两种体外细胞毒性检测方法的比较研究

两种体外细胞毒性检测方法的比较研究上海生物医学工程杂志2005年第26卷第4期?205?两种体外细胞毒性检测方法的比较研究*黄哲玮孙皎孟爱英上海交通大学医学院附属第九人民医院/上海生物材料研究测试中心(上海200023)【摘要】目的比较两种常用的细胞毒性检测方法在医疗器械生物学评价中的相关性.方法分别采用M,rr比色法和细胞增殖度法,在37条件下,将五种医疗器械/生物材料的浸提液分别与小鼠成纤维细胞(L一929)接触2天和2,4,7天,比较材料对细胞的毒性影响.结果5种不同的材料浸提液分别表现出不同程度的细胞毒性反应(02级).将MTT比色法与细胞增殖度法(2天)的实验数据进行相关性分析,显示两者之间具有良好的相关性(R=0.977).结论MTT比色法由于其检测所需的细胞量相对较少,试验步骤相对简便,检测周期短,因此具有一定的优越性,是个值得推荐的细胞毒性检测方法.【关键词】体外细胞毒性MTT比色法细胞增殖度法StudyonComparisonofTwoinVitroCytotoxicityTestsHuangZheweiSunJiaoMengAiyingShanghaiJiaoTongUniversityShanghaiNo.9peopleShospitalShanghaiBiomaterialsResearch&TestCenter【Abstract】ObjectiveTostudytherelativitybetweentwoinvitrocytotoxicitytestwhichusedinbiologicalevaluationofthemedicaldevice.MethOdTheextractsof5kindsofmedicaldevices/biomaterialswerecontactedwiththeL一929cellsfor2daysand2,4,7daysrespectivelyat37bytheMTTassayandproliferationtest,comparedthecytotoxicreaction.ResultsUndertheconditionofthisstudy,5kindsofmedicaldevices/biomaterialsshowedadifferentgradesofthecytotoxicity(02grades).theresultsofMTFassaycomparedwithitofcellproliferationtest(2days)showedagoodrelativity(R=0.977).Conclusionwhencomparedwiththecellproliferationtest,MTTassayneedlessamountofthecells,bemoresimpleandshorter,itisworthtoevaluatethereactionofcytotoxicityforthemedicaldevices/biomaterials.【Keywords】Invitro;Cytotoxicity;MTTassay;cellproliferationtest生物医用材料及制品已被大量应用于临床各个学科.由于这些生物医用材料及制品在应用中都会与人体的组织和细胞发生直接接触,因此它们不仅需要有良好的理化性能,而且还必须具备有良好的生物相容性.保证这些医用生物材料的安全性问题已越来越受到各国政府的重视.1992年国际标准化组织发布的ISO10993医疗器械的生物学评价等系列国际标准_2J,我国在70年代后期开始研究生物材料和医用装置的生物学评价方法,从而保证上海市重点学科(特色学科)建设项目资助(T0202)了我国医用生物材料和医疗器械在研究,生产和临床使用中的安全性,促进了医用生物材料研究的发展和水平的提高.在众多的生物相容性试验中,细胞毒性试验以其简便,快捷,灵敏性高,节省动物等优点均被列为首选试验项目,作为评价材料毒性的重要指标.细胞毒性试验是一种在离体状态下模拟生物体生长环境,检测生物医用材料及制品或其浸提液对细胞溶解(细胞死亡),抑制细胞生长和其他毒性作用的方法.在ISO109935:1999中该项试验可分?206?上海生物医学工程杂志2005年第26卷第4期为浸提液方式法,直接接触法和间接接触法三种_3.目前绝大多数医疗器械及材料是通过浸提液来进行检测的_4J.其中细胞增殖度法和MTT比色法是目前最为常用的浸提液试验,通过材料的浸提液与培养的细胞广泛接触,可分析材料中各组成成分及其浓度对细胞的毒性影响.