二代测序技术在医学领域中的应用.ppt

二代测序技术在医学领域中的应用 魏冬凯 概要 二代测序技术简介常见医学领域NGS方案石蜡包埋样本解决方案CTC和ctDNA 二代测序技术简介 人类基因组HumanGenome 30亿对碱基来自母亲30亿对碱基来自父亲线粒体基因组来自母亲与人类共生的微生物基因组 DNA的构成 末端终止法测序 ABI3700 ABI3730 人类基因组计划 HGP 人类基因组计划 humangenomeproject HGP 是由美国科学家于1985年率先提出 于1990年正式启动的 美国 英国 法国 德国 日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划 按照这个计划的设想 最终要把人体内约4万个基因的密码全部解开 同时绘制出人类基因的谱图 换句话说 就是要揭开组成人体4万个基因的30亿个碱基对的秘密 人类基因组计划与曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划并称为三大科学计划 被誉为生命科学的 登月计划 CeleraGenomics CraigVenter成立第一个使用全基因组鸟枪法测序使用330台ABI3700 购买当时世界排名第三的服务器进行运算 花费3个月时间对Venter的基因组进行测序 得到20GB数据 Ventor基因组测序 基于分子克隆 必须将DNA片段克隆至大肠杆菌中 否则无法测序 每次末端终止反应体系10ul 其中含有1013个DNA分子 但每次只能测其中1条 预计花费2亿美金 最终花费30亿美金 怎样才能降低试剂消耗 降低消耗的办法 1 将分子克隆替换成聚合酶链式反应 PCR 先给DNA片段加上尾巴 桥式PCR2 降低反应体积把测序反应装到小的空间里去 10ul的试剂做更多的DNA测序反应 降低消耗的办法 1 将分子克隆替换成聚合酶链式反应 PCR 先给DNA片段加上尾巴 桥式PCR2 降低反应体积把测序反应装到小的空间里去 10ul的试剂做更多的DNA测序反应 桥式PCR 二代测序 NGS 边合成边测序 SBS Flowcell SBS技术特点 读长最初的时候只有31bp 现已能达到600bp 运行时间长 荧光信号会逐渐减弱 每次只能结合1个碱基 发出一种荧光信号 Hiseq2500 可同时运行2张8通道flowcell有高通量模式和快速模式2种模式 单次运行数据量高达500GB 快速模式最短运行时间17小时 常见医学领域NGS方案 二代测序应用医疗的可行性 NGS的优势 相比于一代测序 NGS更加省时低成本 速度快 覆盖度深 准确度高 高通量测序人类基因组有助于发现与疾病相关的未知基因 对于疾病引起的基因突变 高通量测序可以为患者医师提供更为准确的诊断依据 需求样本类型广泛 样本量需求少 常见医学领域NGS方案 全基因组重测序 WGRS 寻找个体突变 InDel CNV SV等等 需求数据量大 单个样本需求90G数据 全外显子组测序 WES 捕获基因组中的全外显子进行测序 测序数据量较WGRS少很多 并能获得高测序深度 50X 150X 常见医学领域NGS方案 靶向区域测序 TargetSequencing 捕获富集感兴趣的靶向区域进行测序 技术流程与全外显子捕获相似 测序需求量较WES少 能获得更高测序深度 最高500X 转录组测序 RNA Seq 研究转录水平上的测序 包括mRNA lncRNA microRNA等 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序 并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法 随着基因组测序成本的不断降低 人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围 通过构建不同长度的插入片段文库和短序列 双末端测序相结合的策略进行高通量测序 实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见 低频 甚至是罕见的突变位点 以及结构变异等 具有重大的科研和产业价值 全基因组重测序 WGRS DNA Seq SNP 个体间差异 CNV 大片段基因拷贝数变异 InDelSV 结构变异 全基因组重测序的应用 SNP SNV 示例 为何研究SNP SNP目前已被公认为疾病发生的基因分子标记 SNP被认为是导致药物差异化的主要因素之一 因此可以根据SNP的变化来进行个性化用药 SNP分布广泛 且较为稳定 某些SNP会直接影响功能基因表达 大多数的SNP都是无用的 大多数的SNP属于沉默突变 非编码区的错义突变也不会导致蛋白质发生改变 但也有例外 诊断实例 Dr JamesGern和JosephDeRisi合作 用MiSeqDx从一个病危的十几岁的男孩的脑脊液中抽提出核酸样本 测了8百万条核酸序列 从中检出了475条钩端螺旋体的序列 从而判定这个男孩的病是因为钩端螺旋体感染 Dr JamesGern依据上述的判断 给男孩青霉素治疗 治好了这个男孩的病 脑脊液是较难取得的体液 只能是采集很少的量 这就限制了所能得到的核酸总量 钩端螺旋体 在病原体的常见程度排名中是较靠后的种类 在本案例中 如果用PCR方法 挨个排查病原体 可能还没排到钩端螺旋体 核酸就不够了 但高通量测序克服了核酸量不够的问题 在本案例中 钩端螺旋体DNA只占总DNA的万分之0 