植物学硕士论文(云南岩陀岩白菜素含量变化及质量标准研究)

云南岩陀岩白菜素含量变化及质量标准研究分类号： 密级： UDC ： 编号： 硕士学位论文云南岩陀岩白菜素含量变化及质量标准研究Variation in Bergenin Content of Rhizoma Rodgersiae in Yunnan and its Quality Standard培养学院：农学与生物技术学院二O一一年四月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得云南农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名： 时间： 年 月 日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解云南农业大学有关保存、使用学位论文的管理办法及规定，即：云南农业大学有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意云南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日摘 要中药材岩陀(Rhizoma rodgersiae)为西南鬼灯檠（Rodgersia sambucifo1ia Hemsl.）或羽叶鬼灯檠（R.pinnata Franch.）的干燥根状茎，具有镇咳祛痰等功效，用于治疗慢性支气管炎等疾病。岩白菜素是岩陀的有效成分，岩陀被作为岩白菜素提取物的主要原料药材，云南省是岩陀药材的集中分布区和主产区。但尚缺乏云南地区鬼灯檠属植物岩白菜素含量变化规律的系统研究。岩陀作为一种大宗的提取物原料类药材，其质量标准仅见于云南省药品标准(1974、1996)和中国药典(1977)，质量标准滞后成为限制岩陀药材应用的重要问题。本研究对云南地区岩陀的2种原植物及其近缘种的4种鬼灯檠属植物种间及其居群间与居群内个体间的岩白菜素含量进行了较为系统的比较，对岩陀药材质量标准进行了研究，以期为岩陀种源的筛选及资源的开发利用奠定基础。研究结果如下：（1）超声波提取50min，采用C18色谱柱(4.6mm150mm,5m)，以乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)为流动相梯度洗脱(0-20min，0-20%A)，流速1.0mL/min，柱温30，检测波长275nm，加样回收率和线性关系良好，可以作为测定岩陀药材岩白菜素含量的方法。（2）云南地区鬼灯檠属植物4个种和变种的岩白菜素含量，西南鬼灯檠含量变化在4.73%6.61%之间，平均为5.59%，富民居群最高，玉龙居群最低；羽叶鬼灯檠岩白菜素含量变化在2.97%-5.30%之间，平均为3.37%，鹤庆居群最高，洱源居群最低；七叶鬼灯檠（R. aesculifolia Batalin）的富源居群含量5.39%，泸水居群含量为1.53%，平均为3.45%；光腹鬼灯檠（R. sambucifolia Hemsl. var. estrigosa J. T. Pan）的宁蒗居群含量为4.79%，兰坪居群含量为4.22%，平均为4.51%；西南鬼灯檠同一居群内不同个体间的岩白菜素含量变异丰富，变化在2.50%7.50%间，呈正态分布，变异系数为34.15%。药材断面颜色越深，岩白菜素含量就越高，深色断面的药材含量最高。岩陀原植物西南鬼灯檠的品质优于羽叶鬼灯檠，非岩陀原植物的同属植物七叶鬼灯檠和光腹鬼灯檠也具有作为岩陀提取岩白菜素的潜在价值。同种不同地理居群及其同一居群的不同个体间岩白菜素含量存在较大差异，通过居群及其个体选择可筛选高岩白菜素含量的原植物基因型。岩陀断面颜色可作为岩陀优质药材评价和育种选择的感官指标。（3）基于岩陀药源植物形态、药材鉴定、显微鉴定、灰分含量、水分含量、浸出物和岩白菜素含量分析，建立了岩陀药材质量标准，相关指标暂定为：水分含量不高于10.0%，总灰分不高于15.0%，酸不溶灰分不高于13.0%，水溶性浸出物含量不低于5.0%，岩白菜素含量不低于2.5%。（4）建立了岩陀药材的HPLC指纹图谱，确定了12个共有峰，相对保留时间的RSD为0.005-0.019，相对峰面积的RSD为0.095-0.185，12批样品的相似度均大于0.90，方法简单可靠，可用于岩陀药材的质量控制。