细胞焦亡.doc

细胞焦亡2001年，cookson等首次使用pyroptosis来形容在巨噬细胞中发现caspase-1依赖的细胞死亡方式。细胞焦亡（pyroptosis）的发现并证实是一种新的程序性细胞死亡方式，其特征为依赖于半胱天冬酶-1(caspase-1)，并伴有大量促炎症因子的释放。细胞焦亡的形态学特征、发生及调控机制等均不同于凋亡、坏死等其他细胞死亡方式。迄今为止，已经证实弗氏志贺氏杆菌、沙门氏杆菌、李斯特杆菌、绿脓杆菌、弗朗西斯氏菌属、嗜肺性军团杆菌以及叶尔森杆菌均可诱导巨噬细胞产生caspase-1依赖的细胞死亡方式。研究发现，caspase-1依赖的细胞死亡方式不仅存在于单核巨噬细胞系，还存在于树突状细胞等其他细胞中。诱导细胞产生caspase-1依赖细胞死亡的刺激原也不仅局限于病原体，一些非生物性的刺激源，如损伤相关模式分子(dangerdamage associated molecularpattern，DAMP)、缺血坏死的产物等也可诱导细胞caspase-1依赖的细胞死亡。此后，科学家们发现细胞焦亡本质上是由 GSDMD（gasdermin D）蛋白介导的细胞炎性坏死，与多种病理生理过程紧密相关。一旦发生，GSDMD 蛋白的 N - 端高聚并与脂类结合，在细胞膜上形成孔洞，细胞逐渐膨胀至细胞破裂，最终大量细胞内含物如 IL-1释放，激活强烈的炎症反应。研究表明，细胞焦亡广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展，并发挥重要作用。对细胞焦亡的深入研究有助于认识其在相关疾病发生发展和转归中的作用,为临床防治提供新思路。1.Nature：细胞焦亡在肿瘤化疗中发挥重要作用doi:10.1038/nature22393近日，一篇发表在国际杂志nature上的研究报告中，来自北京生命科学研究所的邵峰院士课题组报道发现细胞焦亡的重要蛋白GSDME(DFNA5)。该蛋白在肿瘤化疗药物的作用下，通过caspase-3的切割作用获得活性，诱导肿瘤细胞的细胞焦亡，并在化疗药物对正常组织的毒副作用中扮演重要角色。此前邵峰院士已经发表了有关文章证明GSDMD蛋白在细胞焦亡中的重要作用，此次，他们关注的是与GSDMD属于同一蛋白家族的GSDME蛋白。GSDME是非常古老而保守的蛋白，斑马鱼中的GSDME蛋白与人中的有50%的相似性，说明GSDME介导的细胞焦亡在进化上是保守且重要的。进一步实验证明，GSDME在TNFa和CHX的诱导下，被caspase-3特异性的切割D270A位点而断成两部分并获得活性。断裂后的GSDME蛋白的N端蛋白具有打孔活性，能插入细胞膜形成孔洞，从而引发细胞焦亡，若突变切割位点D270A，则不能实现细胞焦亡。此外，在caspase-3缺失的细胞中，细胞可通过caspase-7的激活进入细胞凋亡，而不是细胞焦亡。接下来研究人员进一步探究了在肿瘤的化疗药物引起的细胞死亡中，GSDME介导的细胞焦亡是否发挥了作用。人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞和人恶性黑色素瘤MeWo细胞具有GSDME较高水平的表达，在Topotecan， Etoposide， Cisplatin等化疗药物作用下，细胞发生明显的细胞焦亡而不是细胞凋亡，说明GSDME作为抑癌基因有望成为临床治疗的新方向。然而在大部分肿瘤细胞中，由于启动子区的DNA甲基化，GSDME的表达往往是沉默的。研究人员发现，对于GSDME表达较低的细胞，DNA甲基化酶抑制剂decitabine能显着提高GSDME的表达，将decitabine和化疗药物（阿霉素等）联合用药，对肿瘤细胞有明显的杀伤效果。有趣的是，除了探究GSDME在肿瘤化疗中的作用，研究人员发现与在肿瘤细胞中沉默表达相反，GSDME在正常组织中均有表达，那么GSDME是否是化疗药物杀伤正常组织细胞的帮凶呢？研究发现，敲除GSDME的小鼠在接受化疗药物后，可以免受多种器官的损伤，比如小肠绒毛并且野生型小鼠在接受化疗药物后体重降低15%，而敲除GSDME的小鼠体重变化不明显，这说明GSDME在化疗药物的毒副作用中发挥重要作用。2.PNAS：复旦大学细胞焦亡作用机理研究获进展doi:10.1073/pnas.1708194114复旦大学生命科学学院李继喜课题组在炎性坏死（细胞焦亡）作用机理研究方面取得重要进展。相关成果日前发表于美国国家科学院院刊。在此之前，科学家们尚未获得GSDMD 蛋白高分辨率三维结构信息，从自抑制状态到活化状态的构象变化也不清楚。