免疫学检测技术在食品安全中的应用.docx

免疫学检测技术在食品安全中的应用食品安全问题在21世纪的今天已经成为全世界关注的重大问题，对国家的经济发展和消费者的身体健康产生了重大影响。由于食品种类丰富，食品中检测的有毒有害物质种类和组分繁多，需要检测的物质质量极低，样品中待检物的浓度常为g、ng甚至pg级，除此之外，许多检测物除需检测物质本身，还涉及其衍生物和降解物测定。区别同位异构体以及元素的价态等。因此食品检测要求检测方法更加准确、快速、方便。1959年，Yalow和Berson将发射性同位素示踪与免疫反应相结合建立了发射免疫测定法，从而开创了免疫分析这一崭新领域。现在，免疫学检测技术是食品检测技术中的一个重要组成部分，特别是三大免疫技术荧光免疫技术、酶免疫技术、放射免疫技术在食品检测中得到了广泛应用。利用免疫学检测技术可检测细菌、病毒、真菌、各种毒素、寄生虫等，还可用于蛋白质、激素、其他生理活性物质、药物残留、抗生素等的检测，其检测方法简便、快速、灵敏度高、特异性强，特别是单克隆抗体的发展，使得免疫检测方法特异性更强，结果更准确。世界粮农组织（FAO）已向许多国家推荐免疫检测技术，因此,人们称免疫分析技术是21世纪最具竞争性和挑战性的检测分析技术。1免疫荧光技术在食品检测中的应用免疫荧光分析（Immuno Fluorescence Assay,IFA）始创于20世纪40年代初，1942年Cons等首次报道用异硫氰酸荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗体，但此种荧光素标记物的性能较差，未能推广应用，20世纪50年代，Riggs等合成性能较为优良的异硫氰酸荧光素。Mashall等对荧光抗体的标记方法又进行了改进，从而使得免疫荧光技术逐渐推广应用。1.1底物标记荧光测定法底物标记荧光测定法（SLFIA）使用一种酶的底物标记待测物，底物本身无荧光，在受到相应酶的催化时能转变为荧光物，当标记底物与抗体结合产生的空间位阻阻碍了酶与标记底物间的接触，样品中的待测物通过竞争作用使游离的酶标结合物或荧光强度增加。1.2荧光偏振免疫测定法 使用偏振光作为激发光时，视分子的运动状态，发射的荧光可能是振动方向各向随机化的普通荧光，或是只在某一平面振动的偏振荧光（ploarized fluorescence）在反应液中，游离的标记物分子体积小，在布朗运动中转动速度快，受偏振光照射后产生的荧光偏振方向被分散，不能产生偏振光，只发射普通荧光；与抗体结合的标记物分子体积增大，布朗运动速度减慢，甚至不能转动而形成定向排列，所以受偏振光激发后能产生偏振荧光，样品中的待测物的量越大，偏振荧光的强度越高。1.3荧光淬灭免疫测定法荧光淬灭免疫测定法（Fluoresecent Quenching Immunoassay）的原理是当荧光标记物与抗体结合后发生荧光淬灭。荧光猝灭的机制尚不清楚，荧光淬灭可能与标记物与抗体结合后导致电子振动状态的改变有关。1.4荧光增强免疫测定法 荧光增强免疫测定法（Fluoresecent Enhancement Immunoassay）的原理与荧光淬灭增强免疫测定法相似，不同的是标记物与抗体结合后荧光强度增强。2酶免疫检测技术在食品检测中的应用 酶免疫检测技术是在20世纪60年代在荧光和组织化学的基础上发展起来的一种新技术，最初用酶代表荧光素标记抗体作为生物组织中抗原的鉴定和定位。随后发展为用于鉴定免疫扩散及免疫电泳板上的沉淀线，到1971年，Engrall等用碱性磷酸酶标记抗原或抗体，建立了酶联免疫吸附试验（ELISA），这一技术因其高度的准确性、特异性、应用范围广、检测速度快以及费用低等优点，是目前食品检测中令人瞩目的有发展前途的一种新技术。