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细胞自噬介绍与相关研究 崔龙萍 程序性死亡和非程序性死亡细胞凋亡 称为 型程序性细胞死亡 细胞坏死 是细胞对外界损伤刺激的一种非程序性死亡方式 细胞自噬 细胞死亡 三者有什么区别呢 凋亡 细胞皱缩 体积缩小 部分细胞器 核糖体和核碎片被细胞膜包裹形成凋亡小体 从细胞表面出芽脱落 最后被具有吞噬功能的细胞吞噬 磷脂酰丝氨酸外翻 细胞核染色质浓缩 边缘化 染色质DNA断裂 坏死 细胞胀大 胞膜破裂 细胞内容物外溢 核变化较慢 DNA降解不充分 引起局部严重的炎症反应 自噬 部分细胞器肿大 在细胞质中形成包裹细胞质内容物的双层膜囊泡结构 再与溶酶体结合实现内容物的降解 自噬 autophagy 又叫做 型程序性细胞死亡 是指细胞利用溶酶体降解 选择性地清除自身受损 衰老或过剩的生物大分子和细胞器 释放出游离小分子供细胞回收利用的正常动态生命过程 被认为是机体的一种自我保护机制 自噬概念 1 应激功能是细胞在饥饿条件下的一种存活机制2 防御功能当细胞受到致病性微生物感染时 可起到防御作用3 维持细胞稳态在骨骼肌和心肌可帮助细胞浆成分进行更新4 延长寿命如果细胞自噬受损衰竭 细胞损伤就会堆积 累加 产生老化 长期适当减少热量的摄入 可以延长寿命 5 控制细胞死亡及癌症决定细胞自噬导致细胞死亡 还是维持细胞存活的因子尚不完全清楚 所以 细胞自噬与细胞死亡之间的因果关系还没有最后定论 生物学意义 1956年 Clark和Novikoff用电镜在鼠肾组织中观察到包含线粒体等胞质结构的膜性结构 将其命名为致密小体 且在这个独立的膜结构中发现了溶酶体酶1962年 Ashford和Porter在老鼠的肝细胞中 观察到包含半消化的线粒体和内质网的膜囊泡结构 且在囊泡内发现了胰高血糖素1963年 Duve将这种细胞中存在的包裹细胞质的膜泡发生现象定义为自噬 并指出自噬发生在正常细胞内且与溶酶体相关联1997年 第一个酵母菌自噬基因被日本科学家克隆得到 命名为ATG11998年 第一个哺乳动物自噬基因被美国科学家克隆得到 命名为Beclin12007年 召开了第一次国际自噬会议2007 至今 随着越来越多的自噬基因被克隆 对于自噬的研究报道也越来越多 尤其是在哺乳动物细胞自噬方面的研究 自噬发展 分子伴侣介导自噬 CMA chaperone mediatedautophagy CMA不涉及囊泡的运输 而是通过有着特异性肽链的细胞质蛋白在分子伴侣复合物的作用下与溶酶体膜蛋白感受器Lamp2a结合后进入溶酶体腔 然后被溶酶体酶消化 小 微自噬 Microautophagy 溶酶体 液泡表面的膜直接吞没某些细胞器或者蛋白 然后膜内陷 脱离 最终形成一个包含了细胞质内容物的内部囊泡 大 巨 宏自噬 Macroautophagy 是我们平常所说的自噬 通过形成具有双层膜结构的自噬体包裹胞内物质 最后自噬体与溶酶体融合 包含杯状体 Phagophore 自噬体 Autophago some 自噬溶酶体 Autolysosome 的形成和囊泡内含物的降解 Degradation 四个过程 自噬分类 形成过程 Atg1 ULK1激酶复合物 自噬的诱导阶段 受mTOR的调控 Atg1能与Atg13 Vac8 Atg17和Cvt9等蛋白形成Atg1复合物 营养条件充足时 Atg13过度磷酸化 与Atg1的结合受阻 然后Atg13与Vac8结合 Atg1与Cvt9结合后一起调控Cvt途径 相反 营养不足时 Atg13部分去磷酸化形成Atg13 Atg1复合物 Atg17再与Atg1 Atg13复合物的Atg1结合形成复合物参与自噬 ULK1是Atg1在人类细胞中的同源物 两条泛素化系统 自噬体的形成 囊泡的延伸和完成 Atg12 Atg5 Atg16泛素激活酶E1 Atg7 的半胱氨酸残基 在ATP的作用下 与Atg12碳末端的甘氨酸残基之间形成硫酯键 泛素激活酶E2 Atg10 的半胱氨酸与Atg12碳末端的甘氨酸残基形成新的硫脂键 释放出Atg7 最终 Atg12碳末端的甘氨酸与Atg5的 赖氨酸氨基形成异肽键 释放出Atg10 形成Atg12 Atg5复合物 不可逆 