第五章-紫外可见吸光光度法.ppt

1 化学分析 常量组分 1 Er 0 1 0 2 依据化学反应 使用玻璃仪器 化学分析与仪器分析方法比较 仪器分析 微量组分 1 Er 1 5 依据物理或物理化学性质 需要特殊的仪器 准确度高 灵敏度高 2 仪器分析方法分类 2 电化学分析法 依据物质的电化学性质及其变化 3 色谱法 气相色谱 液相色谱 毛细管电泳法4 质谱法 热分析法 放射化学法等 3 吸光光度法基于被测物质的分子对光具有选择吸收的特性而建立的分析方法 5 1吸光光度法的基本原理 特点灵敏度高 测定下限可达10 5 10 6mol L 1 准确度能够满足微量组分的测定要求 相对误差2 5 操作简便 快速 选择性好 仪器设备简单应用广泛 4 一 光的基本性质 波动性 光的传播速度 c 真空中光速3 0 108m s 波长 单位 m cm mm m nm 1 m 10 6m 1nm 10 9m 1 10 10m 频率 单位 Hz次 秒 5 h 普朗克 Planck 常数6 626 10 34J sE 光量子具有的能量单位 J 焦耳 eV 电子伏特 1eV 1 602 10 19J 微粒性 光量子 具有能量 6 结论 一定波长的光具有一定的能量 波长越长 频率越低 光量子的能量越低 单色光 具有相同能量 相同波长 的光 混合光 具有不同能量 不同波长 的光复合在一起 例如白光 波粒二象性 7 光学光谱区 8 二 物质对光的选择性吸收 物质的颜色与光的关系 完全吸收 完全透过 吸收黄色光 光谱示意 表观现象示意 复合光 9 不同颜色的可见光波长及其互补光 10 价电子相对于原子核的运动 电子能级 能级差 1 20ev 吸收波长 1 25 0 06 m 紫外 可见光谱或电子光谱 2 原子核在其平衡位置附近的相对振动 振动能级 能级差 0 05 1ev 吸收波长 25 1 25 m 红外光谱或分子振 转光谱 3 分子本身绕其重心的转动 转动能级 能级差 0 005 0 05ev 吸收波长 250 25 m 远红外光谱或分子转动光谱 物质分子内部3种运动形式及其对应能级 11 三 定性分析与定量分析的基础 定性分析基础 定量分析基础 物质对光的选择吸收 在一定的实验条件下 物质对光的吸收与物质的浓度成正比 12 5 2光的吸收定律 郎伯 比耳定律 郎伯 比耳定律 吸光度与透光度的关系 偏离郎伯 比耳定律的原因 13 一 郎伯 比耳定律 透光度 透射比 Transmittance 透光度定义 T取值为0 0 100 0 全部吸收 T 0 0 全部透射 T 100 0 14 朗伯定律 1760 A b当入射光的 吸光物质的c一定时 溶液的吸光度A与液层厚度b成正比 比耳定律 1852 A c当入射光的 液层厚度b一定时 溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比 15 意义 当一束平行单色光通过均匀 透明的 非散射的吸光物质时 其吸光度与溶液液层的厚度和浓度的乘积成正比 A lg I0 I abc 前提条件 单色光 应选用 max处测定 吸光质点形式不变 离解 络合 缔合会破坏线性关系 应控制条件 酸度 浓度 介质等 稀溶液 浓度太大 分子间作用力增强 16 吸光度与透光度 T 透光度 A 吸光度 T T 0 0 A T 100 0 A 0 0 A 0 434 T 36 8 17 吸光系数 b 吸光液层的厚度 cm c 吸光物质的浓度 g L mol L a 比例常数 入射光波长 物质的性质 温度 取值与浓度的单位相关 c mol L a 摩尔吸光系数 cm 1 mol 1 L c g L a 吸光系数 L g 1 cm 1 MolarAbsorptivity 18 溶液浓度的测定 A bc 工作曲线法 标准曲线 朗伯 比耳定律的分析应用 吸光度的加和性与吸光度的测量 A A1 A2 An 19 二 偏离郎伯 比耳定律的原因 主要原因 非单色光 吸光质点的相互作用 20 5 3紫外 可见吸光光度计 分光光度计的构成 分光光度法的灵敏度和准确度 21 22 23 紫外 可见分光光度法 UV VIS 光源 单色器 吸收池 检测器 显示 24 吸光分析法的仪器简介 紫外 可见分光光度计组件 光源 单色器 样品池 检测器 显示装置 氢灯 氘灯 180 375nm 卤钨灯 320 2500nm 