTG+/del21361120416401013模型3UTRTGTGdel/del216101322110601368接种史01260114014801000?史610611762018501004讨论结核病的发生分为2个阶段,?感人群首先接触并感染结核分支杆菌,然后经历长短?一的潜伏期发展为结核病患者。 全球约有1/3的人感染结核杆菌,但其中?到1/10发展为结核病3,这些患者中除少部分有明显的危险因素如艾滋病病毒感染、糖?病和激素治疗等外,其余大部分是基因与环境因素共同作用的结果。 我们选取NRAMP1基因上的3个多态性位点,并对结核病的危险因素如抽烟、饮酒、居住拥挤及营养?良等进?问卷调查,通过多因素logistic分析排除可能引起的混杂因素,从根本上探讨NRAMP1基因与疾病的关系。 研究结果显示,调整了结核?史和卡介苗接种史2个环境因素后,D543N与3UTR位点的基因型频率在两组中的分布有显著性差异,其中D543N G/A及3UTRTGTG+/del基因型在病例组的频率显著高于对照组,可能是肺结核的?感基因型。 INT4位点各基?014中华预防医学杂志xx?11月第37卷第6期Chin JPrev Med,Novemberxx,Vol37,No.6中华预防医学杂志因型与疾病无显著性关联。 在非洲,人群进?的类似研究结果显示,INT 4、D543N及3UTR各位点?同基因型与肺结核发病均有显著相关性2。 分析2个研究在INT4与结核关系上存在差异的原因,可能是由?同的遗传背景差异或?同的基因及环境间的交互作用所造成,但尚需在?同人群和?大样本?基础上深入研究。 需要指出的是,本研究中选择一般健康人群而非结核的抵抗人群(即虽然感染但终身?发病者)作为对照,是因研究结果表明结核的抵抗人群占感染总人群的90%95%,其对结核的遗传?感性在总体上与一般健康人群差别甚小,所以后者可以作为本研究的?想对照4。 此外,中国的卡介苗接种率很高,环境分支杆菌亦普遍存在,即使结核菌素试验也很难明确界定出已感染结核杆菌的健康人群。 本研究的?足之处在于某些环境因素如吸烟、饮酒等无法定?,会引起一定的信息偏倚。 但因研究对象均部队,他们有较一致的社会经济地位和相似的生活和居住环境,故能使信息偏倚的影响降至最低。 此外,因已有研究结果表明,X染色体上的多态性位点可能与结核发病有关5,所以将研究对象限定为男性,这在一定程度上影响了研究结果外推至整体。 随着人类基因组计划的完成和后基因组时代的到来,越来越多的结核?感基因(如维生素D受体基因和IL1基因)被发现4,6,而基因组流?病学研究的开展使这些?感基因在?同人群中的分布、在疾病发生中所起的作用及基因2基因和基因2环境的交互作用将逐步被阐明,这有助于结核病高危人群的预测,从而为优选干预措施(医学干预、?为干预或环境干预)提供科学依据,为制定适宜的预防策略打下一定的基础。 参考文献1Liu J,Fujiwara TM,Buu NT,et al1Identification ofpolymorphismsand sequencevariants inthe humanhomologue ofthe mousenaturalresistance2associated macrophageprotein gene1Am JHum Ge,1995,56:845285312Bellamy R,Ruwende C,Corrah T,et al1Variation inthe NRAMP1gene andsusceptibility totuberculosis inWest Africans1N EnglJMed,1998,338:640264413Murray CJ,Styblo K,Rouillon A1Tuberculosis indevelopingcountries:burden,intervention andcost1Bull IntUnion TubercLungDis,1990,65:622414Bellamy R,Ruwende C,Corrah T,et al1Assessment oftheinterleukin1gene clusterand othercandidate genepolymorphismsin hostsusceptibilitytotuberculosis1Tuberc LungDis,1998,79:83289