李继喜团队通过 X - 光晶体衍射方法解析了 GSDMD- C 的三维精细结构，并结合 X - 射线小角衍射和动态光散射等技术分析了 GSDMD 的溶液结构及物理化学性质。研究发现，GSDMD- C 的第一段柔性区域深入到 GSDMD- N 结构域中，对 GSDMD 的稳定性起着很大作用。同时，基于三维结构的定点突变及替换实验表明，该区域对于细胞存活至关重要。表面电荷分布则表明，与 C 端结构域分开后，GSDMD 的 N 端结构域表面暴露出来，通过正负电荷之间的相互作用，进一步寡聚从而引起细胞焦亡。3.Nature：揭示细胞焦亡作用机制，有望治疗细菌感染和败血症doi:10.1038/nature18629抗生素耐药性的细菌感染越来越引发人们的担忧，就像败血症-免疫系统的最后一道防线不能够抵抗细菌感染，因而是非常致命的-那样。在一项新的研究中，来自美国波士顿儿童医院、哈佛医学院和布莱根妇女医院的研究人员描述了一种新方法潜在地控制败血症和引起败血症的失控的细菌感染。相关研究结果于2016年7月6日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Inflammasome-activated gasdermin D causes pyroptosis by forming membrane pores”。论文通信作者为来自波士顿儿童医院细胞与分子医学计划的Judy Lieberman博士和Hao Wu博士。近期的研究已证实在细菌侵入的任何征兆出现时，炎性体（一种蛋白复合体）被激活。这种激活触发一种被称作细胞焦亡（pyroptosis）的过程：被感染的宿主细胞炸裂开来，释放出细菌和敲响免疫警报的化学信号。但是也存在一种平衡：免疫警报过于强大能够触发败血症，导致致命性的血管和器官损伤。一旦活化，炎性体激活半胱天冬酶，而这种酶经激活后将一种被称作gasdermin D的分子切成两段。这种切割释放出gasdermin D的活性片段，即gasdermin-D-NT。但是这如何导致细胞焦亡是不清楚的。如今，Lieberman、Wu和他们的同事们证实gasdermin-D-NT发挥双重作用。一方面，它在正在感染宿主细胞的细菌的细胞膜上打孔，从而杀死这些细菌；同时，它也在宿主细胞的细胞膜上穿孔，导致细胞焦亡，从而杀死宿主细胞，释放出细菌和免疫警报信号。他们发现附近未被感染的宿主细胞毫发未伤。另一方面，研究人员发现gasdermin-D-NT直接杀死宿主细胞外面的细菌，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌。在培养皿中，这发生很快，在5分钟内完成。这些结果还需要在细菌感染和败血症模式动物体内再现，但是Lieberman认为理解gasdermin-D-NT如何发挥作用可能被用来协助治疗高度危险的细菌感染。4.Cell Res：caspase11切割gasderminD引发“细胞焦亡”doi:10.1038/cr.2015.124炎性caspase家族蛋白包括caspase1,4,5，11（其中4,5存在于人中），对于免疫反应的信号传递起到了关键的作用。它们是组成炎症小体（inflammasome）的重要元件，后者介导了多种促炎性分子（pro-IL-1beta，pro-IL-18）的表达与分泌。炎性caspase同时还参与了一类叫做细胞焦亡的事件的发生。实验证明，革兰氏阴性菌中的脂多糖（LPS）能够激活宿主体内caspase1或者caspace4,5活性，也有实验证明caspase4,5,11能够与LPS直接结合。这些炎性caspase的激活能够促进细胞焦亡事件的发生，同时能够激活NLRP3炎症小体，并引发热休克症状。然而，炎性caspase究竟是如何调节这些细胞事件至今仍然有待解决。最近，来自UCSF的Vishva M Dixit研究组与来自NIBS的邵峰研究组分别发现了一类炎性caspase的关键性底物：gasderminD，该蛋白的切割能够引发细胞焦亡事件的发生。其中，Dixit等人利用正向遗传学的手段对小鼠进行了大规模的基因诱变，并从中筛选能够抑制caspase11信号通路的基因。该基因名为Gsdmd，存在一个105位的异亮氨酸到赖氨酸的突变。他们发现这一突变体小鼠不能够正常发生细胞焦亡，而且在转染LPS后也不能够正常产生IL-1。邵峰等人则利用crispr-cas9技术通过体外的敲除试验锁定了关键性的蛋白gasderminD。之后，两个组都对这一蛋白进行小鼠基因敲除，并证明该蛋白确实参与了caspase-11依赖性的细胞焦亡。邵峰等人来证明gasderminD与细胞坏死性希望以及细胞凋亡过程均没有必然联系。