关键词：岩陀；岩白菜素；鬼灯檠属；质量标准Variation in Bergenin Content of Rhizoma Rodgersiae in Yunnan and its Quality StandardABSTRACTRhizoma Rodgersiae, one of Chinese medicinal materials, is the dry rhizome from Rodgersia sambucifo1ia Hemsl. or R. pinnata Franch. It can be used in the treatment of some disease such as chronic bronchitis because its antitussive and expectorant effects. Bergenin, the effective component of Rodgersia extract, is extracted from rodgersia mainly. The Yunnan province is the concentrated distribution area and production area of ethnodrug R.sambucifolia Hemsl. As a kind of large amount raw materials, Rodgersias quality standards were found in Yunnan province drug standard (1974、1996) and Chinese Pharmacopoeia(1977) only. The bergenin content of two kind of Rodgersia original plant, interspecific and interindividual bergenin content of 4 Rodgersia species were compared systematically in this research. The quality standard was studied too to lay a foundation of high quality resources selection and resources development and utilization. The result showed that:1. The ultrasonic extraction time was 10 min. The Agilent Zorbax XDB-C18 column (4.6 mm150 mm, 5 m) and a binary mobile phase of acetonitrile and 0.02% phosphoric acid solution were used with flow rate of 1.0 mL/min in 30. The detection wavelength was 236 nm. The average recovery and linear relationship were good, so this method could be used for bergenin content in ethnodrug Rhizoma Rodgersiae. 2. The bergenin content of 4 Rodgersia species and varieties from Yunnann area is as follows: The Bergenin content of R. sambucifo1ia Hemsl. is in the range of 4.73%6.61% with the average content of 5.59%. The highest and lowest population are Fumin and Yulong respectively. The Bergenin content of R pinnata Franch. is in the range of 2.94%-5.30% with the average content of 3.37%. The highest and lowest population come from Heqing and Eryuan respectively. The bergenin content of R. aesculifolia Batal in Fuyuan and Lushui are 5.39% and 1.53% respectively with the average content of 3.45%.The bergenin content of R. sambucifolia Hemsl. var. estrigosa J. T. Pan in Ninglang and Lanping is 4.79% and 4.22% respectively with the average content of 4.51%. The bergenin content of R.sambucifo1ia Hemsl. among different individuals within same population