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维生素类药物的分析 第九章 主讲人肖国君 维生素 是维持人体正常代谢机能所必需的微量营养物资 人体不能合成维生素 脂溶性 VitA D E K1等 水溶性 VitB族 B1 B2 B6 B12 VitC 叶酸 烟酸 烟酰胺 VitPP H维生素A醇 COCH3维生素A醋酸酯 COC15H31维生素A棕榈酸酯 R 第一节维生素A的分析 一 结构与性质 具有共轭多烯醇侧链的环己烯 1 2 3 4 5 6 7 8 9 具有UV吸收 存在多种立体异构化合物 易发生脱氢 脱水 聚合反应 易被氧化 性质 VitA 紫外线 O2 氧化剂 环氧化物 O VitA醛或酸 维生素A全反式325 5100 新维生素Aa2 cis32875 新维生素Ab4 cis320 524 新维生素Ac2 4 dicis310 515 异维生素Aa6 cis32321 异维生素Ab2 6 dicis32424 相对生物效价 结构 去氢 脱水 VitA2 VitA3 聚合 鲸醇 VitA 环氧化物 VitA醛 VitA酸 一 三氯化锑反应 CHCl3 二 鉴别试验 条件无水 无醇 VitA SbCl3 蓝色 紫红色 二 UV法 BP VitA 无水乙醇 HCl 去水VitA max为326nm一个吸收峰 max为350 390nm三个吸收峰 VitA 去水VitA VitA3 BP USP对照品法显色剂磷钼酸 三 TLC法 三 含量测定 一 UV法 立体异构体氧化产物及光照产物合成中间体去氢维生素A VitA2 去水维生素A VitA3 三点校正法 VitA的含量表示 生物效价 IU g 1IU 0 344ug全反式VitA醋酸酯 0 300ugVitA醇 VitA醋酸酯 VitA醇 1IU 0 344ug 0 300ug 效价 1IU g 2 907 106 3 33 106 1900 328nm 1530 325nm 1820 1830 换算因子 InternationalUnit 结果计算公式为 效价 换算因子 第一法等波长差法测定对象VitA醋酸酯 328 316 340 328 第二法等吸收度法 皂化法 测定对象VitA醇 6 7A 1 A 2 A 3 波长的选择 三点校正法 三点校正法第一法等波长差法 316 328 340 第二法 等吸收比法 A 2 A 3 6 7A 1 测定方法 1 第一法维生素A醋酸酯 按表中各波长分别测定吸收度 计算Ai A328 规定吸收度比值 判断方法 1 若 max 326 329nm Ai A328 测 规定值 0 02则用A328处的测得值计算 2 若 max 326 329nm 有 Ai A328 测 规定值 0 02则用校正公式校正后计算f值再判断 A328 校正 3 52 2A328 A316 A340 若f值在 3 以内 仍以未校正的A328计算 若f值在 15 3 以内 用校正后的A328 校正 计算 若f值 3 或 15 采用第二法测定 f 例 VitAD胶丸中VitA的含量测定精密称取本品 规格10000VitAIU 丸 装量差异项下 平均装量0 08262g 丸 的内容物0 2399g至250ml量瓶中 用环己烷稀释至刻度 摇匀 精密量取2 0ml 置另一20ml量瓶中 用环己烷稀释至刻度 摇匀 以环己烷为空白 测定最大吸收波长为328nm 并在下列波长处测得吸收度为 A300A316A328A340A3600 3540 5610 6280 5230 216 求本品中维生素A的标示百分含量 A300 