L05069陈辉－结题论文

修饰壳聚糖分离纯化慈菇蛋白酶抑制剂研究陈辉， 郑铭集， 仇圣年，陈竞帆，余伟君（华南农业大学生命科学学院，广东广州 510642）摘 要：采用比较廉价的壳聚糖，通过甲醛和戊二醛的交联修饰制成微珠，再经过环氧氯丙烷活化和胰蛋白酶偶联，制成的亲和层析载体，对慈菇蛋白酶抑制剂进行纯化，实验结果表明，所制载体对抑制剂有吸附效果，并且能保证抑制剂的活性。关 键 词：壳聚糖；修饰；亲和层析；慈菇蛋白酶抑制剂中图分类号： 文献标识码：蛋白酶抑制剂是一类能够抑制蛋白水解酶活性的物质。根据它们抑制的蛋白酶类型可分为丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、和金属蛋白酶抑制剂。由于它们能抑制昆虫肠道内以及一些病原微生物体内的蛋白酶，因此蛋白酶抑制剂在植物对昆虫和病原体的侵染防御系统中具有重要的作用1。慈菇蛋白酶抑制剂protease inhibitor from Arrowhead(API)（分子量16，900a）是从慈菇球茎中分离纯化得到的双头多功能蛋白酶抑制剂，除了具备其他蛋白酶抑制剂在抗虫抗病方面的特点外，还有许多独特的优点。如，含量丰富、比活力高而且稳定;广谱性强，对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、激肽释放酶等多种蛋白酶有较强的抑制作用2。而这些蛋白酶是一些农业害虫肠道的主要消化酶，因此，慈菇蛋白酶抑制剂在植物抗虫方面的应用有着广阔的前景。近年来,慈菇蛋白酶抑制剂国内外研究较热,主要集中在活性结构中心,抑制机理和基因克隆与转化等方面。研究从慈菇中提取，分离，纯化则很少，至于考虑尝试其他更经济，有效的提取方法，国内尚未看到有相关报道。壳聚糖(chitosan)是N-脱乙酰基氨基葡萄糖的聚合物,被广泛用于酶和细胞的固定化。现在国内外已有不少报导将改性或修饰后的壳聚糖用于生物大分子的分离和纯化，并在蛋白质及酶类的纯化中获得较好的效果3,尤其是用于作为亲和吸附剂的载体用来分离纯化抑肽酶、木瓜蛋白酶4-5。本项目研究通过修饰壳聚糖，制成微珠，再进行活化得到亲和层析载体，对提取的慈菇进行纯化，得到较好的效果。1 材料与方法1.1 材料试剂与仪器设备1.1.1 材料试剂新鲜慈菇，市售；壳聚糖,分子量1.38106,脱乙酰度90.0%，黏度100cps；戊二醛（生化试剂纯）；甲醛；乙酸乙酯；Tween-80；环氧氯丙烷；Span80；丙酮；无水乙醇；Tris；Gly；Acr；Bis；NaCl；CaCl2；过硫酸氨；盐酸；硼砂；硼酸；冰醋酸；醋酸钠；磷酸二氢钠；磷酸氢二钠（以上试剂均为AR级）；胰蛋白酶（上海伯奥生物技术公司）；本甲酰L-精氨酸乙酯（BAEE）（上海蓝科生物技术公司）。1.1.2 仪器北京市六一仪器厂DYC-23A型电泳槽；江苏海门市麒麟医用仪器厂TS-1型脱色摇床；湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司电热恒温鼓风干燥箱；中国上海科析试验仪器厂恒温培养箱KXB-14A；eppendorf 5810R高速离心机；HWS24型电热恒温水浴锅；磁力搅拌器；Vivascience超虑器；抽滤装置；低温冰箱。1.2 方法1.2.1壳聚糖微珠的制备6-7取1g壳聚糖加入200ml 1醋酸溶液，搅拌3小时至完全溶解。再滴加2ml Tween80，边加边搅拌。滴加0.40.6 mL乙酸乙酯，搅拌均匀后，再滴加2 mLspan80，用电炉迅速加热到50，并保持50充分反应30min。升温至60，滴加36甲醛2ml，保持60恒温充分反应30min。再缓慢加入10mL2的戊二醛，边加边搅拌。调ph至9.0，升温至80反应1小时。抽滤，取滤渣先用丙酮洗，再用无水乙醇洗后置于80干燥，得到微黄色的壳聚糖微珠。1.2.2壳聚糖微珠亲和层析载体的制备4，6取0.5g壳聚糖微珠加50mL去离子水充分溶胀。吸去水后，再加入适量无离子水，并滴加环氧氯丙烷，活化。