changed greatly. The bergenin content was in the range of 2.50%7.50% and showed normal distribution with the variation coefficient of 34.15%. The sectional color is higer, the bergenin content is darker, the bergenin content is higher. The quality of rodgersia original plant R.sambucifo1ia Hemsl. is better than R.pinnata Franch. The congeneric non-original plant R.aesculifolia Batali and R.sambucifolia Hemsl. var. estrigosa J. T. Pan have potential value for bergenin extract. There were greater differences in bergenin content of different Rodgersia cospecies populations or different individuals from the same population. The high Bergenin content original plant could be selected with population and individual selection. The sectional color of rodgersia could be used as sensory index for high quality medicinal material evaluation and breeding. 3. The quality standard of Rhizoma Rodgersiae was established based on Rodgersia plant morphological identification, medicinal material identification, microscopic identification,defined temporarily as follows: water content no higher than 10.0%, total ash content no higher than 15.0%, acid-insoluble ash content no higher than 13.0%, water extract content no less than 5.0%, Bergenin content no less than 2.5%. 4. The HPLC fingerprint has been established in this research. There were 12 common peak has been determined, the ralative retention time RSD is 0.005-0.019 and the relative peak area RSD is 0.095-0.185. The similarity of 12 batches of sample was higher than 0.90. The method is simple and reliable, could be used for the quality control of Rhizoma Rodgersiae.Key words: Rhizoma Rodgersiae Bergenin Rodgersia Quality StandardIV目 录1 前言11.1 植物岩白菜素含量测定方法11.1.1 提取方法11.1.2 检测方法11.2 植物的岩白菜素含量分布与变化21.2.1 岩白菜素含量的分布21.2.2 岩白菜素含量的变化31.3 岩陀岩白菜素含量分布与变化研究进展41.3.1 鬼灯檠属植物不同种间岩白菜素含量的差异41.3.2 鬼灯檠属植物岩白菜素含量的产地差异41.3.3 岩陀中岩白菜素含量的差异51.4 岩陀质量标准研究进展51.4.1 中药材质量评价的研究51.4.2 岩陀质量标准研究的现状61.5 本研究的目的意义62 材料与方法72.1 试验材料与仪器72.1.1 试验材料72.1.2 试剂与仪器102.2 试验方法102.2.1 岩陀岩白菜素提取及含量测定条件优化102.2.1.1 HPLC色谱条件优化102.2.1.2 标准曲线回归方程与相关系数102.2.1.3 方法精密度测定102.2.1.4 