Atg16碳末端的螺旋区寡聚化后与Atg12 Atg5复合物结合 形成一个350KDa大小的复合物 Atg12 Atg5 Atg16 Atg16仅仅与Atg5结合 并不结合Atg12 Atg12 Atg5 Atg16复合物对于隔离膜的延伸是必不可少的 Atg8 LC3 PE 磷脂酰乙醇胺 复合物半胱氨酸蛋白酶Atg4作用于Atg8 Atg8失去一个精氨酸残基 暴露出碳末端的甘氨酸残基后 在ATP的作用下 被Atg7 E1 激活 然后再与Atg3 E2 结合 形成Atg8复合物 最后 Atg8不再与其它蛋白结合 而是与PE结合形成Atg8 PE复合物 Atg8与PE的酯化反应 使Atg8的构象发生变化 参与自噬的膜动力学 Atg4可以破坏脂蛋白的连接 使Atg8 PE去结合 从而使胞浆中Atg8的量增加 Atg8 PE的结合与去结合之间的循环对于自噬的正常过程非常重要 LC3 微管相关蛋白 是Atg8在哺乳动物细胞中的同源物 因此 LC3可用来作为检测哺乳动物细胞自噬的标志性蛋白 Vps34 PI3K Atg6 beclin1 自噬体形成的早期阶段有着重要的作用 Vps34与蛋白激酶Vps15结合形成稳定的Vps34 Vps15复合物 定位于细胞质膜上 Vps34 Vps15复合物存在两种形式 涉及多种细胞膜转运途径 Vps34 Vps15与Atg6和Atg14组成的I型复合物调控自噬 Vps34 Vps15与Atg6和Vps38组成参与PAS途径的II型复合物 在哺乳动物细胞中 PI3K和beclin1分别是酵母菌Vps34和Atg6对应的同源物 mTOR TOR的介绍 mTORC1信号通路是多条信号通路的汇聚点 通过对上 下游信号的来传导影响细胞自噬 是目前研究最多的信号通路 PI3K Akt mTOR通路 激活的Class PI3K能在细胞中产生第二信使PIP3 PIP3在磷脂酰肌醇脂依赖性蛋白激酶1 PDK1 的协助下 激活AKT 激活的AKT能够抑制TSC1 2复合物 从而激活mTOR 抑制细胞自噬 胰岛素样生长因子IGF1就是通过PI3K Akt mTORC1通路调节细胞自噬水平的 AMPK通路 AMPK 腺苷酸活化蛋白激酶 是能量代谢变化的感受器 在自噬发生的调控中也发挥着重要的作用 低ATP水平状态下 如饥饿或缺氧 AMPK能感受AMP的水平变化而激活 从而磷酸化TSC2 加剧TSC1 2对Rheb的抑制 最终使mTOR的活性被抑制 诱导细胞发生自噬AMPK还可以通过直接磷酸化Raptor 使Raptor脱离mTORC1复合体 进而抑制mTORCI的活性营养缺乏会促进AMPK与ULK1的PS结构域结合 使ULK1的Ser Thr丰富区多位点磷酸化 从而激活ULK1 直接调节自噬 p53通路 p53在细胞核中 1 p53能通过sestrin1 2蛋白激活AMPK mTORC1信号通路 从而抑制mTORC1 上调细胞自噬水平 2 p53能通过激活DAPK1 磷酸化Beclin 1 促进细胞自噬 3 p53能通过激活抗凋亡蛋白BCL 2家族 Bad PUMA Bax BNIP3 解除Bcl 2 Bcl xL与Beclin 1之间的抑制作用而上调细胞自噬 4 p53能激活DRAM1 损伤相关自噬调节因子 通过编码一种溶酶体蛋白 从而上调细胞的自噬水平p53在细胞质中 p53缺失的癌细胞中 细胞自噬水平上调 且细胞质中重新载入p53能下调细胞自噬水平 因此 p53在细胞质中能够发挥抑制细胞自噬水平的功能 p53是一种重要的抑癌基因 对自噬的调控作用是双重的 取决于在细胞内的定位 核内p53促进自噬 胞浆内p53抑制自噬 AminoAcids通路 氨基酸代谢与mTORC1 氨基酸作为细胞自噬的终产物可负反馈调节细胞自噬 同时外源性的支链氨基酸 亮氨酸 异亮氨酸和缬氨酸 的摄入也能影响细胞自噬的水平 研究表明 当亮氨酸浓度升高时 能激活mTORC1 抑制细胞自噬 PI3K 通路 型磷脂酞肌醇3磷酸激酶 PI3K 是一个正调控蛋白 它能够磷酸化磷脂酞肌醇 PI 生成3 磷酸磷脂酞肌醇 PI3P 而后PI3P利用胞质中的蛋白质形成自噬体膜 PI3K 也能与Beclin 1形成复合体 该复合物在自噬体形成的起始阶段起重要作用 形态学方法透射电镜 链接 