黄芪甲苷对柯萨奇B组3型病毒感染乳鼠心肌细胞及病毒性心肌炎乳鼠心肌细胞的.doc

黄芪甲苷对柯萨奇B组3型病毒感染乳鼠心肌细胞及病毒性心肌炎乳鼠心肌细胞的 黄芪甲苷对柯萨奇组型病毒感染乳鼠心肌细胞及病毒性心肌炎乳鼠心肌细胞的修复作用观察杨秀华?肖云峰?刘天龙?刘小玲?张勇?杨宏昕?刘小雷(内蒙古医科大学药学院?呼和浩特?呼伦贝尔职业技术学院?内蒙古医科大学附属医院?内蒙古自治区人民医院)摘要:目的观察黄芪甲苷(?)对柯萨奇组型病毒(?)感染的乳鼠心肌细胞和病毒性心肌炎()乳鼠心脏的修复作用?并探讨其可能作用机制?方法分离培养原代乳鼠心肌细胞?测算对乳鼠心肌细胞的最大无毒浓度()?取乳鼠心肌细胞分为正常对照组、病毒对照组、组?病毒对照组和组分别用的病毒感染心肌细胞?组分为五个亚组?细胞长至单层细胞时?分别加入、.、./的?当病毒对照组中以上的细胞出现病变时结束培养?法观察各组细胞存活情况(以值表示)?收集各组细胞上清液?全自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶()、肌酸磷酸激酶()含量?只小鼠分为正常对照组、模型对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组?每组只?除正常对照组外?其余各组小鼠均腹腔注射的病毒液./只?建立动物模型?接种病毒时?高、中、低剂量组分别给予、/的灌胃?正常对照组、模型对照组每日予.羧甲基纤维素钠/灌胃?各组均灌胃?灌胃第脱颈椎处死小鼠?取心肌组织?观察心肌组织病理学变化?全自动生化分析仪检测各组小鼠血清中、含量?结果与空白对照组比较?病毒对照组及组各亚组细胞值降低(均.)?与病毒对照组比较?及组各亚组细胞值降低(均.)?与正常对照组比较?病毒对照组心肌细胞、含量升高(均.)?与病毒对照组比较?、/的组心肌细胞、含量降低(均.)?与空白对照组比较?病毒对照组心肌组织排列紊乱?淋巴细胞和单核细胞出现介导的炎性浸润、心肌细胞出现明显出血水肿甚至坏死?组不同剂量心肌组织排列紊乱情况轻?淋巴细胞和单核细胞出现介导的炎性浸润、心肌细胞轻微出血水肿?心肌组织坏死以点状炎症和坏死灶为主?与空白对照组比较?模型对照组心肌细胞、含量升高(均.)?与模型对照组比较?高、中、低剂量组心肌细胞、含量降低(均.)?结论对感染的心肌细胞和乳鼠心肌细胞均具有明显的保护作用?其机制可能为降低、含量?关键词:黄芪甲苷?心肌细胞?心肌酶?病毒性心肌炎?柯萨奇组型病毒:./.:.文献标志码:()基金项目:国家自然科学基金资助项目()?内蒙古自治区卫生计生科研计划项目()?通信作者简介:刘小雷(:.)?(?):()()()?.().?.?.?.?./?.().?山东医药年第卷第期()().?.?(./).?/?./.?.?(.).?(.).?(.).?/(.).?.?.?(.).?(.).:?病毒性心肌炎(?)是最常见的感染性心肌炎?引起的病毒主要是肠道病毒和上呼吸道感染病毒?其中以柯萨奇组型病毒()最为常见?近年来?的发病率呈上升趋势?尤其是儿童、青壮年发病率较高?发病初期常见发热、全身酸痛、胸痛、疲倦等一般病毒感染症状?因此常因误诊不被患者所重视而延误病情?严重感染可导致心力衰竭、心源性休克甚至猝死?乳酸脱氢酶()和肌酸磷酸激酶()是诊断的标志性心肌酶?