酶免疫技术发展迅猛，种类繁多，酶免疫技术分为酶免疫组化技术和酶免疫测定技术，酶免疫测定技术又分为均相免疫测定和异相免疫测定技术，异相免疫测定技术又分为固相免疫测定技术和液相免疫测定技术。ELISA技术把抗原抗体特异性与酶反应的敏感性相结合，使食品在未经分离的提取的情况下，即可进行定性和定量分析。近年来，该技术在食品安全检测中正逐步推广应用，用于细菌及其毒素、真菌及其毒素、病毒、寄生虫的检测，Lyer MS和Cousin MA等人研究用间接ELISA法来检测食品和饲料中镰刀菌的灵敏度和特异性,可检测出102-103 cuf/mL的含量。王彩云等应用酶联免疫方法测定奶粉中的黄曲霉毒素M1，多次实验重复测定结果的变异系数最大为11.1 % ,实验的结果比较精确,重现性较好；总体平均回收率达92.5%。还用于蛋白质、激素、农业残留、兽药残留和抗生素及食品成分和劣质食品的检测分析。1993年,王勇等建立了测定三唑酮的ELISA方法,应用于黄瓜、梨等食品的检测,其最低检出限为40ng/g,回收率为92.44%-98.18% ,与用气相色谱检测的结果吻合。2006年，Al-Dujaili E A S利用ELISA方法对尿样中的睾酮进行检测，合成睾酮抗原在羊体内获得抗体，其抗稀释度可达1：200000。尿样经二氯甲烷萃取、净化、吹干、标准溶液的零样复溶后，进行ELISA检验，其灵敏度可达12pg/mL。Frank等采用不同连接臂的单环或双环半抗原分子与载体蛋白连接分别制得免疫原,包被原和酶标抗原。由双环抗原得到的抗体所建立的ELISA方法对15种磺胺药物的IC50低于100g/L。ELISA技术由于灵敏度高、特异性强、检测费用低和易于商品化，具有十分广阔的应用前景。3放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术（Radio Immunoassay,RIA）是以放射性核素为标记物的标记免疫分析法。是由Yalow和Berson于1960年创建的标记免疫分析技术。由于标记物放射性核素的检测灵敏性，本法灵敏度高，测定准确性良好，特别适应于蛋白质、激素和多肽的精确定量测定。 RIA测定就是应用放射性物质代替ELISA中的标记酶作为抗原或抗体耦联物，在食品安全检测中最常见的同位素是3H和14C。1981年，放射免疫分析法(RIA)首先用于检测人的血液和莴苣叶片上的对硫磷残留量,检测限为10-20ng/mL，检测水中的残留量可达4ng/mL1978年，Charm在RIA技术的基础上发展了放射免疫检测技术（RRA），放射免疫检测在快速检测方面最成功的是Charm6600/7600抗生素快速检测系统，该系统就是利用专一受体来识别结合于同一类抗生素族中的母环以便最快速同时检测同一抗生素族在样品中的残留情况。目前，Charm7600检测系统就内酰胺类、氯霉素类、四环素类、磺胺类、氨唑西林及碱性磷酸酶这六项检测以被FDA认可。1986年，Evrard P等对牛尿提取、浓缩后，利用放射免疫法（RIA）对其中残留的诺龙进行了检测，其灵敏度是6pg/ml，IC50值为59pg/mL。通过对免疫原的设计，使得这种方法对其代谢产物19-NA、19-NE等也有较高的交叉反应，具有较高的检出率。放射免疫技术由于可以避免假阳性，适宜于阳性率较低的大量样品检测，对水产品、肉类产品、果疏产品中的农药残留量的检测中广泛应用。还可检测经食品传播的细菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生虫及小分子物质和大分子物质。如南京农业大学用放射免疫测定牛奶中的天花粉蛋白。4免疫胶体金检测技术在食品检测中的应用 免疫胶体金检测技术又叫Rosa.Tests法，是利用胶体金颗粒进行标记的一项新技术。