细胞生物学实验讲义(新).doc

细胞生物学实验讲义 吴锦程 梁 杰 编莆田学院环境与生命科学系生物技术专业 2009年2月目 录1. 前言. 32. 实验一 普通光学显微镜及暗视野显微镜的使用. 43. 实验二 荧光和相差显微镜及其使用. .164. 实验三 细胞膜的渗透性. .235. 实验四 细胞凝集反应. .276. 实验五 叶绿体的分离与荧光观察. 297. 实验六 线粒体与液泡的超活染色与观察. 328. 实验七 酸性磷酸酶的显示方法 (选做）. .369. 实验八 植物细胞原生质流动及其影响因素 (选做）. 3910. 实验九 植物细胞骨架的观察 (选做）. 41 前 言细胞生物学是当前生命科学中核心学科之一，也是重要的专业基础课，其理论与实验技术已广泛地用于研究细胞的形态结构、基因表达与克隆、病毒、细菌、胚胎发育、远缘杂交、人类疾病的发病机制、药物机理等领域，随着分子生物学的研究渗入，分子细胞生物学也得到了突飞猛进的发展。目前许多综合大学、农业、医学及药科大学把细胞生物学作为本科生和研究生的必修课或基础理论课，同时也开设了专门的细胞生物学实验课，学生们通过实验，进一步地加深了对理论课的理解，也为今后的专业实验课和毕业论文实验奠定了基础。本讲义精心选择了细胞生物学中的常规实验，作为教材面向本系生物技术专业本科生进行讲授。实验一 普通光学显微镜及暗视野显微镜的使用一、实验目的 1. 强化普通光镜结构和使用技能的知识，掌握让其发挥最佳效能的方法。 2. 了解暗场显微镜的构造和原理，并掌握它们使用方法。二、实验用品 1. 材料与标本：载玻片、盖玻片、牙签，香柏油、生物永久装片、擦镜纸、 洋葱。 2. 器材：普通光学显微镜，暗视场显微镜。3、 实验内容和方法（1） 普通光学显微镜1. 显微镜的用途 显微镜是用来观察、记录和研究经过制片技术处理后被检物体细微结构 的最主要的光学精密仪器。400多年来，经不断改进，显微镜的结构和性能 逐步完善，形成了品种繁多、型号各异的光学显微镜系列它广泛地应用于各 学科领域中，对微观世界的探索及理论的研究起着极其重要的作用（如图 1-1）。最常用的是普通光学显微镜，此外还有多种专用于不同显微术的显微 镜，它们是利用不同的光学原理在显微镜基本设计的基础上发展而来的，如 相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜和倒置显微镜等具有特殊功能或用 途的光镜。形形色色的光学显微镜虽然外形和结构差异较大，但其基本构造 和工作原理是相似的。 图1-1 光学显微镜型号实例 2. 显微镜的一些基本知识 普通光学显微镜的基本工作原理是利用物镜和目镜的多组凸透镜将物 像逐级放大并反射到视网膜上的过程。而显微镜的性能和质量的高低可通过 分辨率、数值孔径、总放大倍率等指标来反映。 (1) 分辨率：衡量光学系统分辨相隔微小距离的两个点能力的指标，即“能 够分辨两点之间最小距离的能力”，称之为光学系统的分辨率。一个光 学系统它所能分辨的两点之间的距离愈小，分辨率也就越高。显微镜的 分辨率用公式表示为：d=0.61/NA 式中d为最小分辨距离；为光线 的波长；NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值 与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大，照明光线波长越短，则 d值越小，分辨率就越高。 要提高分辨率，即减小d值，可采取以下 措施: 降低波长值,使用短波长光源。 提高NA值。 消色差。 增加明暗反差。 (2) 数值孔径：数值孔径简写NA，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参 数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。其数值的大 小，分别标科在物镜和聚光镜的外壳上。这里必须指出，为了充分发挥 物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的NA值应等于或略大于物镜 的NA值，数值孔径与其它技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影 响着其它各项技术参数。它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深 成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。 (3) 放大率：放大率就是放大倍数，是指被检验物体经物镜放大再经目镜放 大后，人眼所看到的最终图像的大小对原物体大小的比值，是物镜和目 镜放大倍数的乘积，即：显微镜的总放大倍率=单个物镜的放大倍率 目镜的放大倍率。放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放 大率越高越好，在选择时应首先考虑物镜的数值孔径。 (4) 焦深：焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物 体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下 一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可 以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层，焦 深与其它技术参数有以下关系： 焦深与总放大倍数及物镜的数值孔 镜成反比； 焦深大，分辨率降低。由于低倍物镜的景深较大，所以 在低倍物镜照相时造成困难。 (5) 视场直径（Fieldof view）：观察显微镜时，所看到的明亮的原形范围叫 视场，它的大小，是由目镜里的视场光阑决定的。视场直径也称视场宽 度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。 视场直径23最为科学，大视场容易引起场曲。 F=FN/Mob F: 视场直 径，FN：视场数，Mob:物镜放大率。视场数（Field Number, 简写为 FN），标刻在目镜的镜筒外侧。由公式可看出： 视场直径与视场数 成正比； 增大物镜的倍数，则视场直径减小。因此，若在低倍镜下 可以看到被检物体的全貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很 小一部份。 (6) 覆盖差：显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不 标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生 了像差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成像质量。国际 上规定，盖玻片的标准厚度为0.17 mm, 许可范围在0.160.18 mm.,在 物镜的制造上已将此厚度范围的像差计算在内。物镜外壳上标记0.17, 即表明该物镜要求盖玻片的厚度。 (7) 工作距离：工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之 间的距离。镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。因此， 它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是调节工作距离。 在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。数值孔径大的 高倍物镜，其工作距离小。 (8) 机械系统： 镜筒：是安装在光镜最上方或镜臂前方的圆筒状结构或 方形结构，其上端装有目镜，下端与物镜转换器相连（图12）。 物镜转换器：又称旋转盘，是安装在镜筒下方的一圆盘状结构，可 以按顺时针或逆时针方向旋转，其上均匀分布有3-4个圆孔，用以装 载不同放大倍数的物镜。转动旋转盘可使不同的物镜到达工作位置（即 与光路合轴），此时能听到“咔”的一声。 镜臂 ：是支持镜筒和镜 台的弯曲状结构，是取用显微镜时握持的部位。 调焦器：也称调焦 螺旋，是调节焦距的装置，位于镜柱的下端，左右对称各一套。分粗 调螺旋（大螺旋）和细调螺旋（小螺旋）两种。粗调螺旋可使载物台 以较快速度或较大幅度升降，能迅速调节好焦距，使物像呈现在视野 中，适于低倍镜观察时的调焦。细调螺旋只能使载物台缓慢或较小幅 度地升降，升或降的幅度不易被肉眼观察到，适用于高倍镜和油镜焦 距的精细调节；也常用于观察标本的不同层次，一般在粗调螺旋调焦 的基础上使用。有些类型的光镜，在左侧粗调螺旋的内侧有一窄环， 称为粗调松紧调节轮，其功能是调节粗调螺旋的松紧度。另外，在右 侧粗调螺旋的内侧有一粗调限位凸柄，当用粗调螺旋调准焦距后向上 推紧该柄，可使粗调螺旋限位，此时镜台不能继续上升，但细调螺旋 仍可调节。 载物台：也称镜台，是位于物镜转换器下方的方形平台， 用于放置被观察的玻片标本。载物台的中央有圆形的通光孔，来自下 方的光线经此孔照射到标本上。