A328A316 A328A328 A328A340 A328A360 A3280 5550 9071 0000 8110 299 规定值 1求吸收度比值与规定值之差值 A300 A328 0 564A316 A328 0 893A328 A328 1 000A340 A328 0 833A360 A328 0 344 0 5550 9071 0000 8110 299 0 01 0 010 0 02 0 04 3计算f值 2计算A328 校正 4计算标示百分含量 VitA效价 IU g 校正 1900 标示 VitA效价 平均丸重 标示量 100 C g 100ml 适用于维生素A醇 第一法无法消除杂质干扰时用此法 2 第二法 等吸收度法 皂化法 判断方法 1 若 323 327nm 且A300 A325 0 73 则用公式校正后判断 若f值在 3 以内 仍以未校正的A325计算 若f值超过了 3 则用A325 校正 计算 2 若不在323 327nm范围内或A300 A325 0 73 则用色谱法测定 二 三氯化锑比色法标准曲线法 优点简便快速 max618nm 620nm 缺点 呈色不稳定 5 10s内 水分干扰 与标准曲线温差 1 专属性差 三氯化锑有腐蚀性 三 HPLC RP HPLC同时测定人血清中VitA和VitE含量 色谱条件 色谱柱 C18流动相 甲醇 水流速 1 2ml min检测波长与AUFS 0 8min 330nm 0 25AUFS 8min后 292nm 0 05AUFS 内标 VitA酯 VitA VitE 苯并 二氢吡喃环 带有脂肪侧链R1 R2和乙酰化酚羟基 又称生育酚醋酸酯 一 结构与性质 第二节维生素E的分析 名称 R1 R2 相对活性 生育酚 生育酚 生育酚 生育酚 CH3 CH3 H H CH3 H CH3 H 1 0 0 5 0 2 0 1 性质 1 苯环 UV法 2 酯键 易水解 水解产物生育酚易被氧化 3 有手性碳原子 有立体异构体 天然产品一般是d型 右旋 合成品是消旋体 dl型 VitE dl TocopherylAcetate 75 15 一 硝酸反应 橙红色 二 鉴别试验 VE HNO3 生育红 生育酚 HNO3 生育红 橙红色 二 三氯化铁 联吡啶反应 VE KOH 生育酚 Fe3 对 生育醌 Fe2 2 2 联吡啶 血红色 生育酚 Fe3 对 生育醌 红色 三 UV法 0 01 无水乙醇中 max 284nm min 254nm 41 0 45 5 维生素EUV图 薄层板硅胶G 展开剂环己烷 乙醚 4 1 显色剂硫酸 105 5 VitERf 0 7 无水乙醇 2Ce4 2Ce3 利用生育酚的易氧化性 原理 一 三 杂质检查 VitE醋酸酯中生育酚的检查 铈量法 滴定剂 硫酸铈滴定液Ce SO4 2 0 01mol L 终点指示 二苯胺 亮黄 灰紫 二氢吡啶类药物 邻二氮菲 亚铁 吩塞嗪类药物 自身指示法 取本品0 10g 加无水乙醇5ml溶解后 加二苯胺试液1滴 用硫酸铈液 0 01mol L 滴定 消耗硫酸铈液 0 01mol L 不得过1 0ml 例 2 15 规定限量 若硫酸铈液浓度不是0 01000mol L 应重新计算硫酸铈的消耗量 二 注意 设 应消耗硫酸铈液 Vml 0 01 1 0 实际浓度 V 四 含量测定 GC法加校正因子内标法ChP 一 1 1 VitE测定的色谱条件 载气 N2固定相 硅烷化硅藻土上涂布硅酮 OV 17 柱温 265 检测器 氢火焰离子化检测器 FID 内标 正三十二烷n 500R 2 内标物 是样品中不存在的物质与被测组分峰靠近能与各组分完全分离与被测组分的量接近 