目前的临床治疗主要以对症治疗、提高机体的免疫力及抗病毒治疗为主?目前尚无统一安全有效的抗药物?黄芪甲苷()是从蒙古黄芪根茎中提取分离的主要活性成分?具有补气升阳、益卫固表、托毒生肌、利水消肿等功效?黄芪具有增强免疫、强心降压、降血糖、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等功效?可用于冠心病、心绞痛等疾病的治疗?目前关于治疗的效果相关报道较少?年月年月?我们分别观察了对感染的乳鼠心肌细胞及乳鼠心肌细胞的保护作用?并分析其可能作用机制?材料与方法.细胞、药物及仪器级新生乳鼠?由内蒙古大学实验动物中心提供?许可证编号:(蒙)?级昆明种雄性小鼠只?体质量?由内蒙古大学实验动物中心提供?实验动物生产许可证号:(蒙)?人宫颈癌细胞株由军事医学科学院杨秉呼博士惠赠?细胞株由中国预防医学科学院病毒研究所惠赠?()毒株由中国医学科学院病毒所惠赠?(?中国药品生物制品检定所)?测定试剂盒(?南京建成生物工程研究所)?试剂盒(?南京建成生物工程研究所)?.对感染的乳鼠心肌细胞的保护作用观察.病毒扩增及病毒滴度()检测病毒扩增取细胞株培养于培养瓶中?当长成单层细胞时加入病毒液?吸附后弃上清?加全培养基?在孵箱中培养?于倒置显微镜下观察细胞形态?当细胞变为单个细胞并发生部分破裂时?终止培养?反复冻融次?最终完全释放病毒颗粒时移入离心管?离心?收集上清液?保存备用?检测取细胞用全培养基将病毒液稀释?浓度范围为山东医药年第卷第期稀释度?将已长成单层细胞的培养液弃去?接种不同浓度的病毒液?记录细胞病变()的孔数?以达“”以上为阳性?以最高稀释度不再出现为终点?用法计算?得病毒的为.?即能够使细胞发生的病毒浓度为/?最终选择作为正式实验的接种浓度?.原代乳鼠心肌细胞分离与培养取新生乳鼠?乙醇消毒?迅速剪取心脏心尖处?将心脏均匀剪成约的组织块?弃上清?加入.胰酶轻轻吹打?消化?加入.胰酶及.型胶原酶的混合液?消化?吸取上清液转移至另一预冷玻璃瓶中?的/培养基终止消化?重复上述步骤?共消化次?目筛网去除大量组织?离心?/培养基重悬细胞?、孵箱中培养?差速贴壁?将细胞悬液转移至另一培养瓶中?继续培养?细胞达到融合状态时开始后续实验?倒置显微镜下可见培养时细胞基本全部贴壁?细胞呈圆形、梭形及多角形?大多数都已伸出伪足?边界清晰可见?并且有自发性节律性搏动?培养细胞伸出伪足并相互触及交织成网?逐渐形成细胞簇?并且同步搏动?搏动频率次/?培养日细胞搏动频率逐渐达到高峰(次/)?免疫组化染色后乳鼠心肌细胞染色为阳性?胞质内存有棕黄色丝状物质?细胞纯度达以上?.对乳鼠心肌细胞的最大无毒浓度()测算取乳鼠心肌细胞分为正常对照、(浓度分别为、/)?每组每个浓度个复孔?分别将不同浓度药物加入到已长成单层细胞的孔板中?、培养箱中培养?高浓度对细胞的毒性较大?表现为细胞形态发生改变?出现脱落、死亡?随着浓度的降低?对心肌细胞的毒性反应也逐渐减弱?当达到无毒浓度时?给药的细胞和正常对照细胞的没有明显的区别?显微镜下记数的孔数?当不再变化时?用法测算的为/?为/?.加入的感染心肌细胞存活情况观察及细胞上清液中、检测取乳鼠心肌细胞分为正常对照组、病毒对照组、组?将密度为/的心肌细胞接种于孔板中?孵箱内培养?病毒对照组和组分别用的病毒感染心肌细胞?共培养弃去含有病毒的培养液?组分为五个亚组?分别加入、.、./的?