流式荧光免疫技术.ppt

流式荧光免疫技术 主要内容 流式细胞仪的基本结构及其作用工作原理流式荧光免疫分析的技术要点流式荧光免疫分析技术的应用 流式荧光免疫技术 定义 是以流式细胞仪 FlowCytometry FCM 为检测手段的一项能快速 精确地对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和纯化的新技术 什么是FCM 流式细胞术 利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数 快速的定量分析及分选的技术激光技术 流体力学 光电测量技术 计算机技术 细胞荧光化学技术 单克隆抗体技术 流式细胞仪的结构 液流系统 流动室及液流驱动系统 鞘流原理 光路系统 1 激光光源及光束成形系统 氩离子 488nm 2 反光镜 光束形成器 透镜组 滤光片 小孔3 信号检测与分析 光电倍增管 PMT 补偿电路数据处理系统 存储 显示 分析系统 计算机 流式细胞技术原理 一 基本工作原理 将经荧光抗体或染色剂染色后的单个细胞悬液和鞘液分别经硅化管道进入流动室 形成鞘液包裹细胞悬液的稳态层流 使细胞不变的以稳定的层流形式通过喷嘴高速射下 与垂直向激光交汇 细胞大小和内部颗粒多寡不同而对激光产生不同散射 散射光的测定激光束上的低角度散射光被称为前向散射光 FS 主要反映细胞的大小 与激光束成90度角收集的散射光信号称侧向散射光 SS 主要反映细胞的颗粒特性 荧光细胞亦可发出荧光 FL 最常用于单克隆抗体标记的三种荧光染料FITCPE藻红蛋白 得州红 二 光信号的测定 散射光信号 光学系统 滤光片 置于荧光探测器前 限定其接收的荧光的波长范围 1 分选的基本原理流式细胞计的分选功能是由细胞分选器来完成的 总的过程是 由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴 根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选 而后由充电电路对选定细胞液滴充电 带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转 落入收集器中 其它液体被当作废液抽吸掉 某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的 2 分选技术要求分选速度 与细胞含量相关 一般5000个 秒 细胞特性分选纯度 仪器精密度 实验设计的选择 被选细胞的生物学特性等分选收获率 与纯度相对应纯度高则收获率相对低 反之 则高分选得率 与分选速度相关 速度越快则得率下降 反之 则高 三 细胞分选原理 流式荧光免疫分析的技术要点 免疫检测样品的制备细胞悬液的保存荧光染色细胞自发荧光质量控制 外周血淋巴细胞样品的制备常用淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞培养细胞的样品制备悬浮生长 直接吹打贴壁生长 蛋白消化酶 机械敲打 400目尼龙网过滤新鲜组织细胞悬液的制备机械法 剪碎法 网搓 研磨酶处理法 胰蛋白酶 胶原酶 胃蛋白酶化学试剂处理法 EDTA表面活性剂 破坏膜结构 免疫检测样品的制备 深低温保存法至少保存一年乙醇或甲醇保存法将悬浊液缓慢加入70 冷乙醇或75 冷甲醇 边加边振荡 4度保存 不超过两周甲醛或多聚甲醛固定法常用0 37 1 5 的甲醛缓冲液或多聚甲醛缓冲液固定 保存两个月 细胞悬液的保存 常用荧光染料条件 有较高的量子产额和消光系数 对488nm的激发光有较强的吸收 发射荧光波长与激发光波长之间有较大的差 容易与单克隆抗体结合而不影响抗体活性 荧光染色 荧光免疫标记荧光强度与光量子产额之间的关系F Q I e CL 1 与细胞成分的结合方式 结构亲和 嵌入结合 共价键结合 特异性结合 2 标记方法直接免疫荧光染色 间接免疫荧光染色 双参数或多参数分析师荧光抗体的组合标记 常用的单克隆抗体荧光标记探针 488nm激光激发 FITC 异硫氰酸荧光素 荧光强度可受pH的影响 当pH降低时其荧光强度也随之减弱PE 藻红蛋白 PerCP 多甲藻叶绿素蛋白 光量子产量并不太高 最好应用在检测表达较高的抗原上PerCP Cy5 5 叶绿素蛋白偶联物 PE Cy7 藻红蛋白偶联物 PE Cy5 藻红蛋白偶联物 又称Cy Chrome PE TexasRed 藻红蛋白 德州红偶联物 又称ECD 633nm激光激发 APC 别藻青蛋白 APC Cy7 别藻青蛋白偶联物 常用荧光染料组合 FITC PE 最常用的双色组合FITC PE PerCP 最常用的三色组合 进行多色荧光染色时荧光光谱重叠补偿很小 但PerCP光量子产量并不太高 最好应用在检测表达较高的抗原上 如CD4 8 3FITC PE PerCP APC 最常用的四色组合 一般PE和APC用于检测表达较低的抗原上 而FITC和PerCP用于检测表达较高的抗原上 如CD3 8 45 4PerCP Cy5 5与PE之间的重合光谱范围很小 也可用于四色组合PE Cy7可与FITC PE APC标记的抗体一同使用 荧光补偿小PE Cy5可与FITC PE同时使用 但不能与APC同时使用 二者之间荧光干扰太大PE TexasRed尽量不与PE同时使用 二者之间荧光补偿非常大 应用与评价 分析细胞表面标志淋巴细胞是正常机体免疫系统功能最重要的一大细胞群 在免疫应答过程中 末梢血淋巴细胞发育成为功能不同的亚群 各亚群的数量和功能发生异常时 就能导致机体免疫紊乱并产生病理变化 FCM可以同时检测一种或几种淋巴细胞细胞表面抗原 将不同的淋巴细胞亚群数量的测定来监控病人的免疫状态 指导治疗 分析细胞内抗原物质白血病分类是选择化疗方案和判断预后的重要依据 由于血细胞在其分化的不同阶段 承担不同功能时有不同的特征抗原表达 因此FCM结合单克隆抗体可以提高白血病分类诊断的附合率 根据白血病细胞所表达相关细胞的种系抗原 可将其分为B细胞系 T细胞系 髓细胞系 红细胞系和巨核细胞系 并可确诊白细胞的分类和分期 探明慢粒急变时的细胞来源 分析细胞受体对细胞受体进行定量定性分析 可做单细胞测定 也可从分析中剔除死亡细胞分析肿瘤细胞的DNA RNA含量FCM在肿瘤学上的应用主要是利用DNA含量的测定进行包括癌前病变及早期癌变的检出 指导化疗以及预后评估等工作 分析免疫细胞的功能分离纯化的细胞群可用于多种细胞各功能的分析例淋巴细胞和靶细胞共同培养后 可利用PI能渗透到死细胞致核染色的特点 分析死亡靶细胞的