ChP和BP内标正三十二烷 USP内标十六酸十六醇酯 2测定 供试液 样品 内标 对照液 对照 内标 1 系统适用性试验对照液 对照 内标 进样理论塔板数N应不低于500 VE与内标峰分离度应大于2 2 校正因子的测定对照液 对照 内标 进样 3 样品测定供试液 样品 内标 进样 s 内标r 对照 样品 dl 生育酚固定相 十八烷基硅烷键合硅胶流动相 甲醇 水 49 1 检测波长 292nm 二 RP HPLC法 外标法 JP 用峰高计算含量 W生育酚 W对 H对 H样 三 FLD 同步荧光扫描法 血清中维生素E的测定 维生素E和溶剂的拉曼光谱重叠 激发波长295nm 氨基嘧啶环 CH2 噻唑环 季铵碱 第四节维生素B1的分析 一 结构与性质 HCl Cl 1 共轭双键 UV max 246nm 性质 可与酸成盐 非水碱量法4 嘧啶环N原子可与生物碱沉淀剂反应 鉴别和硅钨酸重量法 3 碱性N原子 嘧啶环上伯氨基噻唑环上季铵 2 噻唑环含S原子 硫色素荧光法分解产物与Pb AC 2反应 荧光消失 蓝色荧光 硫色素 正丁醇提取 NaOH VitB1 一 硫色素反应ChP K3Fe CN 6 4NaOH H 3K4Fe CN 6 Na4Fe CN 6 O2 2H2O 二 鉴别试验 K3Fe CN 6 硫色素 O 2H H H H H 二 沉淀反应 VitB1 S元素反应 Cl 反应 三 其他反应 VitB1 NaOH Na2S Pb AC 2 PbS 黑色 三 含量测定 加入醋酸汞消除盐酸盐的干扰 指示剂 喹那啶红 亚甲蓝 紫红 天蓝 一 非水溶液滴定法ChPBP 二 UV法 中国药典中VitB1片剂和注射液均采用本法测定含量 max 246nm 三 硅钨酸重量法ChP 90年版 以前用 1原理 2C12H17ClN4OS HCl SiO2 12WO3 26H2O H C12H17ClN4OS 2 SiO2 OH 2 12WO3 4H2O HCl 4H2O 白色 2 337 27 3479 22 2VitB1 硅钨酸 VitB1 2 硅钨酸 取本品约50mg 精密称定 加水50ml溶解后 加盐酸2ml 煮沸 立即滴加硅钨酸试液4ml 继续煮沸2分钟 用80 恒重的垂熔玻璃坩埚滤过 沉淀先用煮沸的盐酸溶液 1 20 20ml分次洗涤 再用水10ml洗涤1次 最后用丙酮洗涤2次 每次5ml 在80 干燥至恒重 精密称定 所得重量与0 1939相乘 即得 2 测定方法 1 硅钨酸用量 过量VB1 硅钨酸 1 8 2 沉淀反应在HCl中进行 增大沉淀颗粒 实验条件 3 煮沸 2 3分钟 太长 沉淀易附着于器壁而损失 4 洗涤 热的稀HCl 水 丙酮洗 5 干燥 80 保持4个H2O 四 硫色素荧光法 1 原理2 方法 NaOH 铁氰化钾 异丁醇 NaOH 异丁醇 S d 空白 对照液 供试液 NaOH 铁氰化钾 异丁醇 NaOH 异丁醇 b 空白 A C样 A b C对 S d C样 C对 A b S d 五 高效液相色谱法 例如 甲硫氨酸维B1注射液中甲硫氨酸和维B1的含量测定 方法 色谱柱 C18流动相 A 0 005mol L庚烷磺酸钠溶液 磷酸调pH至3 0 与 B 乙腈为流动相 梯度洗脱检测波长为210nm 甲硫氨酸 VB1 六 流动注射化学发光法 维生素B1在碱性介质中被铁氰化钾氧化 产生微弱化学发光 罗丹明B可快速吸收反应释放的能量而跃迁至激发态 以光辐射的形式返回基态 十六烷基三甲基溴化铵 CTMAB 可敏化其发光强度 使光强度大大增强 A样品 CTMABB罗丹明BC铁氰化钾 NaOHP蠕动泵F流通池 1 罗丹明B