在载物台上装有标本移动器，也称推 进器或推进尺，其上安装的弹簧夹用于固定玻片标本，载物台的左下 方的两个螺旋可以移动推进器，可使玻片标本在水平面上前后左右移 动，用来寻找目标。 镜柱：是连接镜臂与镜座的短柱，其上有调焦 器。 镜座：位于最底部，是整台显微镜的基座，用于支持和稳定镜 体。在镜座内装有照明光源。 (9) 光学系统:光学系统包括目镜和物镜。 目镜：又称接目镜，安装在镜 筒的上端，起着将物镜所放大的物像进一步放大的作用。每个目镜一般 由两个透镜组成，在上下两个透镜（即接目透镜和会聚透镜）之间安装 有能决定视野大小的金属光阑视场光阑，此光阑的位置即是物镜所 放大实像的位置。因此，可将一小段细金属丝或头发粘附在光阑上作为 指针，用以指示视野中的某一部分供他人观察。另外，还可在光阑的面 上安装目镜测微尺。每台显微镜通常配置23个不同放大倍数的目镜， 如“5”、“10”和“15”（数字表示放大倍数）目镜，可根据不同 需要选择使用，最常使用的是“10”目镜。 物镜：也称接物镜， 安装在物镜转换器上。每台光镜一般有34个不同放大倍数的物镜， 每个物镜由数片凸透镜组合而成，是显微镜最主要的光学部件，决定着 光镜分辨力的高低。常用物镜的放大倍数有“10 ”、“40 ”和“100 ”等几种。一般将“10”物镜称为低倍镜（而将“5”及以下的 叫做放大镜），将“40”或“45”物镜称为高倍镜，将“100”物 镜称为油镜（这种镜头在使用时其顶端需浸在香柏油中）。在每个物镜 的侧壁通常都标有能反映其主要性能的参数（图1-3），主要有放大倍 数和数值孔径（如10/0.25、40/0.65、100/1.25）、该物镜所要求的镜筒 长度和标本上的盖玻片厚度（160/0.17，单位为mm）；另外，在油镜上 还常标有“油”或“oil”字样。 物镜头与玻片标本之间的介质一般为空气。由于玻璃与空气的折光率不 同，光线通过载玻片和空气进入物镜，部分光线产生折射而损失掉，导 致进入物镜的光线减少，分辨率降低。而油镜用香柏油或石蜡油作为介 质，香柏油或石蜡油折射率与玻璃近似（玻璃、香柏油和石蜡油的折射 率分别为1.52、1.51和1.46，空气为1），可减少光线的折射，增加视 野亮度，提高分辨率。物镜分辨率还和数值孔径有关，其数值越大，分 辨率越高。不同物镜有不同的工作距离，所谓工作距离是指显微镜处于 工作状态（焦距调好、物像清晰）时，物镜最下端与玻片上表面之间的 距离（图1-3）。物镜的放大倍数与其工作距离成反比。当低倍镜被调 节到工作距离后，可直接转换高倍镜，只需旋动细调螺旋，便可见到清 晰的物像，这种情况称为同高调焦。不同放大倍数的物镜可从长短上加 以区分，一般来说，低倍镜最短，油镜最长，而高倍镜的长度介于两者 之间。 (10) 照明系统： 聚光器：位于载物台通光孔的下方，由23个透镜组 合而成，其主要功能是将光线集中到所要观察的标本上，增加视野的 亮度。在聚光器的左下方，有一调节螺旋，可使其上升或下降，从而 调节光线的强弱。升高聚光器可使聚光作用增强，反之则聚光作用减 弱。 光圈：也称彩虹光阑或孔径光阑，位于聚光器的下端，是能够 控制进入聚光镜光束大小的可变圆环结构。它由十几张金属薄片组合 排列而成，其外侧有一小柄，可使光圈的孔径开大或缩小，以调节光 线的强弱。有的显微镜光圈的下方还装有滤光片框，可放置不同颜色 的滤光片。 光源：包括电源线及其插头和灯泡及其开关。电源线在 镜柱下面的镜座侧面。用时将其插头插入电源插座中。灯泡在镜座上 面中央位置，其开关在镜座上镜柱底部的左侧（有的显微镜开关在镜 柱上）。可通过灯泡开关旋钮来调节光线亮度以适应不同的观察需要。3. 光学显微镜的使用方法： (1) 准备工作和基本要求：取用显微镜时，一手握住镜臂，另一手托住镜座， 将显微镜平稳地放置在实验台上，镜座后缘离桌台边缘约5cm。用显微 镜观察标本时，要求双眼同时睁开，双手并用；逐步养成左手调焦、右 手移动标本或绘图记录的良好习惯。 (2) 低倍镜的使用： 调光：打开显微镜光源，转动粗调螺旋，使载物台 稍下降，调节物镜转换器，使低倍镜转到工作状态（即低倍镜头对准通 光孔），当镜头完全到位时，可听到轻微的顿挫声。侧面观察的同时用粗 调螺旋使镜台上升到离物镜约1厘米处。打开光圈并使聚光器上升到适 当位置（以聚光镜上端透镜平面稍低于载物台平面的高度为宜），然后双 眼观察目镜，同时调节光源的亮度，使视野内的光线均匀、亮度适中。 放片：取需要观察的玻片标本，先对着光线用肉眼观察标本的全貌和 位置；再将其放置到载物台上，用推进器上的弹簧夹固定好，注意应使 有盖玻片或有标签的一面朝上；然后，旋动推进器的螺旋，使需要观察 的标本部位处于通光孔的中央位置。 