原核表达实验ppt课件.ppt

实验一 大肠杆菌表达载体的构建及融合蛋白诱导表达 生命科学技术学院2010年6月 1 黑曲霉的优化培养 总DNA或RNA的抽提 PCR或RT PCR扩增xynB基因 目的基因的TA克隆 质粒pMD xylB EcoRI XhoI双酶切 凝胶回收试剂盒回收目的片断xynB 乙醇沉淀回收线性化片断 大肠杆菌表达载体pET 28 a 酶连 酶连产物转化E coliDH5 挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒 PCR及酶切验证 2 3 4 5 IPTG100mM使用浓度0 1mMKan100mg ml使用浓度50 g mlPBS缓冲液 137mMNaCl2 7mMKCl10mMNa2HPO410mMKH2PO4 试剂及缓冲液 6 3 SDS缓冲液 187 5mMTris HCl pH6 8 25 6 w vSDS30 甘油0 03 w v溴酚蓝GelStainingBuffer 每100ml 考马斯亮蓝250mg甲醇45ml乙酸10ml水45mlGelDestainingBuffer 甲醇100ml乙酸100ml加水至1000ml 7 SDS PAGE胶 30 聚丙烯酰胺10 SDS1 5MTris HClpH8 80 5MTris HClpH6 810 过硫酸铵 现配 TEMED Tris 甘氨酸电泳缓冲液 25mmol LTris250mmol L甘氨酸 电泳级 PH8 3 0 1 SDS可配成5 贮存液备用 在900ml去离子水中溶解15 1gTris碱和94g甘氨酸 然后加入50ml10 w v 的电泳级SDA贮存液 用去离子水补至1000ml 8 操作步骤1 小规模诱导 筛选正确表达克隆子 1 从平板上挑取1个pET28 xylB BL21转化子接种于装有2mlLB Kan Kan浓度50ug ml 培养基的PA瓶中 37oC 250rpm 培养过夜 2 取过夜培养物按1 接种量分别转接二个装有2mlLB Kan的PA瓶中 37 培养约2小时40分钟 3 培养结束后 分别向其中一个瓶加入IPTG 终浓度0 1mM 并标记为 I 另一瓶不加IPTG标记为 I 28 培养 250rpm 约4小时后收集菌体 4 从 I I 培养瓶中各吸取1ml菌液于两个标有 I I 的1 5ml离心管中 离心收集菌体 10000rpm RT 1分钟 去上清 加入80ul缓冲液和40ul3 SDS上样缓冲液悬浮菌体 20 保存备用 9 5 取前面保存菌体 加入1 SDS上样缓冲液 置沸水5分钟 破细胞 然后置室温 6 在室温以10000rpm离心1分钟 取上清10 20ulSDS PAGE蛋白电泳检测 附 SDS PAGE胶的制备及蛋白质电泳 10 12 分离胶配制 5ml 水1 6ml30 聚丙烯酰胺2ml1 5MTris HCl pH8 8 1 3ml10 SDS0 05ml10 过硫酸铵0 05mlTEMED0 002ml 制备SDS PAGE胶 分离胶配制时 过硫酸铵和TEMED先不加 将制胶板跟电泳槽装配好 制胶板凹面朝向自己方便注胶 然后加入过硫酸铵和TEMED 将胶液混合均匀后注入制胶板中 再加入一定量水饱和正丁醇去除气泡 放置30分钟 待胶完全凝固 去除正丁醇 然后配制积层胶 11 5 积层胶配制 2ml 水1 4ml30 聚丙烯酰胺0 33ml0 5MTris HCl pH6 8 0 25ml10 SDS0 02ml10 过硫酸铵0 02mlTEMED0 002ml 积层胶制作方法跟分离胶制作相似 混合均匀后注入胶板 缓慢的插入梳子 静置30分钟 胶凝固后取出胶板 撕掉胶条 拔去梳子 再将胶板凹面背向自己装好电泳槽 缓慢向内槽倒入Tris 甘氨酸电泳液 使其没过凹槽 向外槽倒入与内槽持平的电泳液 12 点样 所有的样品和蛋白Marker点样前都要沸水浴5分钟使蛋白质完全变性 一般的点样量为10 20ul 