第六章病毒研究分析.ppt

血液 荆楚理工学院生物工程学院向会耀邮箱 huiyao197662 QQ 286055621 病毒 病毒 一 病毒的一般特性二 噬菌体 体积微小 电子显微镜观察 可通过滤菌器结构简单 非细胞结构基因组 只有一种核酸 RNA或DNA 严格活细胞内寄生以复制方式繁殖对抗生素不敏感 耐冷不耐热 病毒的特点 体积微小 结构简单 只含有一种类型的核酸 只能在活的 敏感细胞内以复制方式增殖的非细胞型微生物 病毒概念 病毒引起疾病的特点 涉及面广 75 由病毒引起传染性强 传播迅速 如流感病毒病死率高 如狂犬病病毒后遗症严重 如脊灰病毒持续感染 如乙肝病毒引起肿瘤 如爱滋病毒致畸性 如风疹病毒特效药少 对抗生素不敏感预防是重点 一 病毒的大小与形态 病毒体 virion 完整的成熟病毒颗粒 具有典型的形态结构 并有感染性病毒的大小测量单位 纳米 nm 50nm小型病毒50nm 150nm中等大小病毒 大多数 150nm大型病毒 最大300nm 病毒的基本性状 微生物的大小比较 葡萄球菌 1000nm 牛痘病毒300 250nm A B C D E F G 立克次体450nm 衣原体390nm A 大肠杆菌噬菌体 65 95nm B 腺病毒 70nm C 脊髓灰质炎病毒 30nm D 乙脑病毒 40nm E 蛋白分子 10nm F 流感病毒 100nm G 烟草花叶病毒 球形病毒 天花病毒 病毒的形态多数病毒呈球形或近似球形 杆状 丝状 少数可为子弹状 砖块状 噬菌体可呈蝌蚪状 杆状病毒 噬菌体 狂犬病毒 病毒体结构模式 包膜子粒 包膜 核心 衣壳 壳粒 核衣壳 二 病毒的结构与功能 病毒的结构 核心 核酸 酶类衣壳 由壳粒 多肽 组成包膜 由宿主细胞膜或核膜组成镶嵌有包膜子粒 刺突 螺旋对称型 HelicalSymmetry 二十面体立体对称型 IcosahedralSymmetry 复合对称型 ComplexSymmetry 衣壳类型 螺旋对称型 helicalsymmetry 20面体立体对称型 icosahedralsymmetry 大多数球状病毒属之 3 复合对称型 complexsymmetry 病毒的组成成分 一 核酸种类 DNA RNA存在形式 单链与双链 正链与负链 分节作用 ORF可重叠 具有感染性二 蛋白质种类 结构蛋白携带全部遗传信息特点 有内含子 非结构蛋白作用 衣壳 基质 包膜蛋白 结构蛋白 酶 反式作用因子 非结构蛋白 一 生物学分类二 临床分类 三 病毒的分类 ClassificationofViruses 生物学分类 DNA病毒 类型分类特点病毒科名DNA病毒双链DNA 有包膜痘病毒科疱疹病毒科双链DNA 无包膜腺病毒科乳多空病毒科单链DNA 无包膜细小病毒科 类型分类特点病毒科名RNA病毒双链RNA 分节 无包膜呼肠病毒科双RNA病毒科负单链RNA 不分节 有包膜副粘病毒科弹状病毒科负单链RNA 分节 有包膜正粘病毒科布尼亚病毒科沙粒病毒科正单链RNA 不分节 无包膜小RNA病毒科杯状病毒科星状病毒科正单链RNA 不分节 有包膜冠状病毒科黄病毒科披膜病毒科 生物学分类 RNA病毒 类型分类特点病毒科名逆转录病毒双链DNA 不分节 有包膜嗜肝DNA病毒科单链RNA 不分节 有包膜逆转录病毒科 生物学分类 逆转录病毒 一 病毒的增殖过程二 病毒的异常增殖形式 病毒的增殖 ReplicationofViruses 吸附adsorption穿入penetration脱壳uncoating生物合成biosynthesis组装与释放assemblyandrelease 病毒的增殖周期 吸附 病毒的增殖过程 穿入 脱壳 早期蛋白 晚期蛋白 装配 DNA复制 核酸游离 成熟 释放 吸附病毒表面蛋白质与细胞接触 结合 特异性吸附 病毒配体位点与细胞膜特异受体结合 