该技术当前主要用于在牛奶中检测抗生素，可在十分钟内快速检测牛奶中的抗生素，利用该技术可检测的抗生素种类有六种，内酰胺、四环素、磺胺二甲嘧啶、恩诺沙星和黄曲霉毒素，可检测的内酰胺药物有氨苄青霉素、阿莫西林、邻氯青霉素头孢噻呋、头孢霉素和青霉素G等。2006年，张明等人将SMZ-OVA（磺胺甲噁唑-卵清白蛋白）固相化在检测带上检测SMZ，该方法对SMZ标准溶液的灵敏度达到50ng/mL，整个检测反应在5-10min内完成，王喜亮等用胶体金标记磺胺嘧啶单克隆抗体作为显色剂，磺胺嘧啶竞争物包被于硝酸纤维素层析膜上作为捕获试剂，采用竞争反应模式制成胶体金免疫层析试纸对磺胺嘧啶残留的半定量检测。读条系统判定灵敏度为5ng/mL，肉眼判定检测限灵敏度为10ng/mL，与其它磺胺类药物无交叉反应。该方法在不同动物源性食品（鸡肉、鸡蛋、鸡肝、猪肉、猪肝、牛奶、蜂蜜）中添加磺胺嘧啶的回收率在68.11%-118.18 %范围内，动物试验样品检测结果表明，该方法与ELISA及HPLC具有好的符合率。免疫胶体金检测技术结果直观、操作简单，在食品安全检测中有广阔的应用前景。5. 单克隆抗体技术在食品检测中的应用 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成了杂交细胞即可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术为医学和生物学基础研究开创了新纪元，是免疫学领域的重大突破。单克隆抗体在食品检测中最大的优点是特异性强，不易出现假阳性。在食品检测中有广泛的应用前景。目前人们已制备出各种经食品传播和引起食物中毒的细菌及毒素、真菌及毒素、病毒、寄生虫、农药、兽药、激素等的单克隆抗体并建立的检测方法。Shirazid等采用戊二醛，青霉素化反应等不同的免疫原合成方法，免疫小鼠，筛选出单克隆抗体检测牛奶和畜产品中-内酰胺类抗生素残留，最低检测限度为2.5-5ng/mL。吴建祥用与细胞色素C交联的氨苄青霉素（Amp-Cy）免疫的BALB/c鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合，经筛选、克隆，获得3株能稳定传代并分泌抗青霉素的单克隆抗体的杂交瘤细胞（1C1，2C11K和2G7），间接竞争酶联免疫吸附试验（C I-EL ISA）显示，3株单克隆抗体对青霉素类和先锋霉素类抗生素有特异性反应，而对链霉素、卡那霉素、氯霉素、土霉素、四环素、新霉素其他抗生素没有交叉反应，可用于青霉素类抗生素残留的检测。磺胺二甲嘧啶和克伦特罗（瘦肉精）这两种药物被欧美各国和我国列为兽药残留控制重点，国内研究出了用于动物性食品中磺胺二甲嘧啶检测的单克隆抗体试剂盒和克伦特罗残留检测的多克隆试剂盒。这两种试剂盒具有特异性强、仪器化程度低、样品前处理简单、检测时间短，在实际生产中应用前景广阔，填补了国内空白。单克隆抗体检测技术可在十分钟内快速检测有机磷类、氨基甲酸酯类、有机氯类、拟除虫菊酯类及激素类的残留量为农产品的优质安全提供技术支持。英国建立了自动肉制品中的沙门氏菌的单克隆抗体检测方法，人们还制出了单核增生性李特氏杆菌的单抗，用单抗ELISA检测该菌。乳中氯霉素的单克隆抗体检测技术也被建立。食品储藏过程中会受到霉菌污染，现已从青霉、毛霉等霉菌中提取耐热性抗原制成单克隆抗体用ELISA方法可检出加热和未加热食品中的霉菌。6. 免疫测定新技术6.1脂质体免疫测定法（LIA）脂质体免疫测定法是一种较新的免疫测定技术，脂质体是由磷脂或由其他类脂分子在水相中自发形成的一种密闭的双分子单层或多层囊泡，脂质体表面还可以连接抗原或抗体分子。这种生物模拟膜在形成过程中能包裹水及其中的溶质（染料或酶），膜的稳定性可随免疫反应有规律变化。根据释放出的标记物的量进行测定，所以LIA具有很高的信号放大作用。目前