2-现代医药生物技术概论2012

现代医药生物技术概论 3 04 2012 核酸技术及药物 Email zhang biliang 张必良 CCTGAGCCAACTATTGATGAA PEPTIDE CCUGAGCCAACUAUUGAUGAA 传统中心法则 DNA RNA Protein 中心法则之例外 retrovirusesusereversetranscriptasetoreplicatetheirgenome DavidBaltimoreandHowardTemin RNAviruses mRNAintrons splicing PhilipSharpandRichardRoberts RNAediting deaminationofcytosinetoyielduracilinmRNA RNAinterference RNAi amechanismofpost transcriptionalgenesilencingutilizingdouble strandedRNA AndrewFireandCraigMello RNAs ribozymes cancatalyzeanenzymaticreaction ThomasCechandSidneyAltman RNA Protein Prionsareheritableproteinsresponsibleforneurologicalinfectiousdiseases e g scrapieandmadcow StanleyPruisner Epigeneticmarks suchaspatternsofDNAmethylation canbeinheritedandprovideinformationotherthantheDNAsequencemiRNAandpiRNAetc NobelPrizes 非编码RNA ncRNAs 可以通过多种遗传机理调控DNA的结构 RNA的表达及蛋白质的翻译和功能 进而在细胞 组织或个体水平上影响生物体的正常生长发育 RNA越来越为人们所重视 一个崭新的RNA时代已来临 1957年Hoagland Zamecnik及Stephenson等分离出tRNA1965年Holley等测定了酵母丙氨酰tRNA的序列 获得1968年诺贝尔医学奖1977年RobertsandSharp发现RNAsplicing 荣获1993年诺贝尔医学奖1981年中科院等完成了酵母tRNA Ala的人工全合成 这是世界上首次人工合成的一个具有完整生物活力的RNA1981年Cech等发现四膜虫rRNA的自我剪接 从而发现核酶 ribozyme 与Altman荣获1989年诺贝尔化学奖1993年Ambros发现第一个miRNA lin 4 1998年Fire和Mello发现RNAi 获得2006年度诺贝尔医学奖1999年Steitz等发现核糖体是核酶 获得2009年度诺贝尔化学奖2000年Reinhart等发现第二个miRNA let 7 2001年Tuschl等发现siRNA smallinterferingRNA 2006年Tuschl和Hannon等发现piRNA2009年Rinn等发现LincRNA RNA重大历史事件 OverviewofDNAtoRNAtoProtein AgeneisexpressedintwostepsTranscription RNAsynthesisTranslation Proteinsynthesis 核糖核酸 RNA 任何序列 多种多样2 结构和功能与蛋白 代谢物和其它核酸结合功能RNAs Riboregulators piRNAsmiRNAssiRNAsLincRNARiboswitchesRibozymes调控水平 转录翻译 LincRNA调控作用 LincRNA是基因间的长链非编码RNA largeintergenicnoncodingRNA 简称lincRNA PartI 核酶 Ribozyme PartII 适配体 Aptamer 和SELEX技术PartIII 反义核酸 Antisense PartIV RNA干扰 RNAinterference RNAi 核酸技术及药物 核酸技术及药物 1 什么是核酶 RIBOZYME 2 核酶有哪几类 3 什么是适配体 Aptamer 4 SELEX的原理是什么 5 核酸药物现状 6 反义核酸治疗原理 7 Fire和Mello发现RNAi的原理是什么 8 RNAi的应用有哪些 9 RNA干扰 RNAi 技术作为治疗药物最大障碍是什么 PartI Ribozymes 核酶 AbriefHistory Howmanyribozyme Why Catalyticefficiency condition 3Dstructureofribozyme Andamechanismofcatalysis Application Historyofenzymaticcatalysis W Kuhneintroduestheterm enzyme 1893W Ostwaldshowsthatenzymesarecatalysts1926J Summercrystallizestheenzymeureaseanddemonstratesthatitisaprotein 1977P Sharpdiscoversthesplicingofintrons 1982T CechshowsthattheintronofoneTetrahymenarRNAisselfsplicing Heproposestheterm ribozyme torefertocatalyticRNA1983S AltmandemonstratesthattheRNAmoietyofRNAsePissufficientforpartofitsactivity 核酶 Ribozyme 由于这类酶具有类似核糖核酸酶功能 而化学本质为核酸 因此被Cech称之为核酶 Ribozyme 