方法准确度测定112.2.1.5 加样回收试验112.2.1.6 稳定性试验112.2.2 岩陀岩白菜素含量变化规律112.2.2.1 不同种及其居群鬼灯檠属植物岩白菜素含量测定112.2.2.2 同一居群不同个体的岩白菜素含量变化规律112.2.2.3 岩陀块根断面颜色与岩白菜素含量的关系122.2.3 岩陀药材质量标准研究122.2.3.1 岩陀的采集鉴定122.2.3.2 水分测定122.2.3.3 灰分测定122.2.3.4 浸出物测定132.2.4 中药材岩陀指纹图谱的构建133 结果与分析143.1 岩陀岩白菜素含量测定方法的优化143.1.1 色谱条件选择143.1.2 标准曲线回归方程与相关系数153.1.3 方法精密度163.1.4 方法准确度163.1.5 加样回收率163.1.6 稳定性试验163.2 岩陀岩白菜素含量的变化163.2.1 鬼灯檠属不同种及其居群岩白菜素含量163.2.2 岩陀居群内个体间岩白菜素含量的分布183.2.3 岩陀块根断面颜色与岩白菜素含量的关系183.3 岩陀药材质量标准的研究193.3.1 原植物形态及药材性状193.3.2 显微鉴定223.3.3 水分含量233.3.4 药材灰分测定243.3.4.1 总灰分测定243.3.4.2 酸不溶灰分测定253.3.5 浸出物253.3.6 岩白菜素含量263.4 岩陀指纹图谱的构建263.4.1 精密度试验相似性分析263.4.2 重复性试验的相似性分析273.4.3 稳定性试验的相似性分析283.4.4 色谱分析284 讨论314.1 岩陀岩白菜素含量的HPLC测定方法的优化314.2 云南岩陀及其近缘植物岩白菜素含量的差异314.3 云南鬼灯檠属植物同种不同产地的差异314.4 云南岩陀居群内不同个体岩白菜素含量的变化324.5 云南岩陀断面颜色与岩白菜素含量相关性324.6 岩陀药材质量标准335 结论35参考文献36攻读硕士学位期间撰写的论文41致 谢42iii云南岩陀岩白菜素含量变化及质量标准研究1 前言岩陀为西南鬼灯檠（Rodgersia sambucifo1ia Hemsl.）或羽叶鬼灯檠（Rodgersia pinnata Franch.）的干燥根状茎，是云南地区傈僳族、苗族、白族习用的药物，味苦、涩，性平，具有镇咳祛痰等功效，用于治疗慢性支气管炎等疾病1 2。岩白菜素(Bergenin，C14H16O9)又称岩白菜内酯、鬼灯檠素、矮茶素等，广泛的存在于多种药用植物中，岩陀中岩白菜素含量高，被作为提取岩白菜素的原料药材。西南鬼灯檠和羽叶鬼灯檠为虎耳草科（Saxifragaceae）鬼灯檠属（Rodgersia）多年生草本植物，主要分布于云南、贵州、四川、陕西、安徽等地区的高山阴湿环境中，云南省是岩陀药材的集中分布区和主产区。岩白菜素作为岩陀的主要有效成分，其含量的变化规律倍受人们关注。作为一种大宗的提取物原料类药材，岩陀的质量标准仅见于中国药典(1977)1和云南省药品标准 (1974、1996) 2 3，质量标准提升成为岩陀药材开发应用的重要问题。1.1 植物中岩白菜素含量测定方法1.1.1 提取方法在药用植物中提取岩白菜素的方法包括：超声波提取法4-7、超临界CO2萃取法9、浸提法、索氏提取法等。浸提法、索氏提取法属于传统提取方法，虽然传统提取法易操作，但普遍存在着效率低、杂质多、能耗大、提取周期长、溶剂耗费量大等缺点。因此，需要有新的方法来弥补传统方法的不足。超声波提取法和超临界萃取法都具有效率高，快捷，杂质少等特点，可弥补传统提取法的不足7，但仍存在一定的缺陷需要进一步研究完善。1.1.2 检测方法检测药用植物中岩白菜素的含量方法有很多，如比色法、紫外分光光度法、薄层扫描法10、高效液相法11等。王俊平等6将鬼灯檠中岩白菜素用甲醇提取后，于层析滤纸上展开层析进行检测。董留民12将使用索氏提取法制得样品液然后采用薄层扫描法对鬼灯檠中的岩白菜素进行扫描测定。郭珍等用紫外光谱法测定鬼灯檠中岩白菜素含量，该方法操作简单，准确性好，但吸光度会随时间衰减，因此存在时间限制。目前普遍利用高效液相法 (HPLC法)检测岩陀10、朱砂根11等岩白菜素药源植物中的岩白菜素含量。在检测过程中首先对药材进行处理得到样品溶液，用甲醇、超纯水作为流动相，利用岩白菜素标准品制定标准曲线，然后进行样品溶液岩白菜素含量的测定。在前人研究中发现高效液相色谱法普遍应用于不同产地虎耳草、西藏产2种岩白菜、紫金牛属药用植物、3种落新妇、鬼灯檠中等植物中岩白菜素的含量的测定，高效液相法的特点有：方法简便、灵敏度较高、稳定性较好，精密度、重现性等均符合研究的技术要求，并且准确可靠。1.2 植物的岩白菜素含量分布与变化1.2.1 岩白菜素素的分布自然界中含岩白菜素的植物种类非常丰富。