基本要求 光源强 能量分布均匀 稳定 作用 将复合光色散成单色光 棱镜 光栅 玻璃 350 3200nm 石英 185 4000nm 光学玻璃 石英 作用 将光信号转换为电信号 并放大 光电池 光电管 光电倍增管 光导摄像管 多道分析器 微安表 检流计 屏幕 数字显示记录仪 25 26 棱镜 依据不同波长光通过棱镜时折射率不同 27 光栅 在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕 600 1200 2400条 mm 利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光 波长范围宽 色散均匀 分辨性能好 使用方便 28 单光束分光光度计 可变波长单光束紫外 可见分光光度计示意图 29 吸光光度法的灵敏度与准确度 灵敏度 吸光光度法是一种适合于微量组分测定的仪器分析法 检测限大多可达10 3 10 4g L或 g mL数量级 准确度 能满足微量组分测定的要求 一般相对误差2 5 30 对摩尔系数的理解一 1 1 104 测定 工作曲线的斜率即为摩尔吸收系数 摩尔吸收系数是对吸光物质而言 是由吸光物质的结构特征 吸光面积等因素决定 灵敏度的表示方法 摩尔吸光系数 当b 1时 31 对摩尔系数的理解二 对同一种待测物质 不同的方法具有不同的 表明具有不同的灵敏度 例 分光光度法测铜 铜试剂法测Cu 426 1 28 104L mol 1 cm 1 双硫腙法测Cu 495 1 58 105L mol 1 cm 1 一般情况 104 104 105 105 低灵敏度 中等灵敏度 高灵敏度 32 影响准确度的因素 仪器测量误差 吸光定律 根据误差传递公式 有 又 得 浓度测量的相对偏差 令 得 T 0 368 36 8 A 0 434 时 仪器测量误差最小 33 浓度测量的相对误差与T 或A 的关系 实际工作中 应控制T在10 70 A在0 15 1 0之间 调c b 34 5 4实验条件的选择 测量条件 分析条件 35 测量条件的选择 测量波长的选择 无干扰 选择测量 max 有干扰 待测溶液吸光度的选择 控制 A 0 2 0 8 T 65 15 方法 选择C 选择b 1非单色光影响小 2灵敏度高 36 用参比溶液调T 100 A 0 再测样品溶液的吸光度 即消除了吸收池对光的吸收 反射 溶剂 试剂对光的吸收等 参比溶液 I0 I 参比 样品 37 参比溶液的选择 原则 扣除非待测组分的吸收 以显色反应为例进行讨论 M R M R max 试液显色剂溶剂吸光物质参比液组成 无吸收 无吸收 光学透明 溶剂 基质吸收 无吸收 吸收 不加显色剂的试液 无吸收 吸收 吸收 显色剂 基质吸收 吸收 吸收 吸收 显色剂 试液 待测组分的掩蔽剂 若欲测M R的吸收 A 样 A 待测吸光物质 A 干扰 A 池 A 参比 A 干扰 A 池 38 吸光光度法分析条件的选择 显色反应 有机物质 官能团强吸收 直接测定 UV VIS 官能团弱吸收 衍生化反应 UV VIS 无机物质 通常通过显色反应生成吸光系数大的有色物质进行测定 以提高灵敏度 39 显色剂与显色反应 40 显色反应的选择 灵敏度高 一般 104 选择性好 显色剂在测定波长处无明显吸收 对照性好 max 60nm 反应生成的有色化合物组成恒定 稳定 显色条件易于控制 重现性好 41 酸度的选择 酸度的影响 副反应 M nR MRn OH H 存在型体的变化 RH R H 1 2 生成不同配比的络合物 例 磺基水杨酸 Fe3 pH 2 3 FeR 紫红色 pH 4 7 FeR2 橙色 pH 8 10 FeR3 黄色 42 酸度的选择 理论计算 例 邻二氮菲 亚铁反应完全度与pH的关系 cR R 10 4mol L 1 43 可得适宜pH范围 实际工作 作A pH曲线 寻找适宜pH范围 pH3 8 44 显色剂的用量 M nR MRn 定量反应 理论计算 45 c R c R c R 实际工作 作A CR曲线 寻找适宜CR范围 46 温度的选择 实际工作 作A T曲线 寻找适宜反应温度 反应时间的选择 实际工作 作A t曲线 寻找适宜反应时间 47 测定中的干扰以及消除方法 化学法 48 5 5吸光光度法应用示例 单组分的测定 多组分的测定 紫外光度法在生物学中的应用 49 纯