CTMAB化学发光法 可用于测定维生素B1片和注射液 V进样阀PMT光电倍增管 VB1和KIO4在酸性介质中的反应为常规的氧化 还原反应 不产生化学发光 反应剩余的KIO4注入到Luminol流路中 KIO4与Luminol在混合管中发生化学发光反应 但因反应灵敏 在未到达检测器之前反应已经完成 故此发光强度未被检测 然后剩余的Luminol继续与Na2SO3发生化学发光反应而在发光流通池中被检测 其发光强度与维生素B1的浓度在一定的范围内呈良好的线性关系 2 FI 化学发光法间接测定 七 分光光度法 维生素B1在pH2的盐酸溶液中以分子状态存在 稳定性良好 但pH大于5时 将会分解 在pH7时维生素B1完全分解 利用光谱差异测定 测定波长 249nm 1 差示分光光度法 2 动力学光度法 在氢氧化钠介质中 维生素B1能灵敏催化高碘酸钾氧化苯并红紫4B使之褪色 在一定范围内 苯并红紫4B褪色程度与维生素B1浓度成正比 3 酸性染料比色法 利用维生素B1与酸性染料溴麝香草酚蓝成盐 在420nm波长处测定吸收度 八 Fe 2 2 联吡啶分光光度法 九 电位滴定法 用银电极为指示电极 甘汞电极为参比电极 AgNO3标准溶液为滴定剂 第五节维生素C的分析 L 抗坏血酸 一 结构与性质 1 多羟基化合物 具糖的性质 性质 2 2 3 烯二醇结构 强还原性 氧化还原滴定法 3 C3 OH 酸性 一元酸 可与Na2CO3成盐 O 5 水解反应 与碱反应 6 UV特征 4 手性C原子 C4 C5 具旋光性 L 抗坏血酸活性最强 max 243nm 一 与氧化剂的反应 二 鉴别试验 Cu2O 红色 VitC AgNO3 Ag 黑色 2 6 二氯靛酚钠 兰色消失 KMnO4 紫红色褪去 Felling试剂 三 UVBP 0 01mol LHCl 二 糖类的反应USP VitC 三氯醋酸或盐酸 戊糖 脱水 糠醛 吡咯 50 max 243nm 545 585 蓝色 指示剂淀粉指示液 三 含量测定 H 一 碘量法ChP 1 溶解 加新沸的冷H2O 减少水中溶解氧对测定的影响 2 酸性环境 HAC 减慢VitC被O2氧化速度 3 立即滴定 减少O2的干扰 4 附加剂干扰的排除 片剂 滑石粉 过滤 注射剂 抗氧剂 丙酮甲醛 Na2SO3 NaHSO3 Na2S2O3 Na2S2O5 2 讨论 二 2 6 二氯靛酚钠滴定法USP JP VitC 去氢VitC 玫瑰色 无色 以出现玫瑰色为终点 缺点 滴定液不稳定 需经常标定 干扰多氧化力较强 三 HPLC法 HPLC法测定制剂 生物样品 果汁中维生素C 方法离子交换色谱法离子对色谱法分配色谱法 正 反相 血 尿 组织 细胞等 检测器 紫外 安培检测器 例如 RP HPLC测定多维软咀嚼片中维生素C含量 色谱柱 HypersilC18柱 流动相 0 005mol L 1磷酸二氢钾溶液 用磷酸调pH至3 6 检测波长 246nm 1 2 4 二硝基苯肼比色法 四 分光光度法 例如 不同产地枸杞子中维生素C含量测定 2 胶束增溶分光光度法 维生素C还原氯化硝基四氮唑蓝 NBT 为蓝色化合物 蓝色化合物被溴代十六烷基吡啶 CPB 在水溶液中形成的胶束增溶 使显色反应灵敏度显著提高 3 紫外分光光度法 4 邻二氮菲分光光度法 利用抗坏血酸与0 05 Fe 1 10 二氮杂菲溶液在pH 2 6的盐酸介质中生成Fe Fe 与啉菲罗啉形成有色络合物 其吸光值与抗坏血酸的浓度成正比 测定药剂中维生素C含量 5 流动注射光度法 五 荧光法 快速循环伏安法 采用L 赖氨酸修饰玻碳电极 以磷酸盐缓冲溶液为支持电解质 六 电极法 第五节维生素D的