核酶是一种具有核酸内切酶活性的RNA分子 可特异性地切割靶RNA序列 具有解离后重复切割相同靶分子的能力 ThomasR Cech T R Cech 1947 因发现RNA的生物催化作用而与奥尔特曼共同获得1989年诺贝尔化学奖 他独立地发现核糖核酸 RNA 不仅像过去所设想的那样仅被动地传递遗传信息 还起酶的作用 能催化细胞内的为生命所必需的化学反应 在他们的发现之前 人们认为只有蛋白质才能起酶的作用 他最先证明RNA分子能催化化学反应 并于1982年公布其研究结果 1983年证实RNA的这种酶活动 1982 Self splicinginTetrahymenapre rRNA groupIintron Krugeretal andCech Cell31 147 157 1982 SidneyAltman 奥尔特曼 S Altman 1939 因发现RNA的生物催化作用而获奖 Altman与Cech分别发现了核糖核酸 RNA 自身具有的生物催化作用 这项研究不仅为探索RNA的复制能力提供了线索 而且说明了最早的生命物质是同时具有生物催化功能和遗传功能的RNA 打破了蛋白质是生物起源的定论 1983 RNAsePisaribozymeGuerrier Takadaetal andAltman Cell 35 849 857 1983 核酶发现的意义 1 它突破了 酶是蛋白质 的传统概念 自从1926年J Summer首先结晶了脲素酶 Urease 并证明这个结晶蛋白能催化脲素水解以来 很多酶被纯化 而且都是蛋白质 从而酶被定义为 生物催化剂是一种称作酶的特殊蛋白 使代谢进程加速的生物催化剂 核酸性酶的发现无疑是对传统的酶和催化理论巨大的冲击 核酶发现的意义 2 核酸性酶的发现对科学家们普遍感兴趣的生命的起源这一问题有了新的认识 对生物前化学 prebioticchemistry 有重要贡献 长期以来对生命起源中是先有蛋白质还是先有核酸争论不休 核酸分子含有合成蛋白质的氨基酸序列的信息 而蛋白质 酶 又是在核酸修复 转录 剪接 翻译等等所有环节中必须存在的 因此谁先谁后的问题就像 鸡与鸡蛋 的问题一样令人困惑 长期以来 人们认为所有的生命形式在冗长的相互依赖的循环中 信息分子和功能分子是分离的 核酸是信息分子 而蛋白质是功能分子 核酸性酶的发现给人们以启示 即RNA分子不但有复制的功能 含有复制的信息 而且还有催化的功能 因此既是信息分子 又是功能分子 这些新的概念无疑将对生物前化学的研究开辟新的思路 Howmanyribozyme Why thehammerheadribozyme plantvirus thehairpinribozyme plantvirus hepatitisdeltaribozyme humanvirus neurosporaVSribozyme mitochondrialRNA groupIandgroupIIintronribozyme rRNAandmtRNA RNAseP tRNAmaturation Ribosome translation Spliceosome splicing 核酶的酶活性反应种类 核苷酸转移作用磷酸二酯键水解作用磷酸转移反应催化作用脱磷酸作用限制性内切酶作用肽基转移作用 Onemainreaction NucleolyticcleavageTransesterification SN2 FromLilleyTIBS 2003 HammerheadHaipinHepatitisdeltaVSribozyme Thehammerheadribozyme plantvirus discoveredinsmallRNAsatellitesofsmallviruses 1986 replicationbyrollingcirclemechanism Secondarystructure Thehammerheadribozyme plantvirus tertiarystructure ScottetalandKlug Science1996 enzyme substrate andcleavagesite A 1 1andC 17 Hammerheadribozymes Voet 31 53 Smallribozymes inRNAsofcertainplantviruses Reaction transesterification A3 5 phosphodiesterbondbetweentwoadjacentnucleotides red iscleaved A2 3 cyclicphosphodiesteranda5 OHresultfromtheclevage Hairpinribozyme Nature418 DoudnaandCech 2002 ThehairpinribozymeisacatalyticRNAderivedfromtheself cleavingandligatingdomainofthesatelliteRNAoftobaccoringspotvirus Reversibletransesterificationcatalyzedbytheribozyme Thehepatitisdeltaribozyme humanvirus FromLilleyTIBS 2003 GeneralstructureofgroupIIintrons RNAWorld11 1 adeninethatdrivesthefirstnucleophilicattack step1 arrowspointtowardstheexon intronjunctionsexonsasdashedlines GroupI IIintronribozyme rRNAandmtRNA DoudnaandCechNature 2002 GroupIintronribozyme rRNAandmtRNA Goldenetal