食品微生物实验讲稿.doc

食品微生物学实验教案（首页） 授课时间： 2014-2015-1 教案编写时间： 2014年8月 课程名称食品微生物学实验课程代码总学时 32理论：48 学时实验：32 学时 学分2学分课程性质必修课（ ） 选修课（ ）理论课（ ） 实验课（ ）任课教师李雪 职称讲师授课对象2013级13食品营养与检测专1班56人 教 材和主要参考资 料教材：食品微生物学实验（内部教材）.2011 参考资料：1、 赵斌、何绍江主编微生物学实验科学出版社，20052、 熊元林，吴柏春主编.微生物学实验.华中师范大学出版社.20083、 郝林编食品微生物实验学技术中国农业出版社20014、 苏世彦主编食品微生物检验手册中国轻工业出版社19985、沈萍、范绣容、李广武，微生物学实验高等教育出版社，20036、黄秀梨主编微生物学实验指导北京:高等教育出版社，19997、周德庆主编微生物学实验手册上海：上海科学技术出版社，19868、周阜棣，俞子牛，何绍江主编农业微生物学实验技术北京：中国农业出版社，19969、杨文博主编，微生物学实验指导北京:科学出版社，200410、谢正旸、吴挹芳主编现代微生物培养基和试剂手册福州,福建技术出版社参考网站：1.htttp://（食品伙伴网）2. /（微生物之家）3. /（中国微生物资源信息库）4. /kech/biology（华中农业大学微生物学微生物教学网站）5. /（中国科学院微生物研究所）6. /（生物谷）7. /background.shtml（细菌学网站）8. /weishengwu.htm（美国微生物学会）9. /chinese/chinese.html（中国微生物信息网络）教学目标及要求1.重点掌握食品微生物学实验的基本知识、基本方法、提高实验基本技能。2.掌握微生物方法与其他生物学科的联系与应用，培养创新精神。3.实验报告写作要规范，培养团队合作能力。教学进程序号实验项目学时实验性质备注演示验证设计综合必做选做1环境和人体表面微生物检测42显微镜使用及微生物形态观察43革兰氏染色及芽孢染色44M显微镜直接计数和大小测定45细菌总数的测定46水中大肠菌群的测定47乳酸菌检测48甜酒酿的制作4实验项目实验一 环境和人体表面微生物检测实验性质综合设计性实验实验内容配制培养基；检测不同环境中的微生物。教学目的及要求学习配制培养基；学习不同的样品取样方法；比较环境对微生物数量和种类的影响。教学重点与难点重点：样品采集及无菌操作。难点：高压蒸汽灭菌锅的原理及使用方法。教学进程一、提出实验的相关要求二、提出实验的目的1.证明环境与人体表面存在微生物。2.观察不同类群微生物的菌落形态特征。3.学习基本的取样方法。三、原理 平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在37温度下培养，1-2天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。 高压蒸汽灭菌法是指用高温水蒸气进行灭菌的方法。高压蒸汽灭菌法可在较低的温度下达到与干热法相同的灭菌效果，因为：湿热中蛋白吸收水份，更易凝固变性；水分子的穿透力比空气大，更易均匀传递热能；蒸汽有潜热存在，每1克水由气态变成液态可释放出529卡热能，可迅速提高物体的温度。 高压蒸汽灭菌法一般采用121摄氏度，灭菌20-30min，如果是产孢子的微生物则应采用灭菌后适宜温度下培养几小时，再灭菌一次，以用于杀死刚刚萌发的孢子。四、操作步骤1实验准备（1）配制500ml培养，分装与4只250ml三角瓶中。（2）包扎30套培养皿，30支1ml移液管。（3）7支无菌水试管，包扎棉签。（4）上述物品121，高压蒸汽灭菌20min。教学进程2. 取样接种（1） 空气将牛肉膏蛋白胨琼脂平板置于实验室中，打开培养皿盖，是培养基暴露在空气中，30min后盖上皿盖。（此种培养基的制作过程及应用范围）（2） 物体表面将无菌棉签浸润，擦拭物体表面2cm2，在培养基表面“之”字型划线。（3） 人体表面手指：分别在洗手前和洗手后用同一根手指在培养基表面划线。头发：在培养基表面上方5cm处拨弄头发数次。口腔：在培养基表米娜6-8cm初，用力咳嗽。鼻腔：用浸润的无菌棉签在鼻腔内滚动数次，划线接种于培养基上。3. 培养将所有平板倒置于37培养箱中培养1-2d。4. 结果观察（1） 菌落计数（2） 菌落形态观察 根据菌落形态大小 、形态、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。但要注意，如果细菌太多，多个菌落生长在一起，不易观察菌落特征，要选择分离很开的单个菌落。（详细讲解单一菌落和单一菌种的区别）五、强调实验注意事项 注意无菌操作，避免实验结果被污染六、指导学生动手实验观察学生做实验并及时纠正学生错误的或不规范的实验操作，引导学生解决实验过程中遇到的问题。作业1、 完成本次实验报告2、 预习下次实验思考题1、培养皿为什么倒置培养？2、在食品工厂中，怎样进行食品接触面的微生物检测？