改用0.05m mol/L ph 7.5 Tris-Hcl 洗涤2次后加入到戊二醛硼砂缓冲液（0.025mol/L，ph7.8）反应4h。去离子水洗涤后加入胰蛋白酶硼砂缓冲液（0.025mol/L，ph7.8），0至4下搅拌24h。过滤，用0.5mol/L,ph1.5 NaCl-HCl缓冲液洗涤，直到洗出液中没有明显蛋白为止（280nmOD值小于0.02）即得到活化的亲和层析载体，可供过柱子用。1.2.3慈菇蛋白酶抑制剂的粗提称取100g已洗净、去皮的慈菇加入捣碎机，加入适量PBS缓冲液（pH 7.8），充分捣碎成浆糊状。将上述浆糊状液体静置15min，用纱布过滤，收集液液体，于75加热变性30min；弃去沉淀，将液体以10000 rpm/min离心15min，取上清液先后用10000Da和30000Da的滤膜超滤，收集10000Da30000Da的组分，即得慈菇蛋白酶抑制剂的粗品。1.2.4慈菇蛋白酶抑制剂的纯化8将以上所制的亲和吸附剂用0.1mol/L,ph7.8硼酸-硼砂缓冲液（含0.5M KCl，0.05M CaCl2）平衡。取抑制剂粗提液以1ml/min 上样。先用硼酸-硼砂缓冲液4 ml/min洗脱。再改用0.25mol/l,ph4.0醋酸钠醋酸缓冲液，2ml/min洗脱。最后用0.5 mol/l,ph1.5 NaCl-HCl缓冲液，2ml/min洗脱。收集活性性成分。1.2.5慈菇蛋白酶抑制剂的鉴定（常规PAGE明胶电泳）1.2.5.1 SDS-PAGE电泳法9（分子量方面） 1.2.5.2 PAGE明胶电泳10-11，根据Pharmacia(1984)方法进行，略有改动。1、碱性PAGE明胶系统（适用于检测中性或酸性的蛋白酶抑制剂）：分离胶7Arc、0.2Bis 和0.75mg/mL明胶，pH8.8；浓缩胶含4Arc，0.1Bis，pH 6.8。酸性PAGE明胶系统（适用于检测碱性的蛋白酶抑制剂）：分离胶14Arc、0.1Bis 和0.75mg/mL明胶，pH4.3；浓缩胶含4Arc，0.1Bis，pH 6.8。2、 酶解。根据Rosenberg(1996)的方法进行，略有改动。电泳完毕，将胶板置于0.1 mg/mL的胰蛋白酶溶液中，37保温1小时。室温下用50 mmol/L Tris-HCl,pH7.5（内含0.2mol/LNaCl,0.01mmol/LCaCl2）的反应基质溶液，漂洗酶解过的胶板1小时，摇床上进行，中间不断更换漂洗液。胰蛋白酶溶液同以上溶液配制。3、染色与脱色。常温下R250染色过夜，用0.1MNaCl脱色。1.2.6慈菇蛋白酶抑制剂的活力测定（BAEE法）111.2.6.1胰蛋白酶活力测定：取2个石英比色池（带盖，光程1cm），分别加入25预热过的2.8ml BAEE0.05M，pH8.0 Tris-HCl缓冲液（含2.22mgCaCl2/mL,0.34mg BAEE/mL）向一池加入0.20mL0.05M pH8.0 Tris-HCl缓冲液，混匀，作空白对照，调零。向另一池加入0.20ml酶液（相当于10微克结晶酶），立即混匀，在253nm处测其吸光值，30sec读一次数，持续5min。（若每分钟吸光值变化大于0.400，则酶液需稀释）。酶活力单位定义为单位时间里吸光值得变化量的10-3。1.2.6.2 慈菇蛋白酶抑制剂的活力测定：将抑制剂与胰蛋白酶作用后，按以上方法进行测定。然后前后两个值相减即为抑制剂的活力。2 结果与分析2.1 经过甲醛和戊二醛交联修饰的壳聚糖（图）2.2慈菇蛋白酶抑制剂的检测（考马斯亮蓝R250染色）2.2.1慈菇蛋白酶抑制剂SDS-PAGE凝胶电泳图以25L点样，可以看到，经过70热变性，杂蛋白依然比较多，而90热变性可以使抑制剂也丢失。因此，8082左右的热变性温度比较理想，C图中的带分子量约为20，000，与慈菇蛋白酶抑制剂的分子量17，000比较接近，因此可以断定该样品应该是抑制剂。2.2.2慈菇蛋白酶抑制剂PAGE-明胶碱性系统电泳图以35L及25L点样，依然看80热变性的泳道，可以证明所提物是抑制剂。