根据前人研究结果总结含有岩白菜素的植物有以下科属：虎耳草科（Saxifragaceae）：鬼灯檠属Rodgersia13、岩白菜属Bergenia14、落新妇属Astilbe15、虎耳草属Saxifraga16、涧边草属Peltoboykinia17紫金牛科（Myrsinaceae）：紫金牛属Ardisia18忍冬科 （Caprifoliaceae）：荚蒾属Viburnum19大戟科（Euphorbiaceae）：野桐属Mallotus20、白饭树属Fluggea21、一叶萩属Securinega22、算盘子属Glochidion23、叶下珠属Phyllanthus24、血桐属Macaranga25豆科（Leguminosae）：盾柱木属Peltophorum26、云实属Caesalpinia27、含羞草属Mimosa28、五山柳苏木属Pentaclethra29无患子科（Sapindaceae）：异木患属Allophylus30香膏科（Humiriaceae）：Sacoglottis属31、Humiria属32景天科（Crassulaceae）：红景天属Rhodiola33买麻藤科（Gnetaceae）：买麻藤属Gnetum34牛栓藤科（Gonnaraceae）：牛栓藤属Connarus35金缕梅科（Hamamelidaceae）：腊瓣花属Corylopsis36、牛鼻栓属Fortunearia36龙脑香科（Dipterocarpaceae）：娑罗双属shorea37、坡垒属Hopea38、青梅属Vatica39-41、瓦特香属Vateria42菊科（Compositae）：Vicoa属43苦苣苔科（Gesneriaceae）：马铃苣苔属Oreocharis44胡桃科（Juglandaceae）：青钱柳属Cycltcarya45山柚子科（Opiliaceae）：甜菜树属Yunnanopilia46葡萄科（Vitaceae）：白粉藤属Cissus47桃金娘科（Myrtaceae）：蒲桃属Syzygium48千屈菜科（Lythraceae）：虾子花属Woodfordia49桑科（Moraceae）：榕属Ficus50在以上20科的38属的植物中研究发现含有岩白菜素。不同科、不同属、不同种植物之间岩白菜素含量差异很大，虎耳草科鬼灯檠属、岩白菜属、落新妇属的植物中含量高，应用多；紫金牛科紫金牛属中含有岩白菜素的植物种类最多，有28个种和变种。岩白菜、厚叶岩白菜，羽叶鬼灯檠、七叶鬼灯檠、落新妇、大落新妇、多花落新妇，紫金牛、朱砂根等是我国传统的民族民间草药，主要具有止咳、抗菌消炎等药用价值。朱砂根、紫金牛、岩陀、岩白菜被列入中国药典，岩陀和岩白菜录入了云南省药品地方标准。含有岩白菜素的许多植物，与法定的岩白菜素药源植物用药基础相同，岩白菜素含量超过1.5%的植物，也具有潜在的开发利用价值。1.2.2 岩白菜素含量的变化根据对有岩白菜素药源植物研究的文章的总结中发现，发现岩白菜素含量最高的植物为虎耳草科Saxifragaceae的植物，岩白菜属Bergenia的岩白菜B. purpurascens (Hook. f. et Thoms.) Engl.在岩白菜各部位均有岩白菜素分布13，其中岩白菜根茎为含量最高的部位，具体含量在5.14%7.46%14 51，另外对岩白菜属其他种的植物中岩白菜素含量也相对较高，厚叶岩白菜B. crassifolia (L.) Fritsch根茎4.5%52，舌岩白菜B. pacumbis (Buch.-Ham.) C.Y. Wu et J. T. Pan根与根茎0.907%3.03%53；其次是该科的鬼灯檠属Rodgersia植物，在该属中有报道的是七叶鬼灯檠R. aesculifolia Batal. 根与根茎的岩白菜素含量1.32%6.07%12 13 54，西南鬼灯檠R. sambucifolia Hemsl.根茎在4.29%4.63%51 55，羽叶鬼灯檠R. pinnata Franch.根茎2.97%4.14%55；该科的落新妇属植物Astilbe植物15 56中的落新妇A. chinensis (Maxim.) Franch et Savat.根与根茎3.78%5.79%15，大落新妇A. grandis stapf ex Wils.的根茎中含量为1.04%5.65%56 57，大果落新妇A. macrocarpa knoll 中含量为4.52%23，多花落新妇A. rivularis Buch.-Ham. ex D. Don var. myriantha (Diels) J. T. Pan根茎中岩白菜素含量为3.82%58；华南落新妇A. austrosinensis Hand.-Mazz.的根茎中含量为1.25%57；该科的涧边草属Peltoboykinia中的P. watanabei根茎中含量5%59。