andcechScience 1998 Catalyticefficiency condition ribozymefollowsaMichaelis Mentenkinetics E S ES E P k1 k2 k 1 allribozymeneedcationsforactivity M2 M Km k 1 k2 k1 10 5 10 7M kcat 0 5 2min 1 kcat Km 103 106M 1 min 1 Goodcatalyticefficiency 核糖体是一个核酶 Ban etal Science 289 905 2000 Peptidyltransferasecenter Ribozymetechnology Aspecifically designedribozymecleavesaspecificpathogenicRNAmoleculetomakeitinactive Forexample theviralRNAcausinghepatitisC Verypromisingresultsusingcellcultures Theribozymeissynthesizedinvitroandadministratedtothepatient Problems half lifetooshortandlowpotencyonceinthebody Reference Reviews LilleyTIBS 2003 DeRoseChem Biol 2002 Ferred AmareBiopolymer 2003 Article Krugeretal andCech Cell 1982 Guerrier Takadaetal andAltman Cell 1983 ScottetalNature 1995 Science 1996 RupertetalNature 2001 Science 2002 PartII SELEX AbriefHistory Themethod Afewexamples Biologicalapplication 适配分子 aptamer SELEX 指数级富集的配体系统进化技术 SystematicEvolutionofLigandsbyEXponentialenrichment AbriefHistoryEllingtonandSzostak Nature 1990 TuerkandGold Science 1990 InvitroselectionofRNAmoleculesthatbindspecificligandsAndrewD Ellingtonhigh affinityligandscouldconceivablybedevelopedforanytargetmolecule In VitroSelectionandIn VitroEvolution SELEX WilsonandSzostak Ann Rev Bioc 1999 Selectionagainstsmallmolecules Selectionagainstproteins Selectionofnewribozymes RNAworld TheATPaptamerstructure Invitroselectionofanenzyme Ribozymecatalyzingpeptidebondformationlikeribosome B Zhang T Cech Nature390 96 100 1997 B Zhang T Cech Chemistry Biology 5 539 1998 封面 Aptamer优点 l Aptamer的确定是通过体外过程完成的 它不依赖于细胞或动物 也不在体内 其特性可根据需要改变 2 由于不需要免疫动物和细胞 毒素和没有免疫源性的分子也可产生高亲和力的Aptamer 3 Aptamer能用化学合成的方法制备 具有很高的精确性和重复性 在变性条件下能纯化得到很高的纯度 在制备Aptamer的过程中几乎没有批与批之间的差异 4 标记分子如荧光素和生物素能标记到Aptamer的精确位置 在合成过程中亦可以衍生上去 5 Aptamer能可逆变性 变性后的Aptamer能在数分钟之内复原 并能长期储存和在常温下运输 SELEX技术和Aptamer应用 SELEX技术在基础医学研究中的应用 在药物筛选中的应用 在临床诊断中的应用等 Aptamer在流式细胞分析中的应用 Aptamer在传感器中的应用 Aptamer在荧光偏振分析中的应用 Aptamer在双位点分析中的应用 Aptamer与分子灯塔的结合 Aptamer在毛细管电泳中的应用 Aptamer作为分子开关 Aptamer检测固定在膜上的蛋白质 Aptamer阵列研究蛋白组等 SELEX技术的改进与发展 导向SELEX技术 复合靶分子SELEX技术 基因组SELEX技术等 PartIII 反义核酸技术 反义核酸 AntisenseTechnology Oligonucleotide P S 2 AlkyloligonucleotidePNAsMorpholinosLNA Antisense Antisensetechnology Asingle strandedRNAorDNAmoleculethatiscomplementarytoatargetmRNApairswiththemRNAandpreventstranslation Thisstrategyworkswellinthelaboratoryonculturedcellsandonmodelorganisms Clinicalexample treatmentagainstcancers ThetumorsizesdecreasedbutthiswasmainlyduetotheproductionofinterferonsinresponsetohighdosesofforeignRNA