显微镜下每日观察?当病毒对照组中以上的细胞出现病变时结束培养?每孔加入液(./)?培养?吸弃原培养液?每孔加入?振摇?于酶标仪处读取光密度值(值)?根据每组细胞的值计算细胞存活率?实验重复次?取平均值?收集各组细胞上清液?采用全自动生化分析仪对处理样本进行检测?检测指标为、?实验重复次?取平均值?.对小鼠心脏的保护作用观察.小鼠分组及给药方法采用随机数字表法将只小鼠分为正常对照组、模型对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组?每组只?除正常对照组外?其余各组小鼠均腹腔注射病毒液./只?建立动物模型?小鼠接种病毒时?高、中、低剂量组分别给予、/的灌胃?正常对照组、模型对照组每日予.羧甲基纤维素钠/灌胃?各组均灌胃?灌胃第脱颈椎处死各组小鼠?.各组小鼠心肌组织病理形态观察处死各组小鼠后留取心肌组织?沿左心室长轴切开?用甲醛固定后石蜡包埋切片?染色?观察各组心肌细胞、心肌组织病理学改变?.各组小鼠血清中、测定将麻醉小鼠眼眶取血?静置?用/?离心取血清?采用全自动生化分析仪对处理好的样本进行检测?检测指标为、?实验重复次?取平均值?.统计学方法采用.统计软件进行处理?计量资料以?表示?组间比较采用检验?.为差异具有统计学意义?结果.加入的感染的心肌细胞值比较空白对照组、病毒对照组细胞值分别为.、.?、.、./的组细胞值分别为.、.、.、.、.?与空白对照组比较?病毒对照组及组各亚组细胞值降低(均.)?与病毒对照组比较?及组各亚组细胞值升高(均.)?.加入的感染的心肌细胞细胞上清液山东医药年第卷第期、含量比较空白对照组感染的心肌细胞、含量分别为(.)、(.)/?病毒对照组感染的心肌细胞、含量分别为(.)、(.)/?.、.、/的组心肌细胞含量分别为(.)、(.)、(.)、(.)、(.)/?含量分别为(.)、(.)、(.)、(.)、(.)/?与正常对照组比较?病毒对照组心肌细胞、含量升高(均.)?与病毒对照组比较?、/的组心肌细胞、含量降低(均.)?.加入的小鼠心肌组织病理形态模型对照组及低、中剂量组分别死亡、只?与空白对照组比较?病毒对照组心肌组织排列紊乱?淋巴细胞和单核细胞出现介导的炎性浸润、心肌细胞出现明显出血水肿甚至坏死?组不同剂量心肌组织排列紊乱情况轻?淋巴细胞和单核细胞出现介导的炎性浸润、心肌细胞轻微出血水肿?心肌组织坏死以点状炎症和坏死灶为主?.加入的小鼠血清、含量测定结果比较见表?与空白对照组比较?模型对照组心肌细胞、含量升高(均.)?与模型对照组比较?高、中、低剂量组心肌细胞、含量降低(均.)?表各组乳鼠心肌细胞、含量(/?)组别空白对照组.模型对照组.低剂量组.中剂量组.高剂量组.讨论中药黄芪是豆科黄芪属植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根?史载于?神农本草经?中?具有显著的补气升阳、益卫固表、托毒生肌、利水消肿等功效?根据现代药理学研究表明?黄芪具有增强免疫、强心降压、降血糖、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤的功效?临床上可用于冠心病、心绞痛、病毒性心肌炎等疾病的治疗中?目前?黄芪己被列入我国卫生行政部门制定的有关病毒性心肌炎常规治疗方案中?