调焦：用眼睛从侧面注视低倍镜， 同时用粗调螺旋使载物台上升，直至低倍镜头距玻片标本的距离约 0.5 cm（注意操作时必须从侧面注视镜头与玻片的距离，以避免镜头压 坏玻片）；然后，双眼观察目镜，同时慢慢转动粗调螺旋使载物台下降， 直至视野中出现较清晰的物像为止；最后，转动细调螺旋，使视野中的 物像更清晰。如果需观察的物像不在视野中央，甚至不在视野内，可用 推进器前后、左右移动标本片，使物像进入视野并移至中央。在调焦时， 如果镜头与玻片的距离已超过了1 cm还未见到物像，应严格按上述步骤 重新操作。如果不能确定视野中的物像是目标物像，可先移动一下标本 推进尺，如果视野中的物像不随之移动，说明此物像是目镜或物镜头表 面上的异物，而不是要找的物像，应继续调焦或移动标本推进器。如果 移动标本推进器物像随之移动，a. 转动细调节器，使镜台细微上升，使 标本上表面上的异物物像消失，进而出现真正要观察的标本物像；b. 如 第a种方法仍不能看到真正的标本物像，可继续用粗调节器缓慢下降镜 台，使标本下表面上的异物物像消失，直至看到真正的标本物像；c. 如果第a和第b种方法都不行，应重复调焦。 (3) 高倍镜的使用：由于高倍镜放大倍数高于低倍镜，其观察视野小于低倍 镜，所以在使用高倍镜前，应先用低倍镜寻找到需观察的物像，并将其 移至视野中央，同时转动细调螺旋，使被观察的物像清晰。 转动物镜转换器，使高倍镜转到工作状态（高倍镜头对准通光孔），此时， 视野中一般可见到不太清晰的物像，只需调节细调螺旋便可使物像清晰。 有时在低倍镜准焦状态下，直接转换高倍镜时会发生高倍镜镜头碰擦玻 片，而使高倍镜不能转换到位的情况。此时不能硬转，应检查玻片是否 放反、玻片是否过厚以及物镜是否松动等情况。 (4) 油镜的使用：由于油镜头放大倍数高于高倍镜，与上述同样原理，油镜 头观察视野小于高倍镜，所以用高倍镜找到所需观察的标本物像，并将 需要进一步放大的部位移至视野中央。将聚光器上升至较高位置并将光 圈开至最大（油镜所需光线较强）。转动物镜转换器，移开高倍镜，在玻 片标本上需观察的部位滴一滴香柏油作为介质，然后在眼睛的注视下， 使油镜转至工作状态，此时油镜的下端应正好浸在油滴中或与油滴接触。 双眼注视目镜的同时小心而缓慢地转动细调螺旋，直至视野中出现清晰 的物像。操作时不要过度转动细调螺旋，以免镜头下降压碎标本或损坏 镜头。在观察时，如需同老师或同学讨论视野中的某一结构，可用推进 器将该结构移至指针尖端处；如果镜中未装指针，可将视野看成一个周 缘带有刻度的钟面，说明该结构位于钟面的几点钟位置（如3点、6点、 9点、12点等）。油镜使用结束后，必须及时将镜头上的油擦拭干净。擦 试前，应将镜筒升高约1 cm并将油镜头转离通光孔；擦试时，先用擦镜 纸蘸少许二甲苯擦2次，再用干净的擦镜纸擦1次。至于玻片上的油， 如果是有盖玻片的永久制片，可直接用上述擦油镜头的方法擦净；如果 是无盖玻片的标本，则用拉纸法除去载玻片上的油，即先把一小片擦镜 纸盖在油滴上，再往纸上滴几滴二甲苯，立即将纸往外上方提拉23 次。如未擦净，应重复上述过程。 （5）显微镜使用后的放置方法：微镜使用结束后应及时复原，使其处于非工 作状态：先下降载物台，取下标本片，物镜转离通光孔；然后，上升载 物台，使物镜与载物台相接近；关闭光源，下降聚光器，关闭光圈。最 后，将显微镜罩上防尘罩，放在实验台正中央。（二）普通显微镜使用中应强化的几个部分 1. 显微镜的能力 显微镜的能力湿质量和性能的标志，它包括分辨力、放大力、焦点深度和视场宽度等，其中最重要的是分辨力。各种能力都有一定的界限，既相互作用，相互制约，如总放大率超过物镜的数值孔径的1000倍时，微细结构即分辨不清，为空放大；低于500倍时由于放大率过低液分辨不清。所以，使用时应统筹考虑。 2. 光路的合轴调整 （1）聚光器的调中； （2）物镜和目镜的选用于组合； （3）光阑及其使用。（三）暗视场显微镜的构造、原理和使用方法 1. 原理和结构特点 暗视野显微镜是利用丁达尔现象原理设计的。当一束光线透过黑暗的房间,从垂直于入射光的方向可以观察到空气里出现的一条光亮的灰尘“通路”,这种现象即丁达尔效应。暗视野显微镜在普通的光学显微镜上换装暗视野聚光镜后,由于该聚光器内部抛物面结构的遮挡,照射在待检物体表面的光线不能直接进入物镜和目镜,仅散射光能通过,因而视野是黑暗的。暗视野显微镜由于不将透明光射入直接观察系统，无物体时，视野暗黑，不可能观察到任何物体；当有物体时，以物体衍射回的光与散射光等在暗的背景中明亮可见。在暗视野观察物体，照明光大部分被折回，由于物体(标本)所在的位置结构，厚度不同，光的散射性，折光等都有很大的变化。它的结构特点主要是使用中央遮光板或暗视野聚光器。