课后总结分析1、 需要给学生强调高压蒸汽灭菌锅的使用方法，使用时必须仔细；2、督促学生养成良好的实验习惯。实验项目实验二 显微镜使用及微生物形态观察实验性质综合性实验实验内容讲述显微镜的构造和使用方法，特别强调掌握油镜的使用和保养；细菌放线菌酵母菌、霉菌的观察基本原理、基本步骤与注意事；制作临时装片。教学目的及要求掌握油镜的使用和显微镜的保养；掌握细菌、酵母菌和几种重要霉菌的形态特征；掌握制作临时装片的方法。教学重点与难点重点：油镜的使用和显微镜的保养；临时装片的制作。难点：观察不同微生物的观察基本原理、基本步骤与注意事项。教学进程1、 检查学生的预习情况，并对上次实验报告作出总结。二、提出实验的目的1.了解显微镜的结构及油镜工作原理。2.掌握细菌单染色法。三、基本原理1.油镜使用原理（1）增加照明度 香柏油的折射率n=152，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度。（2）提高分辨力显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜的分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。2. 简单染色原理 绝大多数微生物细胞都是无色透明的，当用显微镜观察时，其视野也是无色透明的，不便于观察，通过单染色可使细胞染上颜色，与无色透明那个的视野形成反差，便于观察细胞形态结构。细菌细胞通常带负电荷，能与但正电的碱性燃料离子相结合，从而使菌体着色。常用碱性染料：复红、番红、结晶紫、孔雀绿等。教学进程四、操作步骤1.显微镜使用（1）观察前的准备置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约34cm。调节光源， 调节光源时先将光圈完全开放，升高聚光镜至与载物台同样高，否则使用油镜时光线较暗。然后转下低倍镜观察光源强弱，凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、调节内置光源等方法调节光线。（2）低倍镜观察检查的标本需先用低倍镜观察，因为低倍镜视野较大，易发现目标和确定检查的位置。（3）高倍镜观察低倍镜观察到目标后不移动载物台，直接将高倍镜转至正下方，然后由目镜观察，同时用细调节器慢慢调节至物像清晰为止，找到最适宜观察的部位后，将此部位移至视野中心，准备用油镜观察。（4）油镜观察不移动载物台，直接将高倍镜与油镜转换为“八”字型；不取下玻片，直接在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油；从侧面注视，直接将转换到油镜头，此时油镜头浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头；从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，用细调节器调节直至看到清晰的物象；观察完毕，降下载物台。先用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许醇醚混合液（香柏油溶于醇醚混合液）擦去镜头上残留油迹，最后再用干净擦镜纸擦去残留的醇醚混合液。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。2. 染色装片制作（1） 涂片 在玻片上滴适量生理盐水，以无菌操作挑取细菌在水滴中打撒涂匀。（2） 干燥 室温下干燥。（3） 固定 菌膜向上，在火焰上方快速过火2-3次。（4） 染色用番红染色3-5min，水洗干燥。（5） 镜检 用油镜观察细胞形态特征，绘图。五、强调实验注意事项1.在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。2.涂片时水量和挑菌量适中。六、指导学生动手实验观察学生做实验并及时纠正学生错误的或不规范的实验操作，引导学生解决实验过程中遇到的问题。作业3、 完成本次实验报告4、 预习下次实验革兰氏染色法及芽孢染色思考题1、根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？2、用油镜观察时，为什么要在载玻片上滴加香柏油？课后总结分析1、 需要给学生强调显微镜结构精密，使用时必须细心；2、 规范操作；3、督促学生养成良好的实验习惯。实验项目实验三 革兰氏染色法及芽孢染色实验性质验证性实验实验内容讲述细菌革兰氏染色及芽孢染色的原理、方法、过程、注意事项及染色结果判断；微生物制片技术及染色的方法。教学目的及要求巩固微生物制片的方法；掌握革兰氏染色法和芽孢染色方法；观察分离到细菌的形态特征。教学重点与难点重点：革兰染色及芽孢染色的原理、方法及结果判定。难点：革兰染色中脱色度的把握及显微镜的使用。教学进程一、检查学生的预习情况，并对上次实验报告作出总结。二、提出实验目标1.了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。