1 2 3 4 5 6慈菇蛋白酶抑制剂PAGE明胶碱性系统电泳图1，4：70热变性材料；2，5：80热变性材料；3，6：90热变性材料1，2，3：35L加样量；4，5，6：25L加样量2.3慈菇蛋白酶抑制剂的活力测定所提取的慈菇蛋白酶抑制剂经过不同倍数的稀释后，进行活度测定，结果如下图所示。根据我们的活力定义可知，抑制剂的活力为8.3311.2之间（由于没有稀释到最适反应浓度，故只能得到一个活力的范围）。3 讨论实验进行到如今，基本完成了项目申请时的既定目标，但我们认为在以下几个方面的工作仍有充分发挥的空间，倘若有可能，可以继续引申和完善。3.1壳聚糖的交联修饰工艺可以继续优化 虽然成功进行了壳聚糖的微珠的制备，但我们发现制备结果的重复性不是很好，一次性大量制备壳聚糖微珠存在一定的困难，初步估计可能与我们实验中所使用的仪器设备相关，因为我们的每一步实验都使用生化实验室最常用的普通实验设备，因此怎样在现有条件下优化制备过程，以更好地制备壳聚糖微珠成为今后讨论的重点；3.2 壳聚糖的修饰方法可以继续探索和改造壳聚糖通过甲醛和戊二醛的交联修饰，经过活化和胰蛋白酶偶联，制备的亲和层析载体，对慈菇蛋白酶抑制剂有专一吸附效果，纯化效果不错，并且能保证抑制剂的活性。特别是过柱时在平衡液中加入适量的KCl和CaCl2，有比较好的效果，主要是由于KCl能增加缓冲效果并促进流速，同时CaCl2有利抑制剂的结合。但，是否只能应用戊二醛进行交联修饰呢？显然不是，我们可以根据壳聚糖的结构特点和化学性质，以及我们需要制备的载体类型来选用其他的试剂进行修饰，从而实现更好的效果。3.3 壳聚糖层析与其他载体层析应该进行对照实验显然，我们在设计实验时忽视了这点。进行慈菇蛋白酶抑制剂纯化，由于并没有使用葡聚糖G系列等层析柱做对照，因此应用自己制备的壳聚糖的纯化效果与其他层析载体相比较到底如何，有待后续实验的检验；3.4 慈菇蛋白酶抑制剂的抗虫模型需要建立慈菇蛋白酶抑制剂有广谱的抗虫效果，但项目设计中我们没有进行抗虫模型实验，因此缺少相关实验数据，进而也就缺乏实际应用的可行性报告，不能为其真正应用到实践生产中提供必要的参考，这有待在以后的实验中完善；参考文献：1 Ryan CA.AnnuRevPhytopathol,1990,28:425-4292 杨慧玲等.中国科学(辑),1991,2:1511613 AgarwalR,GuptaMN.J.AnalChimActa,1995,313(3):253-257.4 宋扬,侯司,赵辉,等.改性与修饰壳聚糖固定化酶纯化抑肽酶研究J.生物化学与生物物理进展,2000,27(1) 82-865 李红,王炜军,徐凤彩.壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶填充床反应器的试制研究J.华南农业大学学报,2000,22(3)60-626 张宏,谭竹钧. 壳聚糖微珠作为亲和层析载体的制备及其用于分离牛凝血酶的研究. 内蒙古大学学报(自然科学版).2003,34(1): 37-407 贺小进,谭天伟,戚以政等.球形壳聚糖树脂制备方法及吸附性能研究.离子交换与吸附.2001,6(1):47-538 刘铸英. 大孔吸附树脂提取酸性蛋白酶抑制剂研究. 离子交换与吸附.1989,5(4):251-25510 桑玉英,胡金勇,曾英. 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳快速检测胰蛋白酶抑制剂的方法. 云南植物研究. 2001，23（2）：2362389巫光宏,何平 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Chitosan Microspheres are actived by epichlorohydrin and connected with trypsin，which is prepared as Affinity Chromatography Carrier to Purifying prote