使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像并非物体的本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。但被检物体为非均质时，并大于12波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004 m以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2 m)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等,如图1-4及1-5。 暗视野显微镜基本结构是将普通显微镜光学组加上挡光片。普通显微镜只要聚光器是可以拆卸的，支架的口径适于安装暗视野聚光器，即可改装成暗视野显微镜。在无暗视野聚光器时，可用厚黑纸片制作一个中央遮光板，放在普通显微镜的聚光器下方的滤光片框上，也能得到暗视野效果。挡光片是用来挡住光源中间的光线，让光线只能从周围射入标本，大小约和光圈大小相同。不同倍率用不同的光圈，所以要制作不同的挡光片。 图1-4 图1-5 2. 使用方法:a. 把暗视野聚光器装在显微镜的聚光器支架上。b. 选用强的光源，但又要防止直射光线进入物镜，所以一般用显微镜灯照明。 c. 在聚光器和标本片之间要加一滴香柏油，目的是不使照明光线于聚光镜上面进行全反射，达不到被检物体，而得不到暗视野照明。d. 升降集光器，将集光镜的焦点对准被检物体，即以圆锥光束的顶点照射被检物。 如果聚光器能水平移动并附有中心调节装置，则应首先进行中心调节，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。e. 选用与聚光器相应的物镜，调节焦距(操作方法与普通显微镜相同)，找到所需观察的物像。 3. 实用范围和实际应用 暗视野显微镜常用来观察未染色的透明样品。这些样品因为具有和周围环境相似的折射率，不易在一般明视野之下看的清楚，于是利用暗视野提高样品本身与背景之间的对比。这种显微镜能见到小至4200nm的微粒子，只能看到物体的存在、运动和表面特征，不能辨清物体的细微结构。 临床上，暗视野显微镜常用于检查苍白的螺旋体。这是一种病原体检查，对早期梅毒的诊断有十分重要的意义。 4. 暗场显微镜的要求 要求载玻片和盖玻片必须无瑕疵和灰尘，物镜前透镜必须清洁无尘，盖玻 片和载玻片的厚度必须绝对符合要求。 5. 观察 观察暗视野显微镜下的活细胞。在黑暗的背景里，可见细胞、细胞核和细胞器的衍射光图像。4、 实验建议 1. 使用显微镜之前，应熟悉显微镜的各部分名称及使用方法。 2. 新鲜标本观察时，须加盖玻片，以免标本因蒸发而干燥变形或污染侵蚀物镜， 同时可使标本表面匀平，光线得以集中，有利于观察。 3. 进行显微镜操作的任何时段都禁止用手触摸镜头, 也不要将镜头碰到盖玻片。5、 实验报告及作业 1. 比较普通光镜与暗视野显微镜下洋葱表皮及细胞观察结果的差异。 2. 使用暗视野显微镜照明时，为什么必须在聚光器与载玻片之间进行油浸？ 3. 实验体会。实验二 荧光和相差显微镜及其使用 一、实验目的 了解相差显微镜、荧光显微镜的构造和原理，并掌握它们使用方法。二、实验用品1. 材料与标本：载玻片、盖玻片、擦镜纸、荧光染料、洋葱、轮叶黑藻。2. 器材：光学显微镜，相差显微镜，荧光显微镜。三、实验内容和方法（一）相差显微镜的构造、原理及使用方法 1. 原理 相差显微镜是荷兰科学家Zernike于1935年发明的，用于观察未染色标本的显微镜。活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化(振幅差)，这种振幅差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。相差显微镜和普通显微镜的区别是:用环状光阑代替可变光阑， 用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。 相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位指在某一时间上，光的波动所达到的位置。一般由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差太小，肉眼很难分辨， 只有在变相差为振幅差（明暗差）之后才能被区分。相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等于折射率与厚度的乘积之差（即光程之差）。而相差显微镜就是利用被检物的光程之差进行镜检的。