为了进一步探究gasderminD是如何影响细胞焦亡的发生，两个研究组利用一系列生化实验证明caspase11能够特异性地在Asp276,Gly277位点之间对gasderminD进行切割，从而产生N端30kDa左右的蛋白以及C端22kDa左右的蛋白。其中N端的蛋白是引发细胞焦亡的活性元件，而C端则对gasderminD的切割起到了抑制的作用。作者通过将gasderminD进行突变使其不能被正常切割，结果显示该突变的蛋白不能引发细胞焦亡的发生。邵峰等人还鉴定出了除gasderminD以外，同一家族的其它不能被caspase切割的蛋白。由于gasderminD也能够被caspase1切割，因此邵峰等人认为gasderminD还参与了经典的炎症小体引发的细胞焦亡。后续的实验证实了他们的猜想。最终，Dixit等人对野生型小鼠，gasderminD敲除小鼠以及caspase11敲除小鼠进行LPS诱导热休克模型试验。结果显示，gasderminD敲除小鼠能够免受LPS引发的热休克致死效应，与caspase11敲除小鼠表型一致。这一结果也符合之间的假设。5.Cell Res：厦门大学韩家淮教授课题组发现细胞焦亡关键蛋白doi:10.1038/cr.2015.1392015年11月27日，厦门大学生命科学学院韩家淮教授课题组在Cell Research杂志在线发表题为“Gasdermin D is an executor of pyroptosis and required for interleukin-1 secretion”的文章。该文章的第一作者为博士研究生何琬婷，韩家淮教授和博士后钟传奇为文章的共同通讯作者。韩家淮教授课题组运用定量质谱技术分析NLRP3免疫共沉淀复合体，鉴定出了炎症小体另一关键组成蛋白Gasdermin D(GSDMD)。GSDMD是半胱天冬酶-1的底物，剪切后的GSDMD氨基端肽段是细胞焦亡和炎症因子分泌所必需的。gsdmd基因敲除可以有效阻止细胞焦亡和白介素-1的分泌，细胞转而发生凋亡。该研究成果提供给我们有关细胞焦亡分子机制的新认识，并揭示了细胞焦亡与细胞凋亡之间意想不到的转换关系。这一研究也给人们治疗某些自身免疫疾病和炎症疾病提供理论依据。6.Nature：邵峰实验室解析细胞焦亡的关键分子机制doi:10.1038/nature155142015年9月16日，我国北京生命科学研究所邵峰实验室在Nature杂志在线发表名为“Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death”的长文，解析细胞炎性坏死（细胞焦亡，pyroptosis）的关键分子机制。细胞炎性坏死或细胞焦亡是机体在感知病原微生物浸染后启动的免疫防御反应，在拮抗和清除病原感染以及内源危险信号中发挥重要作用。细胞焦亡本质上一种程序性细胞坏死；细胞膜形成孔洞，细胞逐渐膨胀至细胞膜破裂，最终导致大量细胞内容物释放，激活强烈的炎症反应。过度的细胞焦亡会诱发多种自身炎症性和自身免疫性疾病；最近也有研究显示艾滋病的发生也和细胞焦亡有关。细胞焦亡被认为由两种含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）介导，包括caspase-1和caspase-4/5/11。Caspase家族包括十多个成员，其中绝大部分都在细胞凋亡中发挥功能。Caspase-1和caspase-4/5/11则属于炎性caspase。事实上，caspase-1是最早被发现的caspase家族成员，早在上世纪90年代初就被发现可以诱导细胞死亡（一度被误认为是凋亡）。Caspase-1由一个被称为炎症小体（Inflammasome）的复合物在感知病原信号后激活，是细胞质天然免疫最为重要的通路之一。邵峰实验室在此前的研究中曾鉴定了多个感知病原细菌的天然免疫受体蛋白(Zhao et al., Nature 2011; Xu et al., Nature 2014)，负责介导炎症小体组装和下游caspase-1的激活。在去年的研究中（Shi et al., Nature 2014），邵峰实验室还发现人的caspase-4/5和小鼠的caspase-11是细菌脂多糖（LPS，又称为内毒素）的胞内受体，在结合LPS后发生寡聚而活化，诱导细胞焦亡，在内毒素休克和革兰氏阴性细菌诱导的败血症中发挥至关重要的作用。然而，长期以来人们对caspase-1/4/5/11活化如何引发细胞焦亡的机制则完全不清楚。