紫金牛科的紫金牛属植物中也含有丰富的岩白菜素，在对红凉伞A. crenata Sims var. bicolor (Walker) C. Y. Wu et C. Chen的研究中发现它的根中含岩白菜素量为4.036%10，朱砂根A. crenata sims的含量在1.70%3.858%18 60 61，矮地茶A. japonica (Thunberg) Blume全株的含量1.02%3.25%10 60；酸苔菜A. solanacea Roxb.的含量1.80%1.883%10 60，罗伞树A. quinquegona Blume全株的含量1.29%10 60；莲座紫金牛A. primulaefolia Gardn. et Champ.全草1.11%10 60，虎舌红A. mamillata Hance0.632%0.684%61，九节龙A. pusilla A. D C.全株0.52%0.141%10 60，九管血A. brevicaulis Diels全株0.507%10 ，珍珠伞A. maculosa Mez全株0.459%；月月红A. faberi Hemsl.全株0.478%，白花紫金牛A. merrillii Walker全株0.295%；百两金A. crispa (Thunb.) A. D C.根0.279%。除此之外的其他科属的植物中也还有岩白菜素，但含量均较低。1.3 岩陀岩白菜素含量分布与变化研究进展1.3.1 鬼灯檠属植物不同种间岩白菜素含量的差异鬼灯檠属（Rodgersia）全世界共5种3变种1，分别是鬼灯檠（Rodgersia podophylla A. Gray）、七叶鬼灯檠（R. aesculifolia Batalin）及其变种滇西鬼灯檠（R. aesculifolia Batalin var. henricii (Franch.) C. Y. Wu）、西南鬼灯檠及其变种光腹鬼灯檠（R. sambucifolia Hemsl. var. estrigosa J. T. Pan）、羽叶鬼灯檠及其变种伏毛鬼灯檠(R. pinnata var strigosa)、尼泊尔鬼灯檠（R. nepalensis），我国产4种3变种62-63。这四种鬼灯檠属植物均有相当的岩白菜素含量。西南鬼灯檠、羽叶鬼灯檠等均为岩陀的药材基源，其他鬼灯檠属植物也与岩陀64具有相似的用药基础。岩白菜素是鬼灯檠属植物主要有效成分63，因此岩白菜素含量的变化成为人们关注的重要问题。在对甘肃、云南、陕西、河南等鬼灯檠属植物的岩白菜素含量研究中发现岩白菜素含量最高的是基于紫外光谱法测定的甘肃省天水及陇南山区的鬼灯檠，其岩白菜素的含量为5.716.1566；次之为基于HPLC法测定的产自云南滇西北地区的西南鬼灯檠，其岩白菜素含量为4.29%4.63%51 55；而后是基于HPLC法测定的大理地区的羽叶鬼灯檠和基于分光光度法测定七叶鬼灯檠，其岩白菜素含量分别为2.97%4.14%51和1.32%6.07%12 13 54。通过分析，可以得出鬼灯檠66中岩白菜素含量差异较小，且平均含量较高；西南鬼灯檠中的岩白菜素含量也较为稳定；羽叶鬼灯檠中的岩白菜素含量略低于西南鬼灯檠但其含量变化幅度较西南鬼灯檠大；七叶鬼灯檠中的岩白菜素含量的变化幅度最大。1.3.2 鬼灯檠属植物岩白菜素含量的产地差异西南鬼灯檠多产自云南、贵州等地。目前已对云南滇西北少数地区的西南鬼灯檠的岩白菜素含量做了初步研究，研究中发现产于玉龙县鲁甸乡的西南鬼灯檠中的岩白菜素含量最高，达到4.63%51，而玉龙雪山的为4.35%51、宁蒗为4.30%51、玉龙县鸣音乡为4.29%51；产自大理地区的羽叶鬼灯檠中的岩白菜素含量为2.97%4.14%55、剑川为4.14%55、苍山三阳峰为4.07%55、云龙县为2.97%55；在前人研究中测得的七叶鬼灯檠中的岩白菜素含量为2.621%5.29%12 13 54；在对陕西十一个县的鬼灯檠属植物研究中发现其最终采收期时岩白菜素含量为3.094.48%；河南省栾川县伏牛山区龙峪湾的鬼灯檠属植物的岩白菜素含量平均值为2.658%26。在现有的研究中观察到鬼灯檠属植物中，其不同部位的岩白菜素含量也不同。在七叶鬼灯檠植株中，岩白菜素含量最高的部位是根状茎，其次是叶片，茎枝中的岩白菜素含量是最低的。而在不同的采收期中岩白菜素含量的变化规律则是从5月份到11月份从高到低再度升高的规律，春季5月前及秋季10月后的时间内，其岩白菜素含量较其他月份高，旺盛生长期的68月植株中的岩白菜素含量仅为采收期(即10到第二年5月)含量的一半26。根据研究可推断同种的鬼灯檠属植物由于生长地区的不同，其岩白菜素含量也会有较大的差别。1.3.3 岩陀中岩白菜素含量的差异中药材岩陀是指西南鬼灯檠和羽叶鬼灯檠干燥根茎。在陈文文等65研究中测得的岩陀中岩白菜素含量平均值为2.67%，吕丽芬等49测定的大理玉龙境内岩陀中岩白菜素含量为4.29%4.23%，段新瑜等55检测结果为岩陀中岩白菜素含量大于4.30%。除不同产地的岩陀的岩白菜素含量存在差异，研究中还发现根据采集季节不同，其岩白菜素含量也存在明显差异，并有一定规律，与同属植物存在相似性。