相差显微镜与普通光镜的不同之处在于它有四个特殊结构：相差物镜、具有环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜和绿色的滤光片。生物学中使用的多为明反差相差显微镜。 原理是利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别，把通过物体不同部分的光程差转变为振幅（光强度）的差别，经过带有环状光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现观测的显微镜。主要用于观察活细胞或不染色的组织切片，有时也可用于观察缺少反差的染色样品。把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4（波长），如果再增加或减少1/4，则光程差变为1/2，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜4个特殊之处： 环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。分为两种：a.A+相板：将直射光推迟1/4，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。b.B+相板：将衍射光推迟1/4，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。 合轴调节望远镜：用于调节环状光阑的像与相板共轭面完全吻合。 2. 操作：（演示） 将灯室光圈和聚光镜光圈都开至最大。 首先将聚光镜转盘转至“0”位.物镜用20x相差物镜，将待观察标本放置 载物台上，正确利用精调节轮使之获得清晰图像。 取下目镜,换上中心调节望远镜. 握住望远镜身, 转动镜身上的黑帽以伸 长望远镜,直至获得一清晰的相板影相(黑环)。 将聚光镜上的相差选择转盘调至“20”位, 使之与使用的20x物镜相一致. 此时可见到另一个亮环。这是转盘上相环的影像, 用相环中心调节钮使亮 环和黑环重合。 取下中心调节望远镜, 换上目镜, 即可得到标本(动物细胞,自己做样品片) 的相差镜像。 用滴管吸取活细胞悬液滴在载玻片上,将盖玻片封好, 避免产生气泡。 观察培养的活细胞。 3. 在进行显微镜操作的任何时段都禁止用手触摸镜头, 也不要将镜头碰到盖玻 片。（二）荧光显微镜的构造、原理和使用方法 1. 原理落射光激发的荧光法（incident-light fluorescence Epi-FL) 是近代显微 镜检术中新发展出来的一种强有力的反差增强法。它将激发荧光用的光源改在物镜的上方，光由物镜上方经反光镜射入物镜去激发样品，从样品上被激发的荧光经物镜成像并穿透反光镜而由目镜观察。该方法较简便，效率高，50W的光源强度比透射荧光法的250W还强。荧光方法是利用波长较短的紫外光、紫光、蓝紫光、蓝光及绿光等去激发样品，只要样品中含有可产生荧光的成分，它便吸收短波的激发光而释放出波长较长的荧光。不同物质只能吸改特定波长的激发光，而释放的荧光也会有特定的波 长，因而 用作特异性的鉴定十分有效，如某些致病的细菌和螺旋体，受紫外光 激发后能发出它们特有的荧光，很容易作出鉴定，这种利用物质吸收激发光后放出特有荧光的方法称为自发荧光法。某些物质自身不会吸收激发光，或吸收后不能释放荧光，但可以吸收或吸附特定的荧光色素或染料，而这些特定的荧光色素或染料也只能吸收特定的激发光，再释放出特定的荧光，从而间接地鉴别出某种物质，这称为间接荧光法。上述荧光方法广泛应用于医学、生物学及工业的特异性研究和鉴别上。 荧光显微镜就其光路来分有两种： 透射式荧光显微镜: 激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱所以对观察较大的标本材料较好。 落射式荧光显微镜这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45度角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片双色束分离器阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。 2. 荧光显微镜使用方法 打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮 点。 透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在 物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所 要求的激发滤片双色束分离器阻断滤片的插块。 