在这项最新的研究中，邵峰实验室的研究人员利用最新的CRISPR/Cas9基因组编辑技术，在小鼠的巨噬细胞中针对caspase-1 和caspase-11介导的细胞焦亡通路，分别进行了全基因组范围的遗传筛选，以寻找那些敲除后可以抑制细胞焦亡的基因。有意思的是，这两个筛选都鉴定到了一个名为GSDMD的、功能未知的蛋白。通过构建GSDMD基因敲除的小鼠巨噬细胞和人的HeLa细胞，他们进一步验证了GSDMD缺失可以完全抑制所有已知炎症小体和细菌LPS引起的细胞焦亡；并且在这些敲除的细胞中外源表达GSDMD都可以回复细胞焦亡的发生。有趣的是，GSDMD缺失并不抑制caspase-1本身的激活和对下游白介素1的切割，但切割后成熟的白介素1却几乎不能分泌到细胞外，显示细胞焦亡对于白介素1的分泌必不可少，该结果也暗示GSDMD在炎性caspase的下游发挥作用。通过生物化学的研究，他们发现GSDMD是所有炎性caspase的共有底物，它们特异性的切割GSDMD两个结构域中间的连接区域，而凋亡相关的caspases却不具备该活性；将不能被caspase-1/4/5/11切割的GSDMD回补到GSDMD敲除的细胞也不能介导细胞焦亡发生，说明该切割对于细胞焦亡是必需的。值得注意的是，GSDMD在被炎性caspase切割后释放出来的的N端结构域其自身就足以引发细胞焦亡；在通常情况下，N端和C端结构域很强地相互作用，使得 GSDMD处于无活性的自抑制状态。在细胞中表达基因工程改造的GSDMD（在两个结构域中间插入其它蛋白酶位点或caspase-3/7的切割位点），可以使细胞在其它蛋白酶刺激下发生焦亡，甚至可以将细胞凋亡转化为焦亡。这些结果进一步证明GSDMD的N端结构域具有诱发细胞焦亡的活性。GSDMD属于一个被称为gasdermin的功能未知的蛋白家族，该家族还包括GSDMA，GSDMB，GSDMC，DFNA5，DFNB59等。邵峰实验室进一步研究发现，这些gasdermin蛋白的N端大都可以引发细胞焦亡；和GSDMD一样，在没有感染的情况下它们也是通过N端和C端的自抑制作用保持无活性状态。人的DFNA5和小鼠Gsdma3的提前终止突变（翻译出可以诱发细胞焦亡的片断）分别导致人类非综合征性耳聋（Nonsyndromic hearing impairment）和小鼠脱毛以及皮肤发炎等疾病，预示这些疾病都是由gasdermin蛋白引发非正常细胞焦亡所导致。有趣的是，除GSDMD外，其它的gasdermin蛋白都不能被炎性caspase切割，说明它们可能通过其它机制响应病原微生物感染，但最终也会通过启动细胞焦亡激活天然免疫反应。本研究首次发现了所有炎性caspase的一个共同底物蛋白GSDMD，并且证明该蛋白的切割对于炎性caspase激活引发的细胞焦亡既是必要的也是充分的，这也是首次揭示细胞焦亡和炎性坏死的关键分子机制，为多种自身炎症性疾病和内毒素诱导的败血症提供了一个全新的药物靶点。此外，该研究还首次鉴定了gasdermin家族蛋白诱导细胞焦亡的功能，进而重新定义了细胞焦亡的概念，并开辟了一个新的程序性细胞坏死的研究领域。7.Nature：王大成院士与邵峰院士合作破解细胞焦亡的关键分子机理doi:10.1038/nature185902016年6月8日，中科院生物物理研究所所研究员、中国科学院大学岗位教授王大成院士课题组与客座研究员、北京生命科学研究所邵峰院士课题组通力合作，在Nature杂志上在线发表题为“Pore-forming activity and structural autoinhibition of the gasdermin family”的研究长文，首次解析GSDMD蛋白家族重要成员的三维结构，与生物功能研究有机结合，确证GSDMD为细胞炎性坏死的直接杀手，揭示GSDMD蛋白以及其它gasdermin家族蛋白介导细胞焦亡和在天然免疫中发挥功能的结构和分子机理，为研发自身免疫疾病和败血症等疾病的创新药物奠定了坚实理论基础，开辟了以针对gasdermin家族蛋白为基础的创新生物医药研发新方向，引起高度重视。在这项最新的研究中，研究人员首先发现几乎所有的gasdermin家族蛋白的N端结构域都具有诱导细胞焦亡的功能，在细菌中也显示出明显的致死毒性。这一现象暗示gasdermin N端结构域可能是通过直接破坏细胞膜而杀死细胞。随后，研究人员利用活化形式的GSDMD，GSDMA和GSDMA3蛋白通过生化实验发现，这三种gasdermin蛋白的N端结构域均能够特异地结合真核细胞膜上特有的磷酸化磷脂酰肌醇（phosphoinositide）和原核细胞膜上特有的心磷脂（cardiolipin），这与gasdermin N端结构域在真核细胞和细菌中均展示出细胞毒性相一致。通过生物化学和荧光显微成像的细胞实