点样完毕后即可开始电泳 先以80伏电压跑15 20分钟 蛋白质通过积层胶后 更换到120伏 待溴酚蓝接近分离胶底部后停止电泳 取下胶板 小心撬开胶板割取分离胶 放入染色皿中 加入一定染色液 没过胶面即可 置于摇床上染色30 45分钟 染色完毕后 回收染色液 加入脱色液 摇床脱色数次 前面几次可以时间较短 第一次约10分钟 依次时间稍微延长 最后一次可以过夜脱色 蛋白质电泳 13 1 挑取1个正确表达目标蛋白的转化子接种于装有2mlLB Kan Kan浓度50ug ml 培养基的PA瓶中 37oC培养过夜 2 按1 接种量接种于50mlLB Kan Kan浓度50ug ml 中37 培养约2小时40分钟 OD600 0 4 0 6 前两步与操作步骤1相同 3 培养完毕后 向三角瓶中加入IPTG 100mM 50 l 使培养液中IPTG终浓度为0 1mM 28 诱导培养 250rpm 约4小时后收集菌体 4 吸菌液1ml于1 5ml离心管中 另取20ml倒入50ml离心管中 离心收集菌体 6000rpm 4 10分钟去除培养基 加入2ml1 PBS缓冲液悬浮菌体 然后分装于2个1 5ml离心管中 10000rpm 离心2分钟 去上清 20 保存备用 操作步骤2 大规模诱导 大量表达目标蛋白 14 实验二 大肠杆菌细胞破碎及蛋白浓度测定 15 1 取出保存的诱导后的细胞 10ml 在冰上缓慢融化后 加入1mlPBS缓冲液 2 置冰上用超声波破碎细胞 将超声波发射探头插入菌液中 开始超声 10sec 次 间歇15sec 避免过度产热 重复数次 一般5 6次 直至溶液变清亮 所有过程均需在冰上进行 3 在4 13000rpm离心20分钟 可溶性蛋白存在于上清液中 不溶性蛋白存在于沉淀中 4 取上清液于另一干净的1 5ml离心管中 取40 l上清液测定总蛋白的浓度 16 采用BSA法测定蛋白浓度 Bradford 1972 首先作好标准曲线 然后将样品测得的OD在标准曲线上比较后获得样品蛋白质浓度 方法 1 完全溶解BSA蛋白标准品 5mg ml 用PBS将标准品稀释成100 500 g ml的溶液2 分别取40 L的不同浓度的溶液加入到1mL考马斯亮蓝试剂中 摇匀 室温反应3 5min后 在595nm处测定光吸收值 3 以光吸收值为横坐标 标准蛋白含量为纵坐标 绘制标准曲线 17 蛋白浓度标准曲线的绘制 18 1 取出保存的诱导后的细胞 10ml 在冰上缓慢融化后 加入1mlPBS缓冲液 2 置冰上用超声波破碎细胞 将超声波发射探头插入菌液中 开始超声 10sec 次 间歇15sec 避免过度产热 重复数次 一般5 6次 直至溶液变清亮 所有过程均需在冰上进行 3 在4 13000rpm离心20分钟 可溶性蛋白存在于上清液中 不溶性蛋白存在于沉淀中 实验三 表达蛋白的纯化 19 4 细胞破碎上清液中 加入Ni NTA树脂柱 在4 下结合1h 每5分钟摇动一次 然后5000r min离心1min移除上清液 5 加入10mmol L咪唑 imidazole 50mmol LpH7 5磷酸缓冲液 PBSbuffer 在4 条件下洗涤30min 弃上清 重复洗涤3次 保留Ni NTA柱 6 加入250 l100mmol L咪唑 imidazole 50mmol LpH7 5磷酸缓冲液 PBSbuffer 洗脱液 在4 条件下洗涤30min后5000r min离心1min 用移液器小心收集上清 应尽量避免吸到离心管底部的Ni NTA柱 置于新的1 5ml离心管中 20 贮存备用 20 实验四 表达蛋白的鉴定 western杂交 21 操作步骤1蛋白质电泳 取 20 保存的纯化好的蛋白样品 洗脱收集的上清 50 l 用PBS十倍稀释 取50 l稀释液 加入25 l3 SDS上样缓冲液 沸水水浴5分钟 领取一管 每块胶 GST蛋白样品作为阴性对照领取一管 每块胶 xylB蛋白样品作为阳性对照各样品在室温以10000rpm离心1分钟 