3. 用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心，使其 位于整个照明光斑的中央。 4. 放置标本片，调焦后即可观察。使用中应注意：未装滤光片不要用眼直接观 察，以免引起眼的损伤；用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊油镜；高 压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定， 影响汞灯寿命。 5. 观察：在示教台上的荧光显微镜下用蓝紫光滤光片，可见经0.01的丫啶橙 荧光染料染色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(暗绿 色和橙红色)。 6. 荧光显微镜标本制作要求： 载玻片 载玻片厚度应在0.81.2 mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方 面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧 光。有时需用石英玻璃载玻片。 盖玻片 盖玻片厚度在0.17 mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片， 这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如 氟化镁)的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发 光女可激发标本。 标本 组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物 镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。 封裱剂 封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.59.5时 较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/L pH9.09.5的碳酸盐缓冲 液的等量混合液作封裱剂。 镜油 一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制 的无荧光镜油，也可用上述甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低， 对图像质量略有影响。 7. 使用荧光显微镜的注意事项： 严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。 应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯515 min， 待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。 防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。 检查时间每次以12 h为宜，超过90 min，超高压汞灯发光强度逐渐下降， 荧光减弱；标本受紫外线照射35 min后，荧光也明显减弱；所以，最多不 得超过23 h。 荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热 时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再 用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。 标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑 料袋中4 保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。 8. 荧光图像的记录方法 荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将二者结合起来综合判断。结果记录根据主观指标，即凭工作者目力观察。作为一般定性观察，基本上可靠的。随着技术科学的发展，在不同程度上采用客观指标记录判断结果，如用细胞分光光度计，图像分析仪等仪器。但这些仪器记录的结果，也必须结合主观的判断。荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很易褪色减弱，要即时摄影记录结果。