鬼灯檠属中岩陀的岩白菜素含量仅次于鬼灯檠中的岩白菜素含量，是一种资源较丰富的岩白菜素药源植物。岩白菜曾经是主要岩白菜素药源植物，但是经过长期过度的开发利用，导致其在20世纪90年代中期已濒于枯竭。虽然近几年岩白菜素可以进行人工合成67，但造价较高，因此具有较高岩白菜素含量的岩陀逐渐引起人们的重视。1.4 岩陀质量标准研究进展1.4.1 中药材质量评价的研究随着现代科学技术的发展和对药物的研究开发，市场上对天然药物的需求越来越大，为中药研究提供了重大的机遇。过去对中药材的研究缺乏客观的反映其质量标准的依据，因此要根据标准化规定制定中药材质量标准。随着科技的进步，中药材质量标准的制定方法也要相应的提高，要实现现代化中药质量标准的制定需要采取高科技手段，准确、快速的检测药材是否达到标准。完善中药材质量标准可以进一步规范化中药材市场，为科学使用中药材提供依据。对中药材质量来讲必须从整体上全面的研究，并根据科学手段的提高不断补充缺漏的部分，这样中药材质量标准才有实用意义和科学的依据68 69。在制定中药材质量标准时，除去对产地、资源调查与研究、水分、灰分、浸出物等常规的研究方面还需增加许多新的研究方法来辅助药材质量标准指定。如色谱法检测，此方法简单、快速，准确、方便使用68，对GAP基地生产与质量控制实用性强。可直观快捷地反映药材的内在质量。健全中药材质量标准对发展现代中药产业实现中药现代现代化管理具有重要意义，同时也是解决中药产业持续发展利用的首要任务。1.4.2 岩陀质量标准研究的现状岩陀作为原料提取类药材，被收载于中国药典（1977版）1，并被列入了云南省药品标准（1974版和1996版）2 3。但是1977版药典仅对岩陀的药源植物性状、炮制方法、性味和功能用法用量贮藏进行了简单的介绍，不能全面地反映岩陀的整体情况。现在我国对药材质量标准的规范化制订已经相对的更加完善，1977版中国药典里的质量标准已经不能适应该需求，无法满足当前对岩陀药材质量评价的要求。当前对中药材保护和研究已经得到国家的广泛重视，对药材的质量标准研究的规范化能增加国际认可度，对产品质量稳定性的控制有促进作用。岩陀作为单一成分的提取原料类药材，目前尚无关于其所含成分指标岩白菜素含量的HPLC标准。需要利用先进的科学手段68-69建立可行的质量标准来监测岩陀的资源和质量。目前对岩陀的研究绝大多数存在于对其化学成分方面的研究，缺乏对岩陀的综合质量评价的研究和较全面的反映岩陀整体情况的质量标准研究报道。由于前人对岩陀的一般鉴别试验几乎没有可查阅的报道，因此对岩陀的药材质量标准应该从最基本的研究内容开始制订。可借鉴当前中药材研究方法，在已确定该药材的药用价值之后，可利用高效液相指纹图谱法来鉴别药材的真伪和药材质量稳定性，引进新的研究技术来完善岩陀药材标准的制订，建立完善科学的质量标准作为依据来监测云南地区岩陀的药材质量。1.5 本研究的目的意义岩白菜素是岩陀的有效成分，岩陀可以作为岩白菜的代替品，岩白菜素提取物的主要原料药材。云南省是岩陀药材的集中分布区和主产区，但尚缺乏云南地区鬼灯檠属植物岩白菜素含量变化规律的系统研究。岩陀作为一种大宗的提取物原料类药材，其质量标准仅见于中国药典(1977) 1和云南省药品标准(1974，1996) 2 3，质量标准滞后成为限制岩陀药材应用的重要问题。本研究对云南地区4种鬼灯檠属植物种间及其居群间与居群内个体间的岩白菜素含量进行了较为系统的比较，对岩陀药材质量标准进行了研究，以期为岩陀种源的筛选及资源的开发利用奠定基础。2 材料与方法2.1 试验材料与仪器2.1.1 试验材料岩陀及其近缘鬼灯檠属植物种及其居群的岩白菜素含量、药材质量标准及指纹图谱研究的试验材料均选取2008年9月李萍萍采自云南省岩陀主产区15个县（市、区）的15份岩陀药材（表21）73。物种经云南农业大学中药材与植物科学系郭凤根教授鉴定。药材采挖后于室内阴干备用。同一居群不同个体的西南鬼灯檠岩白菜素含量变化规律材料于2010年9月采自云南省富民县永定镇大风丫口海拔3030m的野生居群。药材采挖后于室内阴干备用。30表21 岩陀及其近缘植物的采集地及其生境Tab. 21 Habitat and Locality of R. sambucifo1ia and Relative plants编号Code种及变种Species (Variation)地点Locality东经E北纬N海拔(m)Altitude年均温()Mean annual temperatures年均降水量(mm)Mean annual precipitationHZ西南鬼灯檠会泽县金钟镇金钟山1044040272134240510.8822SL西南鬼灯檠禄劝县撒营盘镇一叫凹1033726255926189813.6966LP西南鬼灯檠罗平县九龙镇六白大山1042758251806182812.81743YS西南鬼灯檠永胜县南华乡老巢山1043804255824232312.3924YL西南鬼灯檠玉龙县黄山镇文笔山1003506271424191516.1958SM西南鬼灯檠嵩明县嵩阳镇小团山1030600255646218812.1992FM西南鬼灯檠富民县永定镇大风丫口100312826002630307.0846MC羽叶鬼灯檠鹤庆县草海镇马厂100323226555232316.81035表21 岩陀及其近缘植物的采集地及其生境Tab. 