Ifthedosewasloweredtopreventtheinterferonresponse theclinicalbenefitslargelydisappearedaswell AntisenseMechanisms RNase HRISCStericdependantdependantblocking SummertonJ MorpholinoAntisenseOligomers TheCaseforanRNase HIndependentStructuralType BiochimicaetBiophysicaActa19991489 141 158 RepresentativeAntisenseStructures RNARISCdependant MorpholinoStericblocking PhosphorothioateRNase Hdependant Morpholino RNAHeteroduplex Watson CrickbondsBasespositionedforstrongbindingUsually25baseMorpholinooligosareused BlockingTranslation Asteric blockingoligostopstheinitiationcomplexasitmovestowardthestartcodon Withoutreachingthestartcodon thecompleteribosomecannotform Withoutthecompleteribosome theproteinwillnotbemade BlockingTranslation BlockingSplicing WhenaMorpholinobindstoboundaryofanexonandanintron theMorpholinocanchangepre mRNAsplicing ThisresultsinachangedmRNAandachangedprotein BlockingSplicing FDA批准的反义核酸药物 1998年Vitravene IsisPharmaceuticals 主治艾滋病患者中十分常见的巨细胞病毒视网膜炎 2003年又有一个 重磅炸弹 级的反义药物Fuzeon在美国上市 此药是新一代抗艾滋病病毒 HIV 新药 属于病毒的融合阻止剂类药物 能 锁定 HIV基因 使其无法发挥 融合 功能并在人类T淋巴细胞内复制 并最终消亡 2003年11月24日EN 101正式批准英 以两国共同研制的EN 101 Monasen 获得美国 罕见病用药新药 证书 准予在美国销售 EN 101是一种直接针对产生乙酰胆碱酶的mRNA的反义类药物 而乙酰胆碱酶的过量分泌是引起重症肌无力的直接原因 2006年6月9日 美国FDA又批准了一种新型反义药物在美国上市 ISIS 301012 RASONS 它是一种专门治疗家族性 遗传性 哮喘的新药 可从源头上遏制哮喘的发生 降低急性哮喘的死亡率 FDA批准的反义核酸药物 Mipomersen Genzyme GENZ 与IsisPharmaceuticals ISIS 发表第三阶段实验数据 以mipomersen治疗同合子家族性高胆固醇血症 HomozygousFamilialHypercholesterolemia Mipomersen属于首个载脂蛋白B apo B 合成抑制剂 目前处于后期开发阶段 它可通过防止患者体内导致动脉粥样化的脂蛋白形成而降低患者体内LDL C水平 目前 Genzyme和Isis两家公司正进行该药的一系列临床实验 包括 一项治疗heFH的3期临床实验 一项治疗重度血胆脂醇过多的3期临床实验 一项治疗冠心病高危人群 高胆固醇血症患者的3期临床实验 一项治疗对他汀类药物耐受性差 高危高胆固醇患者的2期临床实验 PartIV IntroductiontoRNAi AbriefHistory SiRNAandmiRNA RNAiMechanism Afewveryrecentstructures Biologicalapplication ApracticalexampleofsiRNA 2006年的诺贝尔生理学奖获得者 AndrewZ FireCraigC Mello 预备知识 dsRNA 双链RNA 包含正义链和反义链Dicer 属于RNase 家族 是dsRNA的特异性核酸内切酶siRNA smallinterferingRNA RNAi的关键效应分子 21 23个nt大小的双链RNARISC RNA inducingsilencingcomplex 具有核酸内切 外切以及解旋酶活性RdRP RNA dependentRNApolymerases 是RNAi的调节因子 使RNAi可以在生物体内传递 Cloningofpar 1 agenerequiredforembryonicpolarityMappedpar 1tosmallregionongeneticmapDNArearrangementsassociatedwithpar 1allelesidentifyacandidategeneRescuemutantwithwild typegene Problem can tgetlargeDNAclonescomprisingcandidategeneSolution MakeantisenseRNAfromcandidategeneandseeifcanphenocopyPar 1phenotype Caenorhabditiselegans RNA mediatedinterference SueGuo s antisense experiment SueGuo 1995GraduateStudentinKenKemphues lab SueGuo s antisense experimentCell81 1 201995 MoleculeInjected