决定病毒的嗜组织性穿入 融合 有包膜病毒胞饮 无包膜病毒 CD21 EBV受体 CD4 HIV受体 CD46 麻疹病毒受体 CD54 鼻病毒受体 病毒受体 胞饮方式穿入 脱壳uncoating穿入胞质中的核衣壳脱去蛋白质 使基因组核酸裸露的过程依赖于脱壳酶 病毒核酸 病毒核酸 生物合成Biosynthesis利用宿主细胞提供的小分子物质合成病毒核酸和蛋白质 病毒mRNA的转录 复制子代病毒核酸 特异性mRNA转录 翻译子代病毒结构蛋白和功能蛋白 隐蔽期 早期 基因组在细胞内合成非结构蛋白 病毒复制酶及抑制细胞正常生物合成的抑制酶 晚期 根据基因组的指令在细胞内复制病毒核酸 合成结构蛋白和非结构蛋白 1 DNA病毒 双链 细胞核内合成DNA 细胞质内合成病毒蛋白 依赖DNA的RNA多聚酶 早期mRNA 转译 早期蛋白 药物作用的靶 晚期 解链 正链DNA负链DNA DNA多聚酶 子代DNA 转录 晚期mRNA 晚期蛋白 病毒衣壳蛋白及其他结构蛋白 2 RNA病毒 单链 多数在细胞质内合成子代RNA及病毒蛋白 1 正单链RNA病毒 有mRNA功能 正单链RNA 复制 子代RNA 结构蛋白 衣壳蛋白等 非结构蛋白 依赖RNA的RNA多聚酶 双链RNA 复制中间型 药物作用的靶 2 负单链RNA病毒 有依赖RNA的RNA多聚酶 负单链RNA 依赖RNA的RNA多聚酶 正单链RNA 有mRNA功能 子代RNA 结构蛋白 衣壳蛋白等 双链RNA 复制中间型 药物作用的靶 解链 3 逆转录病毒 有逆转录酶 即依赖RNA的DNA多聚酶 单链RNA 逆转录酶 进入细胞核 整合 前病毒 子代病毒RNA 病毒mRNA 病毒蛋白质 肿瘤发生 药物作用的靶 组装与释放assemblyandrelease 装配 assembly 释放 release 破胞释放 无包膜病毒 致细胞破裂死亡 一次大量释放芽生释放 有包膜病毒 病毒核衣壳出芽时套上宿主细胞的核膜或细胞膜 细胞不死 逐个释放 病毒的异常增殖 缺损病毒 defectivevirus 基因组不完整的病毒体 无感染性缺损干扰颗粒缺损病毒不能复制 但却能干扰同种成熟病毒体进入细胞辅助病毒 辅助缺损病毒复制具有感染力的完整病毒天然缺损病毒 腺病毒伴随病毒顿挫感染 流产感染 细胞条件不合适 病毒进入细胞但不能复制 非容纳细胞 顿挫感染容纳细胞 三类典型形态的病毒 廿面体对称的结构 球状 螺旋对称的结构 杆状 复合对称的结构 蝌蚪状 大肠杆菌的T4噬菌体是由椭圆形的二十面体头部和螺旋对称的尾部组合而成 是病毒中复合对称的代表 螺旋对称型 helicalsymmetry 20面体立体对称型 icosahedralsymmetry 大多数球状病毒属之 3 复合对称型 complexsymmetry 二 噬菌体 病毒种类很多 根据病毒寄生的对象来分 有植物病毒 动物病毒和微生物病毒 噬菌体 是病毒中的一种 一般把侵染细菌 放线菌的病毒叫噬菌体 把侵染真菌的病毒叫噬真菌体 噬菌体在自然界广泛存在 在1995年发表的ICTV的病毒分类与命名第六次报告中共报道了4000余种 分别划归为49个病毒科 据Bradley 1967 归纳 噬菌体共有六类形态 1 组成 主要由蛋白质和核酸组成 2 基本形态 蝌蚪形 微球形和纤丝形 一 噬菌体的形态结构与组成 以大肠杆菌T4噬菌体为例头部 廿面体对称结构 由蛋白质衣壳构成 内含一条DNA 颈部 薄盘状 附颈须 尾鞘 长95nm 衣壳粒螺旋对称 可伸缩 尾髓 中空 DNA可由此进入细胞 基板 六角形盘状物 其上有刺突 尾丝 刺突 有吸附功能 尾丝 有识别吸附功能 大肠杆菌T4噬菌体构造 2 蝌蚪形噬菌体的构造 二 噬菌体 phage 的繁殖 噬菌体并没有个体的生长过程 而只有其基本成分的合成和装配 即首先将各个部件合成出来 