蛋白质高效液相色谱技术ppt课件.ppt

高效液相色谱法在蛋白质分离中的应用 陈檬S1030624张双健S1030621郭传龙S1030622石晨阳S1030623汪菊芬S1030625 1 5 2 HPLC是近二十年来发展起来的一项新颖快速的分离技术 它是在经典液相层析法基础上 引进了气相层析的理论具有气相层析的全部优点 特点 3 根据分离机理蛋白质HPLC又可分为 1 2 4 3 高效凝胶过滤色谱 HPSEC 高效离子交换色谱 HPIEC 高效亲和色谱 HPAFC 反向高效液相色谱 RP HPLC 4 高效液相色谱仪 5 常用的HPLC仪 Waters公司Agilent公司岛津公司等 6 一进样系统 7 六通阀进样 高效液相色谱系统中最理想的进样器 它是由圆形密封垫 转子 和固定底座 定子 组成 美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用 各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器 上样 分析 8 进样阀 样品 装样 废液 淋洗液 至分离柱 定量环进样 样品环 9 进样方式 进样量应不大于定量环体积的50 最多75 并要求每次进样体积准确 相同 缺点是易产生由进样引起的峰展宽 进样量应不小于定量环体积的5 10倍 最少3倍 这样才能完全置换定量环内的流动相 消除管壁效应 确保进样的准确度及重复性 10 二输液系统 11 高压输液泵 输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一 其作用是将流动相以稳定的流速或压力输入到色谱系统 泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性 流量稳定流量范围宽输出压力高液缸容积小密封性能好 耐腐蚀 12 流量不受柱阻影响 泵压可达400kg cm2 输出的脉冲性较大 现多采用双泵系统来克服 13 三分离系统 14 色谱柱 柱效高选择性好分析速度快 15 进入色谱柱样品的处理 16 柱的使用和维护注意事项 色谱柱的正确使用和维护十分重要 稍有不慎就会降低柱效 缩短使用寿命甚至损坏 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动 应逐渐改变溶剂的组成 一般说来色谱柱不能反冲 会迅速降低柱效 17 选择使用适宜的流动相 尤其是pH 以避免固定相被破坏 需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱 经常用强溶剂冲洗色谱柱 清除保留在柱内的杂质 柱的使用和维护注意事项 18 四检测系统 19 20 UV检测器 21 数据处理和计算机控制系统 恒温装置 在HPLC仪中色谱柱及某些检测器都要求能准确地控制工作环境温度 柱子的恒温精度要求在 0 1 0 5 之间 检测器的恒温要求则更高 采集处理分析数据 控制仪器 色谱系统优化 22 流动相的要求 反相色谱流动相以水作为基础溶剂 再加入一定量的能与水互溶的非极性调整剂 常用的是甲醇和乙腈 一般情况下甲醇 水已经能够满足多种样品的分离 粘度小 价格低 但推荐乙腈 水做初始实验 与甲醇比 乙腈的溶剂强度高粘度小 并可满足185 205nm处检测的要求 23 流动相的准备 调整PH 根据所分离蛋白质及色谱柱决定 流动相脱气 滤膜过滤 目前实验室主要用的是超声15min左右 溶剂使用前都必须经0 45 m滤膜过滤 以除去杂质微粒 分清有机相滤膜和水相滤膜 对于混合流动相 在混合前过滤 24 蛋白样品的性质 25 HPLC与其他色谱光谱技术的联用 CE MS CE HPLC 26 高效液相色谱 质谱蛋白质组学和蛋白质酶谱研究的重要手段 通过质谱可以实现对蛋白质的自动分离检测 高效液相色谱 毛细管电泳当毛细管电泳与HPLC联用时 两者各自优势都得以发挥 HPLC CE联用技术特别适合细胞或组织中蛋白质的分离 27 反相高效液相色谱法对血清中胰岛素的测定 应用实例 色谱柱 流动相 梯度洗脱 其他 C5柱 100mm 4 6mm5 m Ph enomenex公司 美国 A相 10mmol LTris缓冲液 pH8 5 B相 乙腈 流速 1mL min B相体积分数变化为 0 15min 15 25 5 15 21min 25 5 进样量20 L柱温25 28 29 高效液相色谱目前多用于蛋白质的定量分析 对于大样品的分离纯化成本较高且费时 有待进一步优化其条件