本研究中所用的是从蒙古黄芪中分离纯化的主要活性成分?在药典中被作为黄芪质量检测标志物?现代研究表明?具有抗炎、抗氧化?、抗病毒、增强免疫力等药理作用?原代乳鼠心肌细胞的体外培养?是将出生天乳鼠心脏组织剪碎?用特定浓度的消化酶进行消化?使心肌组织变成单个的心肌细胞?在适宜的体外环境下?贴壁生长的一种细胞培养技术?原代乳鼠心肌细胞在感染病毒后天就可以发生较明显的细胞病变?早期便可以直接损害心肌细胞?临床上一般采用检测心肌酶的表达水平来间接检测心肌细胞的损伤程度?、是诊断病毒性心肌炎的标志性心肌酶?在感染的心肌细胞模型中?由于心肌细胞受损?细胞膜通透性升高?胞内酶大量释放进入血液中?导致、的活性升高?治疗组(、/)明显减轻?细胞搏动有力?染色结果显示?给药各浓度组与病毒对照组比较?给药组的细胞存活率明显增高?细胞搏动较好?形态正常?两组间平均值有显著性差异?故作用于感染的心肌细胞后?细胞病变明显减轻?上清液中的心肌酶的活性明显降低?差异有统计学意义?说明可以减轻感染所造成的心肌细胞损伤?能维持心肌细胞正常功能?对心肌细胞具有较好的保护作用?在感染的小鼠模型中?通过染色法可观察到感染病毒的小鼠的心肌组织形态?病毒对照组心肌组织排列紊乱?淋巴细胞和单核细胞出现介导的炎性浸润、心肌细胞出现明显出血水肿甚至坏死?给药组尚可观察到病灶出现?以点状炎症和坏死灶为主?病变程度相对于病毒对照组较轻?能明显减轻感染的心肌组织病变程度?综上所述?加入可促进感染心肌细胞的存活?加入的乳鼠心肌细胞炎症反应轻?对感染的心肌细胞和乳鼠心肌细胞均具有明显的保护作用?可明显抑制感染?减轻了感染造成的心肌损伤?其机制可能为通过减少和的释放、抑制病毒增殖以及对心肌细胞及心肌组织的保护作用?但其具体治疗机制尚有待于进一步研究?参考文献:?.?():.?.().?():.李丽燕?俞金正?沈群?等.黄芪颗粒对病毒性心肌炎模型大鼠心肌细胞中、表达的影响.中国药房?():.山东医药年第卷第期覆膜镍钛合金支架管与改良型结肠液囊管在猪结肠穿孔修复中的应用对比观察王纯忠?卢峰?仇卫健?高小龙?肖慧莲?谢明霞?杨茂华?区栋财?刘楚天(广州市第一人民医院?广州?.江苏阳普医疗科技有限公司?南京微创科技有限公司)摘要:目的观察覆膜镍钛合金支架管(?)、改良型结肠液囊管(?)对结肠穿孔猪穿孔部位的应用修复效果?方法取头西藏小型猪制备结肠穿孔模型?造模后只猪随机分为组、组?每组头?造模后即刻组、组分别用与修复结肠穿孔部位?分别于治疗第、天两组各取只猪测算结肠穿孔愈合部位爆破压()?取结肠穿孔部位肠壁组织检测直肠穿孔愈合部位羟脯氨酸()含量?结果治疗第、天组结肠穿孔愈合部位分别为(.)、(.)、(.)?组分别为(.)、(.)、(.)?随治疗时间延长组、组结肠穿孔愈合部位逐渐升高(均.)?治疗第、天组结肠穿孔愈合部位含量分别为(.)、(.)、(.)/?组分别为(.)、(.)、(.)/?随治疗时间延长组、组结肠穿孔愈合部位含量逐渐升高(均.)?结论、修复后的结肠穿孔猪穿孔愈合情况均较好?关键词:覆膜镍钛合金支架管?改良型结肠液囊管?结直肠穿孔?结肠穿孔?结肠穿孔修复?爆破压?羟脯氨酸:./.:文献标志码:()?(?):()().?.?宣丽颖?陶谢鑫?赵雅君?等.黄芪总黄酮对柯萨奇病毒感染乳鼠心肌细胞内质网应激及蛋白和缝隙连接蛋白的作用.中国应用生理学杂志?():.王小霞?刘晶?刘天龙?等.黄芪