方法与普通显微摄影技术基本相同。只是需要采用高速感光胶片如ASA200以上或24以上。因紫外光对荧光猝灭作用大，如FITC的标记物，在紫外光下照射30 s，荧光亮度降低50 %。所以，曝光速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微摄影系统装置。标本的制作方法样品须经过石蜡包埋切片，然后用铁矾苏木精染色，普通光镜观察效果还可以4、 实验建议1. 严格按照荧光显微镜厂家说明书要求进行操作，不要随意改变程序。2. 观察对象必须是可自发荧光或已被荧光染料染色的标本。3. 应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯515 min， 待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。4. 载玻片、盖玻片及镜油应不含自发荧光杂质，载玻片的厚度应在0.81.2 mm 之间，太厚可吸收较多的光，并且不能使激发光在标本平面上聚焦。载玻片 必须光洁，厚度均匀，无油渍或划痕。盖玻片厚度应在0.17 mm左右。5. 防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。6. 选用效果最好的滤光片组。7. 检查时间每次以12 h为宜，超过90 min，超高压汞灯发光强度逐渐下降， 荧光减弱；标本受紫外线照射35 min后，荧光也明显减弱；所以，最多 不得超过23 h。8. 荧光标本一般不能长久保存，若持续长时间照射（尤其是紫外线）易很快褪 色。因此，如有条件则应先照相存档，再仔细观察标本。9. 荧光显微镜光源寿命有限，启动高压汞灯后，不得在15 min内将其关闭， 一经关闭，必须待汞灯冷却后方可再开启。严禁频繁开闭，否则，会大大降 低汞灯的寿命。标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电 扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待 灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。 10. 标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯 塑料袋中4 保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。 11. 若暂不观察标本时，可拉过阻光光帘阻挡光线。这样，既可避免对标本不 必要的长时间照射，又减少了开闭汞灯的频率和次数。 12. 荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”无或可见微弱荧光。 “+”仅能见明确可见的荧光。“+”可见有明亮的荧光。“+”可 见耀眼的荧光。 13. 较长时间观察荧光标本时，一定要戴能阻挡紫外光的护目镜，加强对眼睛 的保护。在未加入阻断滤光片前不要用眼直接观察，否则会损伤眼睛。 14. 激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象，因此尽可能缩短观 察时间，暂时不观察时，应用挡板遮盖激发光。 15. 荧光几乎都较弱，应在较暗的室内进行。5、 实验报告及作业1. 比较相差显微镜、荧光显微镜观察结果的差异。2. 为什么相差显微镜可以直接观察活体样品。3. 实验体会。实验三 细胞膜的渗透性一、实验目的1. 了解细胞膜对物质通透性的一般规律。2. 了解溶血现象及其发生机制。二、实验原理细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。渗透作用是细胞膜的主要功能之一。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。三、实验用品(一) 材料 鸡血细胞(二) 器材 普通显微镜、普通离心机、电子天平、10 mL 试管、10 mL刻度离心管、试管架，2 mL注射器（无需针头）或5mL移液管、洗耳球、滴管、载玻片、擦镜纸、记号笔等。(三) 试剂1. Alsever 溶液葡萄糖 2.05g柠檬酸钠(Na9C6H5O7.2H2O) 0.89g柠檬酸（C6H6O7.H2O） 0.05g氯化钠 0.42g蒸馏水 100 mL调pH至7.2，过滤灭菌或高压灭菌10 min，置4冰箱保存。2. 0.128 mol/L NaCl溶液。3. 0.05 mol/L NaCl溶液。4. 0.4 mol/L NaCl溶