21 Habitat and Locality of R. sambucifo1ia and Relative plants（continuing）编号Code种及变种Species (Variation)地点Locality东经E北纬N海拔(m)Altitude年均温()Mean annual temperatures年均降水量(mm)Mean annual precipitationJD羽叶鬼灯檠兰坪县金顶镇哑巴箐100315626552832084.01008DL羽叶鬼灯檠大理市观音堂感通山100315226001430488.31078EY羽叶鬼灯檠洱源三营乡东山100104826211628308.9746FY七叶鬼灯檠富源县大河镇圭山1043810260118232810.91094LW七叶鬼灯檠泸水县老窝乡自奔山99314425025828842.11079NL光腹鬼灯檠宁蒗县大兴镇观音庙1012916265422233411.4900ZP光腹鬼灯檠兰坪县中排乡元宝山1001410273128282810.31188注：气象资料来源于云南地州市县概况，其中年平均气温县城所在地海拔和采集地海拔按照海拔每升高100米，气温降低0.6进行折算。 Meteorological dates come from the state city and county profiles of Yunnan. The annual mean temperature of the sampling sites was calculated according to the altitude differences between the sampling sites and corresponding county towns using the rule that the altitude goes up every 100 meters, the temperature lowers 0.6.2.1.2 试剂与仪器分析工作在国家农科中心进行，甲醇和乙腈为色谱纯，由德国默克公司生产；磷酸和乙醇为市售分析纯；试验用水为超纯水；岩白菜素对照品（批号：477-90-7）由中国药品生物制品检定所提供。主要仪器有Agilent1200型高效液相色谱仪，由美国Agilent公司生产，配有在线脱气机、四元泵、柱温箱、VWD检测器；FW80高速万能粉碎机，由北京中兴伟业仪器有限公司生产；SB-5200DTS超声波清洗机，由宁波新芝生物科技股份有限公司生产；超纯水器；AL104电子天平（精确至0.001g），由梅特勒-托利多仪器（上海）有限责任公司生产；BSA124S电子天平（精确至0.0001g），由赛多利斯科学仪器生产。2.2 试验方法2.2.1 岩陀岩白菜素提取及含量测定条件优化2.2.1.1 HPLC色谱条件优化流动相分别选择纯水、纯水-0.2%磷酸水溶液、甲醇-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液，对比相同样品在不同流动相洗脱下岩白菜素的分离，峰形、对称度，得出最佳的流动相。洗脱条件的选择对比梯度洗脱和等度洗脱，设定不同洗脱方式，进行选择。2.2.1.2 标准曲线回归方程与相关系数分别将6g/ml、12g/ml、24g/ml、48g/ml的对照品储备液注入高效液相色谱仪中。以峰面积的积分值定量，以进样量（g）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，并进行回归分析。2.2.1.3 方法精密度测定取岩白菜素对照品（48g/ml）溶液，连续进样5次，每次进样10l。分别测定峰面积计算RSD。2.2.1.4 方法准确度测定精密称取同一批样品粉末5份，每份0.1g，分别按样品制备方法处理，进样10l，在给定的色谱条件下测定岩白菜素的峰面积，计算RSD。2.2.1.5 加样回收试验称取5份已测知含量的同一批样品粉末0.1g，分别添加对照品6-8（岩白菜素48g/L溶液1ml），按样品溶液制备方法，测得岩白菜素峰面积，计算回收率。2.2.1.6 稳定性试验将同一批样品粉末0.1g制备样品液，隔0、2、4、6、8h进样10l，在选定的色谱条件下测定岩白菜素的峰面积，计算RSD值。2.2.2 岩陀岩白菜素含量变化规律2.2.2.1 不同种及其居群鬼灯檠属植物岩白菜素含量测定在随机抽取不同种的样株供试样品分别阴干后，再放入烘箱中60烘干后用粉碎机粉碎，每个居群按一定比例随机取