然后装配 所以一般将噬菌体的繁殖称做复制 根据噬菌体与宿主的关系 烈性噬菌体 指感染宿主细胞后 能够使宿主细胞裂解的噬菌体 温和噬菌体 或溶源性噬菌体 噬菌体感染细胞后 将其核酸整合 附着 到宿主的核DNA上 并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制 在一般情况下 不引起寄主细胞裂解的噬菌体 烈性噬菌体的繁殖过程一般分为五个阶段 即吸附 侵入 复制 装配和释放 1 烈性噬菌体的繁殖 吸附 噬菌体和宿主细胞上的特异性吸附部位进行特异性结合 噬菌体以尾丝牢固吸附在受体上后 靠刺突 钉 在细胞表面上 侵入 核酸注入细胞的过程 噬菌体尾部所含酶类物质可使细胞壁产生一些小孔 然后尾鞘收缩 尾髓刺入细胞壁 并将核酸注入细胞内 蛋白质外壳留在细胞外 复制 包括核酸的复制和蛋白质合成 噬菌体核酸进入宿主细胞后 会控制宿主细胞的合成系统 然后以噬菌体核酸中的指令合成噬菌体所需的核酸和蛋白质 装配 主要步骤有 DNA分子的缩合 通过衣壳包裹DNA而形成头部 尾丝及尾部的其它部件独立装配完成 头部与尾部相结合 最后装上尾丝 至此 一个个成熟的形状 大小相同的噬菌体装配完成 释放 方式 裂解 多以裂解细胞的方式释放 分泌 噬菌体穿出细胞 细胞并不裂解 通常情况下 一个噬菌体通过上述五个过程能合成100 300个噬菌体 烈性噬菌体的这种生长繁殖方式也称为一步生长 一步生长曲线 实验设计依据 1个菌体被1个噬菌体感染 避免二次吸附 细菌群体被噬菌体同步感染 实验过程 敏感菌10mlPhage1ml混匀 5min 使之吸附离心或用抗phage血清处理 去除过量phage高倍稀释 吸附phage的菌悬液 避免多次吸附 37 培养 定时取样 取样人为裂解处理 每5min 样品中加入氯仿裂解细胞 24 48h 裂解液加入敏感菌液中 适当稀释混合液 涂布于琼脂培养基上 计数噬菌斑 噬菌斑 概念 将少量噬菌体与大量敏感菌混合培养在营养琼脂中 在平板表面布满宿主细胞的菌苔上 可以用肉眼看到一个个透明的不长菌的小圆斑 称为噬菌斑 每个噬菌斑一般是由一个噬菌体粒子形成的 应用 噬菌斑可用于检出 分离 纯化噬菌体和进行噬菌体的计数 噬菌斑 以培养时间为横坐标 以噬菌斑数为纵坐标 绘制成的曲线为一步生长曲线 可分以下阶段 潜伏期裂解期稳定期 一步生长曲线 潜伏期 从噬菌体吸附细菌到细菌细胞释放新的噬菌体之前的这段时期 曲线平行于横轴 噬菌体数无变化 样品中无游离的噬菌体 潜伏期前的噬菌斑数是噬菌体数 也就是感染噬菌体的细菌数 裂解期 曲线直线上升 子代噬菌体不断释放到培养基中 直到达到一个极限 稳定期 感染细胞后复制的子代噬菌体全部释放 噬菌斑数稳定 一次感染结束 裂解量 每一受感染细胞所释放的新的噬菌体的平均数 稳定期噬菌斑数裂解量 潜伏期噬菌斑数不同的噬菌体或同种噬菌体感染敏感菌后所释放的噬菌体数不同 与噬菌体种类 宿主细胞菌龄以及环境因数有关 2 温和噬菌体与溶源性细菌 温和噬菌体 噬菌体感染细胞后 将其核酸整合 附着 到宿主的核DNA上 并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制 在一般情况下 不引起寄主细胞裂解的噬菌体 原噬菌体 或前噬菌体 即整合在宿主核DNA上的噬菌体的核酸 溶原性细菌 指在核染色体上整合有原噬菌体的细菌 可进行正常生长繁殖 而不被裂解 溶原性细菌的特点 可稳定遗传 子代细菌都含有原噬菌体 均具有溶原性 可自发裂解 温和噬菌体的核酸也可从宿主DNA上脱落下来 恢复原来的状态 进行大量的复制 变成烈性噬菌体 自发裂解几率10 2 10 5 可诱导裂解 用化学 物理方法诱导具有 免疫性 溶原菌对其本身产生的噬菌体或外来的同源的噬菌体不敏感 对同源噬菌体具免疫性 对