Monodansylcadaverine MDC 染色 链接 Autophagy的特异标志物荧光定位 链接 LC3 II的检测 链接 其它自噬调控物 透射电镜 细胞的自噬现象最初也是通过电子显微镜发现的 自噬体 由包裹未吞噬降解的胞浆物质 细胞器的双层膜结构组成 自噬溶酶体 由单层膜结构组成 其中包裹着处于不同降解阶段的胞浆成分 MDC染色 Monodansylcadaverine MDC 单丹磺酰戊二胺 是一种荧光染料 被用作自噬泡的示踪剂MDC阳性信号主要聚集于核周区域 而自噬体却均匀分布于胞浆内 MDC是嗜酸性染色剂 可能显示晚期内吞体 两性体和溶酶体阵 而自噬体多呈中性 故自噬前体和有的自噬体可不被着色 故MDC染色的特异性不高 荧光定位 GFP LC3单荧光自噬指示体系 无自噬时 GFP LC3融合蛋白弥散在胞浆中 自噬形成时 GFP LC3融合蛋白转位至自噬体膜 在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点 一个斑点相当于一个自噬体 可以通过计数来评价自噬活性的高低 但是绿色斑点增多并不一定代表自噬活性增强 也有可能是自噬溶酶体降解途径受阻 mRFP GFP LC3双荧光自噬指示体系 GFP是酸敏感型GFP蛋白 而mRFP是稳定的荧光表达基团 不受外界影响 由于自噬小体进入第二阶段后 与溶酶体进行融合 形成自噬溶酶体 自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境 可以导致PH下降 GFP淬灭 因此 GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度 GFP越少 则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅 反之 自噬小体和溶酶体融合被抑制 自噬溶酶体进程受阻 mRFP是一直稳定表达的 因而可以通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流进程 LC3 II的检测 westernblot 细胞中新合成的LC3经过加工 成为胞浆可溶性LC3 I 后者经泛素样加工修饰过程 与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺 PE 结合 称为LC3 II LC3 II含量的多少在某种程度上反映了细胞的自噬活性 利用WesternBlot检测LC3 II I比值的变化以评价自噬形成 正常培养的细胞自噬活性很低 不适于观察 因此 必须对自噬进行人工干预和调节诱导自噬 雷帕霉素或者饥饿抑制自噬 3 MA 3 Methyladenine 3 甲基腺嘌呤 是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂 可特异性阻断Autophagy中自噬泡与溶酶体的融合 CQ chloroquine 氯喹 CQ处理后的细胞 其溶酶体中的PH升高 导致酸性水解酶的活性丧失 影响自噬体与溶酶体的融合或自噬体与溶酶体融合成自噬溶酶体后就得不到及时的降解 来阻断自噬过程 因此 LC3 得不到释放 就会出现LC3 的累积 研究方法 自噬与恶性肿瘤 癌症早期 肿瘤抑制作用 进展阶段时 促进肿瘤细胞生长 在人乳腺癌 卵巢癌和前列腺癌中观察到高频率的Beclin1单等位基因缺失 在人乳腺癌细胞系MCF 7中 Beclin1蛋白表达下降 几乎检测不到 稳定转染Beclin1促进了细胞的自噬活性 降低了其成瘤能力 这些均提示自噬活性与抑制细胞增殖有关 LiangXH JacksonS SeamanMetal 1999 InductionofautophagyandinhibitionoftumorigenesisbyBeclin1 Nature402 672 676 乳腺癌治疗药物它莫西芬可通过激活细胞自噬 由神经酰胺介导上调Beclin1表达发挥作用 ScarlattiF BauvyC VentrutiAetal 2004 Ceramide mediatedmacroautophagyinvolvesinhibitionofproteinkinaseBandup