2.学习并掌握芽孢染色法。三、基本原理1.革兰氏染色革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。2. 芽孢染色 芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basicfuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。此时菌体即被染成红色，而芽孢难着色，仍呈绿色。教学进程四、操作步骤1.革兰氏染色（1）涂片 将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌及未知菌依次在一个玻片上涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰12次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。（2）染色初染 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗；媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗；脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约2030秒钟，立即用水冲净酒精。复染 用番红液染12分钟，水洗。镜检 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。2.芽孢染色（1）将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。（2）滴加35滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。（3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约45分钟。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约76）染10分钟。（4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。（5）用番红水溶液复染1分钟，水洗。（6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。五、强调实验注意事项1、革兰氏染色涂片的制备，无菌操作的，染色过程中脱色时间的掌握。2、无菌操作，染色过程中加热程度的掌握。6、 指导学生动手实验观察学生做实验并及时纠正学生错误的或不规范的实验操作，引导学生利用理论知识解决实验过程中遇到的问题。作业1、 完成本次实验报告2、预习下次实验思考题 作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？课后总结分析1、通过多次实验使学生认识革兰氏染色成败的关键是酒精脱色，从而加深对革兰氏染色原理的理解。 2、供芽孢染色用的菌种应控制菌龄；3、鼓励学生多动手操作，改良染色方法。实验项目实验四 微生物大小的测定及显微镜计数实验性质验证性实验实验内容显微测微尺的使用原理和方法；测量酵母细胞的大小；血球计数板的使用原理和方法，掌握微生物总数计数法。教学目的及要求1、了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。2、学习血球计数板的使用，掌握细菌总菌计数法。教学重点与难点重点：血球计数板的构造和其计数方法。难点：目镜测微尺的校正。教学进程1、 讲述目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理；2、 讲述血球计数板的构造和使用方法。血球计数板的构造血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大方格，中央的一大方格作为计数用，称为计数区。使用方法血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。1视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释100倍），以每小格的菌数可数为度。2取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。3将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上（不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高），然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。