embryoniclethalityZC22 par 1 antisense52ZC22 par 1 sense54TSantisense0Z1antisense0H200 Surprisingly injectionofsenseZC22RNAalsoinducedpar 1phenotypes Itisnotclearwhataccountsforthiseffect Thebasisforthesenseeffectisunderinvestigationandwillnotbediscussedfurther AndyFireandCraigMello sExperimentNature391 8061998 MoleculesInjected twitchingunc 22 pure antisense0unc 22 pure sense0unc 22sense antisense100 Themixturewasatleasttwoordersofmagnitudemoreeffectivethaneithersinglestrandaloneinproducinggeneticinterference Thelowestdosetested 60 000moleculesofeachstrandperadult ledtotwitchingphenotypesinanaverageof100progeny Atthispoint theoriginalinjectedmaterialwouldbedilutedtoatmostafewmoleculespercell NoinjectionNoprobe NoinjectionProbewithmex3A Injectmex3BantisenseProbewithmex 3A Injectmex3BdsRNAProbewithmex 3A Effectsofmex 3RNAinterferenceonlevelsoftheendogenousmRNA 胚胎的原位杂交 dsRNAiscutin21 23ntfragments ZamorePD TuschlT SharpPA BartelDP Cell v101pp25 33 2000 ThemRNAiscutin21 23ntfragmentsbythesiRNA Zamoreetal Cell v101pp25 33 2000 AfirstmodelforthemechanismRNAi Zamoreetal Cell v101pp25 33 2000 22ntRNA IdentificationofDICER Bernsteinetal Nature 409 363 2001 MacRac etal Science 311 195 2006 Elbashiretal G D v18pp188 200 2001 TheRISCcomplex SiRNAandmiRNA FirstmiRNAinC elegans miRNAinC eleganswithhomologsInfliesandhuman miRNAinPlants miRNA siRNA Post transcriptionalCleavageofmRNA TranslationalrepressionofthemRNA Transcriptionalsilencing Reference Reviews BartelCell 2004 HannonNature 2002 Article Fireatal NatureV391pp806 811 1998 Elbashiretal G D v18pp188 200 2001 Bernsteinetal Naturev409 pp363 366 2001 内源和外源siRNA 内源的dsRNA21 23对碱基 siRNA 处理和输出 靶标可以是病毒或细胞RNA 靶标RNA切断和降解 RISC 外源siRNA21对碱基 细胞核内表达的shRNA 细胞质 细胞核 RNAi药物离我们还有多远 siRNA药物开发现状 CompanyTargetsDiseaseStatus RNAi药物开发可极大地节省时间和金钱 首次RNAi临床试验获成功Bevasiranib 靶基因 去年6月1日公布了以RNAi为基础的Bevasiranib能够关闭血管内皮生长因子 VEGF 基因 这种基因会刺激老年性黄斑变性患者视网膜上血管的生长 可能副作用 这种siRNA分子不会与DNA反应 因此不必担心该药物会改变患者的遗传组成 而在其他类型的基因治疗中 这是不可忽略的一个风险 已经证明 到目前为止最成功的XSCID基因疗法 治疗X连锁重度复合性免疫缺陷病的基因疗法 的临床试验中 接受这种基因治疗的其中三名儿童在治疗后患上了白血病 药效 Bevasiranib能够与其他药物联合使用 例如能抑制血管内皮生长因子的抗癌药物Avastin Avastin的效果只能持续几周时间 而Bevasiranib的效果则能持续更长的时间 临床II试验结果 对129名患者的试验发现 Bevasiranib能够减缓眼睛中血管的生长并改善视力 在最低剂量时 这种效果持续了数月 最高剂量时 这种好的效果一直到研究结束还存在 而且 试验中 除了药物注射位置的红肿外 没有观察到其他任何副作用 首个申请临床病毒感染疾病RNAi治疗药物 去年11月1日 Alnylam制药公司宣布向美国FDA提交一项研发新药 申请开始对药物ALN RSV01进行人类临床实验 这种药物是利用RNAi疗法治疗感染呼吸道合胞体病毒 respiratorysyncytialvirus RSV 的疾病 ALN RSV01的作用原理是利用RNAi对病毒衣壳N基因进行沉默 这个基因是病毒中最高度保守的基因之一 并且对病毒复制有重要意义 在体内动物实验和体外实验数据都显示ALN RSV01的高效性 通过ALN RS01滴鼻治疗后 在动物体内可以特