6 含量极微 但经过高通量测序 得到了475条钩端螺旋体的DNA 这让钩端螺旋体无处循形 2009年H1N1病毒爆发感染时 有一名病人死于呼吸系统引起的多器官衰竭 然而并不知道具体的死因 科学家把病人的肺部穿刺组织的DNA拿来做高通量测序 最终在950万条序列中 含有0 85 的序列来自于H1N1病毒基因组 从而帮助科学家发现了该病人的真正死因 在这样高人类基因组干扰的背景下 目前其他技术都难以快速发现致病病毒序列 以及分子分型 Kuroda M Katano H Nakajima N Tobiume M Ainai A Sekizuka T Sata T 2010 PloSOne 5 4 e10256 doi 10 1371 journal pone 0010256 Nimblegen Roche SureSelect Agilent RNAOligoTrusight Illumina 全外显子测序 WES 癌症相关 人 遗传性疾病 人 其它非传染性疾病 人 主要用于寻找罕见突变 遗传性突变及癌症相关的体细胞突变可以做SNP InDel分析 但由于捕获区域较短 一般不用于CNV SV分析 WES应用领域 成本低 一般50 150X 也仅需要8 15G数据 降低分析背景 容易发现稀有突变 大约能测到50 80bp的片段缺失 由于外显子捕获芯片片段较短 很难判断是由捕获脱靶导致还是由缺失导致 同样因为捕获芯片片段较短 一般不做CNV SV分析 WES特点 WES方案流程 包括mRNA Seq lncRNA Seq sRNA Seq等 可以高通量分析转录本信息 发现未知的转录本和基因注释 寻找个体间 同一个体不同时期等感兴趣基因表达丰度变化 转录组测序 RNA Seq mRNA Seq方案 有关lncRNA的一些知识 长度大于200bp无法编码蛋白有内含子区和外显子区非编码RNA具有调节基因表达的作用 如对染色体结构的影响 对RNA加工修饰及稳定性的影响 对转录和翻译的影响 甚至对蛋白质的转运及稳定性都有一定的影响 所以近年来 许多通过RNA seq进行测序分析的文章都包括对lncRNA的分析 并且发现了许多新的lncRNA lncRNA Seq sRNA Seq RNA seq的优势 不局限于已知的基因组序列信息 适用于未知基因组序列的物种的高通量转录组研究相对于芯片技术 背景信号值低 没有检测上限 对于基因表达谱有非常宽的检测范围 在有内参的情况下 在定量方面显示出了较高的准确度和可重复性 不需要克隆的步骤 操作简单 需要的样本量少 可在单细胞的水平上进行表达谱分析通量高 成本比Tillingarray或者大规模的EST测序要低 RNA seq的挑战 文库构建过程中大片段的RNA必须经过片段化处理 会引入一定的偏倚 PCR会造成表达量的变化 海量短序列数据的比对或拼接情况复杂 对重复序列和多匹配序列的精确定位存在明显问题 高等真核生物可变剪接和反式剪接的鉴定仍有相当的误差 测序深度的确定因物种 器官 组织 时期而变 很难有统一公式直接计算 石蜡包埋样本解决方案 FFPE样本 石蜡包埋切片组织 石蜡包埋技术 Formalin FixedandParrffin Embedded FFPE 是现今临床上最常见的保存DNA方法 全球医院的珍贵临床样本中超过80 都使用该技术保存 但由于该技术DNA经过福尔马林浸泡 使DNA分子发生交联和酶修饰 导致DNA存在不同幅度的降解 样本量巨大 80 以上的临床样本都使用石蜡包埋保存很多珍贵的临床样本已经做过组织学 病理学研究 很容易完成相关实验验证 为何要使用FFPE样本 难于抽提 福尔马林处理后的DNA容易产生交联 使提取出的DNA量偏低提取出的DNA质量低 通常降解200bp 5kb降解程度与石蜡包埋的时间相关 FFPE WES的巨大挑战 是否有相同突变 目前无法用于WGRS 样本降解严重 对DNA覆盖度有很大影响 DNA量过少 质量很差 石蜡包埋时间越长 福尔马林对DNA交联和损伤就越大 未使用保护缓冲液处理的福尔马林影响更大 FFPE样本仍存在问题 CTCS和ctDNA 什么是CTCs CTCs CirculatingTumorCells 自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞 CTCs是肿瘤转移过程中在血液循环系统中存活的肿瘤细胞 它的生成被认为是肿瘤发生转移的必要前提 CTCs研究意义 CTCs研究难点 CTCs并没有显著的特异性同其它血细胞明确区分且不同组织学类型和分子表型的肿瘤分别表达不同的标志物 CTCs在外周血中数量稀少 一般在106 107个白细胞中仅含有1个 无显著特异性 数量少 CTCs的富集 通过细胞形态富集 微流芯片 密度梯度离心 Plasma 血浆Mononuclearcell 单核细胞 包括淋巴细胞 单核细胞 上皮细胞和肿瘤细胞 Ficoll 密度梯度液RBCs 红细胞 免疫磁珠富集法 微流体 CTCs鉴定 流式细胞仪分析 flowcytometryFCM 免疫细胞化学技术ICC immunocytochemistry 鉴定标本中细胞抗原性和形态学特征 能使富集的目的细胞维持细胞形态并保持细胞活力 ICC是用能与显色剂结合的单抗与CTCs特异性结合后 通过显色剂显色从而对CTCs进行鉴定的技术 通过分析上皮细胞或肿瘤细胞的正常起源组织特异的候选基因的表达来检测CTC 灵敏度非常高但是坏死的癌细胞 上皮细胞污染等都可以造成假阳性结果 此法