取上清10 20ulSDS PAGE蛋白电泳 22 操作步骤2蛋白质的半干式电转移 戴手套操作 将蛋白胶的积层胶切除 当胶上的样品较少时 不含目的蛋白的胶应都切除 使剩下的胶块尽可能小 然后浸入Towbinbuffer中平衡 预先准备专用的滤片2张 或18张滤纸 和1张硝酸纤维素滤膜 其大小都应与凝胶大小吻合 用铅笔在滤膜一角做好标记 将1张滤片 或9张滤纸 在Towbinbuffer中浸润后放置在电极上 如用9张滤纸则应逐张叠放整齐 用玻璃棒挤出所有气泡 具体摆放顺序见下图 23 于Towbinbuffer中浸润硝酸纤维素滤膜 然后置于滤纸 片上 排出气泡 然后将平衡好的蛋白胶置于硝酸纤维素滤膜上 排出气泡 再依次将另外9张滤纸 1张滤片 在Towbinbuffer中浸润后放置在蛋白胶上 加上阴极电板 25V电压转移40分钟 转移完成后 取出NC膜 在TBS漂洗5min 置入丽春红染液中染色 出现蛋白条带后 用自来水漂洗1min 用铅笔标记处蛋白质Marker的位置 然后加入TBS漂洗至颜色消失 24 9层滤纸 电转缓冲液 9层滤纸 电转缓冲液 阳极 阴极 Trans BlotSDwithGelSandwich 25 操作步骤3膜的封闭 用含有5 脱脂牛奶的TBS T封闭NC膜 含有0 1 吐温20的1倍的TBS 在室温条件下孵育1至2小时 推荐在4 条件下孵育过夜 用TBS T漂洗 15分钟 1次 5分钟 2次 26 在室温条件下 将NC膜转入含有1 脱脂牛奶和合适稀释度的一抗的TBS T溶液中 1 1000 孵育1至2小时 用TBS T漂洗 15分钟 1次 5分钟 2次 操作步骤4一抗杂交 27 操作步骤5二抗进行杂交 在室温条件下 将NC膜转入含有1 脱脂牛奶和合适稀释度的二抗的TBS T溶液中 1 5000 孵育1小时 用TBS T漂洗 15分钟 1次 5分钟 3次 用TBS漂洗 5分钟 3次 28 操作步骤6DAB 3 3 二氨基联苯二胺 显色检测 加适量显色液至将膜浸没 观察 出现清晰的条带 最多5分钟 即可加入蒸馏水终止反应 29 TowbinBuffer 25mMTrispH8 3192mMglycine20 methanol10 TBS缓冲溶液 1L Tris Base24 2g NaCl80g pH7 6 显色液 10ml DAB6mg0 01MTris HCl pH7 6 9ml0 3 CoCl21ml30 H2O210ul 缓冲液配方 30 第一组 第二组 第三组 第四组配YPD液体培养基3L葡萄糖20g 酵母提取物10g 蛋白胨20g pH6 5定容至1L分装20ml 250ml三角瓶 75瓶200ml 500ml三角瓶 7瓶第五组 第六组 第七组 第八组配BMMY液体培养基4L酵母提取物10g 蛋白胨20g 酵母氮碱3 4g 硫酸铵10g 用pH7 0的0 1M的磷酸钾缓冲液定容至1L pH7 00 1mol L磷酸钾缓冲液 1mol LK2HPO461 5ml 1mol LKH2PO438 5ml 定容至1L 调节pH 定容至1L 分装50ml 250ml三角瓶 75瓶第九组 第十组 第十一组PA瓶100个 50ml离心管100个 洗好包好 灭菌250ml三角瓶200个洗好500ml三角瓶50个 试剂瓶20个洗好 31 第十二组 第十三组 第十四组配LB液体培养基6L胰蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl10g pH7 0定容至1L分装50ml 250ml三角瓶 40瓶200ml 500ml三角瓶 20瓶第十五组配置10 SDS w v 500mlTris 甘氨酸电泳缓冲液 配成5 贮存液备用 在900ml去离子水中溶解15 1gTris碱和94g甘氨酸 然后加入50ml10 w v 的电泳级SDS贮存液 用去离子水补至1000ml 染色液GelStainingBuffer1L考马斯亮蓝2 5g 甲醇450