本次试验试图通过运用这两种方法对同种材料检测所得到的结果进行相关性分析,探讨这两种方法之间是否具有相关性,为今后医疗器械/生物材料体外细胞毒性检测方法的选择及标准化提供一定的依据.1材料1.1试验材料本次试验选用了5种医疗器械/生物材料,其名称和来源见表1:表1材料的名称及来源1.2试验用细胞系小鼠成纤维细胞L一929,购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所.1.3主要试验用试剂MTT,Fluka公司;细胞培养液MEM,GIBCO公司;胎牛血清,上海生物制品研究所;DMSO;结晶紫罗兰等.1.4仪器wellscanMK3酶标仪,Labsystems中国集团制造;二氧化碳培养箱,日本SAYAN公司;96孔细胞培养板等.2实验方法2.1材料浸提液的制备根据ISO109935和ISO1099312,按一定比例含小牛血清的细胞培养液,置于37培养24h.2.2细胞悬液的制备将传代培养48h的L一929细胞,用细胞培养液分别制备成4105个/ml和1105个/ml的细胞悬液备用.2.3细胞增殖度法将4105个/ml细胞悬液分别注于试管内(1ml/管),置37二氧化碳培养箱中培养24h.24h后,每管舍弃原培养液,各对照组分别用相应的对照液进行交换,试验组用含5O%(V/V)浸提液的新鲜培养液进行交换,置37二氧化碳培养箱中继续培养.分别于2,4,7天将对照组和试验组各6管取出,丢弃原细胞培养液,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,甲醛溶液固定后,加结晶紫罗兰染色.最后加入十二烷基硫酸钠,用分光光度计在波长为588nm下测定吸光度值,并根据其吸光度按公式计算细胞的相对增殖度(RGR).RGRc%=弓三彗拿矗oo%2.4MTT比色法将110个/ml细胞悬液接种于96孔细胞培养板(100tA/L),置37二氧化碳培养箱中培养24h.等细胞贴壁生长后,去除上清液,加入相应的对照液,试验组用含5O%(V/V)浸提液的新鲜培养液进行交换,置37二氧化碳培养箱中继续培养.于2天后取出,加入MTT液继续培养4小时.吸除原液,加入DMSO,振荡10min.用酶联免疫检测仪在波长为630nm下测定其吸光度值,根据上述公式计算细胞的相对增殖度(RGR).2.5根据细胞相对增殖度来评定细胞的毒性反应_6J,见表2:表2细胞毒性反应评定.反应相对增殖度RGR(%)0级1级2级3级4级5级100759950742549l一2402.6相关性分析将MTT比色法与2天时的细胞增殖度法结果进行相关性分析.3结果两种检测方法对5种材料细胞毒性试验的检测结果见表3:将两种检测方法(2天)的细胞相对增殖度结果进行相关性分析,得出相关系数R=0.977,显示两种方法之间存在良好的相关性(见表4).上海生物医学工程杂志2005年第26卷第4期.207.表3细胞增殖度法和MTr比色法测得的细胞相对增殖度结果(RGR)表4两种方法检测结果的相关性比较4讨论根据目前国内外医疗器械生物学评价的标准,利用体外细胞毒性试验从细胞水平去观察材料是否具有细胞毒性即材料对细胞的数量,形态及分化的影响是检测材料生物相容性的一项重要指标l_.其中浸提液试验因具备材料的浸提液容易获得,便于过滤灭菌,并且浸提液与细胞接触广泛等优势被大量运用于生物医用材料及制品的细胞毒性检测.细胞增殖度法是我国自八十年代就开始运用的细胞毒性试验,已广泛应用于目前医疗器械的生物安全性评价中.该方法的原理主要是将细胞接触材料浸提液后,对存活细胞的数量进行测定,细胞增殖率来推断材料对细胞的毒性作用Es.MTI”比色法的原理是活细胞中的线粒体脱氢酶将32(4,5一二甲基噻唑一2)一2,5一二苯基四氮唑溴盐还原,产生紫色结晶物,用二甲基亚砜(DMSO)溶解,用酶联免疫检测仪测定其光密度,通过与对照组的比较得到实验组的增殖率,从而评价受试样品的细胞毒性.MTI”是一种淡黄色唑氮盐,1983年Mosroann根据活细胞在能量代谢中,线粒体内琥珀酸脱氢酶将MIT还原产生甲瓒,而在毒性环境中,其琥珀酸脱氢酶活性会降低的原理,利用MIT比色分析法测定细胞的活性和代谢功能.该方法简便,灵敏,已广泛用于多种学科领域.近几年来也有报道用于医疗器械的细胞毒性检测.在医疗器械的生物学评价中,有关细胞毒性试验国内外基本上都参照IS010993.5的标准,其中浸提液试验方法我国以往比较多的是采用细胞增殖度法,近年来MTI”比色法也逐渐用于生物材料的细胞毒性的检测,然而,这两种方法获得的结果是否存在差异?两者的相关性究竟如何?这是目前医疗器械/生物材料的细胞毒性评价中尚无法回答的问题.本研究通过对五种材料进行MTI”比色法与细胞增殖度法两种方法的直接比较,显示了两者之间存在良好的相关性(R=0.977),这为今后医疗器械/生物材料的细胞毒性试验的方法选择和标准化工作提供了重要的科学依据.研究结果提示:MTT比色法因其检测所需的细胞量相对较少,试验步骤相对简便,误差小,检测周期短等优点,比细胞增殖度法更具有一定的优越性,值得推荐(R=0.977).参考文献1HarmandMF.InvitrostudyofbiodegradationofCoCralloyusingahumancellmode.JBiomaterSciPolymEd,1995,6(9):809.2IS0109931:2003,BiologicalevaluationofmedicaldevicesPart1:Evaluationandtesting.3IS0109935:1999,BiologicalevaluationofmedicaldevicesPart5:Testsforinvitrocytotoxicity.4贾文英,史弘道.细胞毒性试验评价医用装置生物相容性的研究概况.实用美容整形外科杂志,2001,10(5):253255.5IS01099312:2002,