5计数6对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2-3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），按公式计算出每mL（g）菌悬液所含细胞数量。7测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存3、演示生物细胞大小的测定方法及微生物总数计数法。课后总结分析1、需要给学生强调显微测微尺及血球计数板是精密仪器，使用时必须细心； 2、对于不同菌体大小的表示方法需要强调。实验项目实验五、六 食品中微生物检测 实验性质综合设计性实验实验内容检测不同食品中的菌落总数和大肠菌群数，了解检测在食品卫生检验中的意义教学目的及要求1、 了解菌落总数测定在对被检样品进行微生物学评价中的意义。2、 学习并掌握大肠菌群的检验方法。教学重点与难点重点：食品中的菌落总数和大肠菌群数检测原理和方法。难点：样品采集及处理；结果判断，数据处理。教学进程一、检查学生的预习情况，并对上次实验报告作出总结。二、提出实验目标1.了解菌落总数测定在对被检样品进行微生物学评价中的意义。2.学习并掌握大肠菌群的检验方法。三、基本原理菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。（4）按（3）操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 次 1 mL 无菌吸管 或吸头。2.食品中菌落总数检测（1）选择3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），吸取 1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸 取 1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。（2）及时将冷却至 46 的平板计数琼脂培养基倾注平皿，混合均匀。（3）37培养24小时，观察结果。（4）菌落计数3.大肠菌群检测（1） 初发酵试验 每个样品选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3教学进程管LST肉汤发酵管，每支管接种1ml，36培养24-48小时候观察是否产气。（2） 复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤发酵管中分别取一环培养物，转接于BGLB复发酵管中，36培养24-48小时观察是否产气。（3）根据初发酵管大肠菌群阳性管数检索MPN表，报告每g（ml）样品中大肠菌群的MPN值五、强调实验注意事项过程中需要严格无菌，并且做好标识。六、指导学生动手实验观察学生做实验并及时纠正学生错误的或不规范的实验操作，引导学生解决实验过程中遇到的问题，理解实验目的总结实验细节。作业1、 完成本次实验报告2、预习下次实验思考题 1、食品中菌落总数检测的意义？2、大肠菌群的概念？大肠菌群检测的意义？3、 食品中菌落总数及大肠菌群检测的流程？课后总结分析1、了解食品中菌落总数及大肠菌群在食品卫生检验中的意义。2、掌握食品中菌落总数及大肠菌群的检验流程及结果判定。实验项目实验七 乳酸菌检测 实验性质综合设计性实验实验内容乳酸菌饮料中乳酸菌菌数的检测方法。教学目的及要求 1.了解酸乳中乳酸菌分离原理。2. 学习并掌握酸乳中乳酸菌菌数的检测方法。教学重点与难点重点：掌握乳酸菌菌数的检测方法。难点：接种过程中的无菌操作，实验结果的观察。教学进程一、检查学生的预习情况，并对上次实验报告作出总结。二、提出实验目标1.了解酸乳中乳酸菌分离原理。2. 学习并掌握酸乳中乳酸菌菌数的检测方法。三、原理活性酸奶需要控制各种乳酸菌的比例，有些国家将乳酸菌的活菌数含量作为区分产品品种和质量的依据。由于乳酸菌对营养有复杂的要求，生长需要碳水化合物、氨基酸、肽类、脂肪酸、酯类、核酸衍生物、维生素和矿物质等，一般的肉汤培养基难以满足其要求。测定乳酸菌时必须尽量将试样中所有活的乳酸菌检测出来。要提高检出率，关键是选用特定良好的培养基。采用稀释平板菌落计数法，检测酸奶中的各种乳酸菌可获得满意的结果。 四、步骤 1.样品稀释先将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品25ml加入盛有225ml无菌水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇，务必使样品均匀分散，即为10-1的样品稀释液，然后根据对样品含菌量的估计，将样品稀释至适当的稀释度。 2. 制平板 选用23个适合的稀释度，培养皿贴上相应的标签，分别吸取不同稀释度的稀释液1ml置于平皿内，每个稀释度作2个重复。然后用溶化冷却至46左右的MRS或改良CHALMERS培养基倒平皿，迅速转动平皿使之混合均匀，冷却成平板。 3.培养和计数 将平皿倒置于40恒温箱内培养2448h，观察长出的细小菌落，计菌落数目，按常规方法选择30300个菌落平皿进行计算。 五