使用制备型高效液相色谱的经验之谈

案例一:某特定化合物系强极性有机小分子，极性大、难挥发，采用硅胶柱层析不易提纯，需用其他分离技术来纯化。解决方法：终极目的是提纯该物质。总体策略“先看，后想，再行动”“看化学结构，想理化性质，定纯化方法。由于该化合物及相关杂质的理化性质决定了难以用常规的重结晶、蒸馏（精馏）、硅胶柱层析来分离纯化。结合实验室的具体条件，考虑采用反相制备型.高效液相色谱法（Preparative HPLC）来分离纯化之。方法步骤：1.了解样品及有关组分的情况2.样品预处理3.建立Analytical HPLCMethod4.优化Preparative HPLC 条件5.检查出现的问题6.回收纯化的物质。 更细致地来讲，开始Preparative HPLC 之前须明白：待分离样品及有关组分的信息所含化合物的结构信息（重点关注酸、碱性等极性基团）、UV 光谱图（涉及到后续试验检测波长设定）、分子量（分离后目标化合物LC-MS 检测确认）、待分离体系的复杂程度（所含化合物的数目，preparative HPLC 之前是否须经flash column 粗分）； 样品预处理最主要的是样品的溶解度（将尽量多的样品溶于体积相对较小的溶液中）以及待分离体系里是否含强酸、强碱性物质（潜在的“柱杀手”），样品溶液是否需要中和等；建立Analytical HPLC Method这一步，跟平常的HPLC 相似，重点关注待分离的目标化合物，使该物质与其前、后组分分离得尽量相隔远些（起码得基线分离，利于后续制备时放大），若流动相中必须添加改性剂，应尽量避免非挥发性的缓冲盐，优先选择易挥发性缓冲液（例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵、三乙胺、氨水等），否则要脱盐，得二次分离； 优化Preparative HPLC 条件通常来讲，制备柱是实验室现有的（色谱柱就这么定下来了，没得选择的余地，除非是需新购色谱柱），在Analytical HPLC 的基础上优化梯度分离方法、考察进样量、目标组分收集确认（LC-MS 测分子量）； 检查出现的问题 这一步是最需要费心留神的！很多时候，出了问题，根本就没有挽回的余地，当然了，有时也是亡羊补牢，犹为未晚；所以，更多的时候，是需要未雨绸缪，把可能会发生的事情尽量考虑周全！比如样品的溶解度（在甲醇、水、乙腈、流动相、四氢呋喃那、酸水、碱水中的溶解性如何？），若样品溶解性不好，第一步就卡住，很打击人滴！曾遇到过这么个实例一个某种酶抑制剂，含氮杂环类化合物，在上面提到的那些溶剂中溶解度都相当地小，analytical HPLC 虽然分离得很漂亮，但还是没法做。最后是通过结构修饰，在某活性基团上上个保护基，纯化，再脱保护，曲径通幽，绕了个圈才搞定！再比如，样品的酸碱稳定性、热稳定性，这涉及到分离后，如何除去流动相问题。若样品在酸性、碱性、加热等条件下，会变坏，那得万分谨慎了。虽困难，到从合成的角度来讲，也容易判断，合成过程中是否耐受过酸、碱、高温等剧烈条件，很多时候，可从这儿推测出样品的稳定性。同时，也可以回到出发点了解样品结构信息，是否含氰基-CN、活性酯键、游离氨基、游离羧基等，以防去除流动相过程中发生氰基变酰胺、酯水解、酸催化酯化等等情况，基础有机化学方面的知识可以派上用场。 回收纯化的物质万里长征最后一步，但极其需要走稳，否则就前功尽弃、徒劳无益了。可以先低温旋蒸掉乙腈（甲醇）后，再溶剂萃取或者沉淀出目标化合物；若热稳定性好的话，也可以直接旋蒸干水，或者用油泵拉干，量少的话。冷冻干燥也可以派上用场。具体情况具体分析吧。需要留心的是，虽然挥发性添加剂会旋蒸掉，但也不可能一蹴而就，在旋蒸过程中，梨形瓶里面的收集液酸碱性会越来越强的，相当于浓缩了酸碱，需要注意这个过程中目标化合物的稳定性，是否顶得住。案例二：某强极性、含氮碱性化合物的分离纯化 上面简单陈述了反相制备型高效液相色谱法分离纯化的基本流程及方法建立过程中的注意事项，下面，聊一个自己的亲身经历，在这次分离纯化过程中，该发生和不该发生的状况都遇到了，痛定思痛，与大家分享一下，前事不忘后事之师！对该强极性、含氮碱性化合物，先在analytical HPLC 上摸索分离条件，初次尝试乙腈-水体系，流动相中不添加任何改性剂，结果，分离效果极不理想，出峰偏早且色谱峰形差，拖尾严重！考虑在流动相中添加Formic Acid，调pH 2.0，抑制色谱柱残留硅羟基的解离，从而降低硅羟基效应。这么一试，效果立竿见影，再微调梯度洗脱强度，就这样在analytical HPLC 的条件模式好了，下一步，转移到preparative HPLC 上。制备分离之前，在溶解样品的时候，又遇到麻烦了，该化合物在纯甲醇、纯