regulationofBeclin1 JBiolChem279 18 18384 18391 自噬与肿瘤治疗 抑制自噬 增强肿瘤放化疗敏感性大量研究显示 自噬抑制剂可以增强恶性胶质瘤 多发性骨髓瘤 乳腺癌 结直肠癌及前列腺癌等多种肿瘤对放化疗的敏感性 因此 自噬抑制剂与常规治疗的联合应用可能是提高疗效的潜在手段 诱导自噬 促进肿瘤细胞死亡现有证据表明 在某些肿瘤中自噬性死亡可能是肿瘤细胞死亡的重要方式 比如 三氧化二砷 As203 可以通过上调Beclin1的表达 诱导细胞自噬性死亡 从而缓解淋巴细胞性白血病和多发性骨髓瘤的病情 促自噬类药物替莫唑胺 可以选择性地杀灭具有凋亡抗性的恶性胶质瘤细胞 表明 诱导肿瘤细胞过度自噬 也可能是抗肿瘤治疗的重要思路 自噬与肌病 LAMP 2 2型溶酶体相关膜蛋白 缺陷小鼠出现多组织广泛的自噬性空泡 其中包括骨骼肌和心肌 心肌超微结构的异常使其收缩功能严重受损 LuzhengXue GrahamCFletcherandAvivaMTolkovsky 1999 Autophagyisactivatedbyapoptoticsignalinginsympatheticneurons analternativemechanismofdeathexecution MolCellNeurosci14 180 198 人LAMP 2缺陷导致的Danon氏病和相关肌病的典型特征是胞浆中自噬溶酶体的大量聚集 SugieK NoguchiS NishinoIetal 2005 AutophagicvacuoleswithsarcolemmalfeaturesdelineateDanondiseaseandrelatedmyopathies JNeuropatholExpNeurol64 6 513 522 自噬与神经变性性疾病 在该疾病的早期阶段自噬起保护性作用 激活自噬可加速变性蛋白的清除来阻止疾病的进一步发展 然而 随着疾病的进展 蛋白质聚积物越来越多 对溶酶体蛋白酶降解的敏感性下降 自噬的持续性激活最终引发自噬性细胞死亡 这样自噬又促进了神经元的死亡 LarsenKE SulzerD Autophagyinneurons areview HistolHistopathol 2002 17 3 897 908 WebbJL RavikumarB AtkinsJ SkepperJN RubinszteinDC 2003 Alpha synucleinisdegradedbybothautophagyandtheproteasome JBiolChem278 25009 25013 RavikumarB DudenRandRubinszteinDC 2002 Aggregate proneproteinswithpolyglutamineandpolyalanineexpansionsaredegradedbyautophayg HumMolGenet11 9 1107 1117 阿尔茨海默氏病 Alzheimer s 亨廷顿氏病 Huntington s 和帕金森氏病 Parkinson s 等神经变性性疾病两个最主要的特征是 胞浆中蛋白聚集物的存在和大的蛋白裂解体系活性的改变 自噬与病原体感染 细胞自噬机制的激活在清除病原体感染中也起重要作用 在对C neoformans 新型隐球菌 感染的小鼠巨噬细胞转录特点的研究中发现 与自噬相关的基因被诱导表达 巨噬细胞以胆固醇依赖方式激活自噬 清除胞内病原菌L pneumophila 嗜肺军团菌 的感染 激活自噬不一定对病原体感染的细胞均起保护作用 例如激活Coxiella 柯克斯菌 感染的中国仓鼠卵巢细胞的自噬机制 会为细菌最初的存活和扩增提供有利条件 脊髓灰质炎病毒和鼻病毒利用自噬机制促进病毒的复制和扩增 据推测其机制可能是自噬为病毒RNA复合物提供了膜性结构的包裹 帮助病毒颗粒以非裂解方式从受感染的细胞中释放出来 自噬与衰老 KellerJN等人的综述详细探讨了Autophagy与脑衰老的关系 KellerJN DimayugaE ChenQ ThorpeJ GeeJ DingQ 2004 Autophagy proteasomes lipofuscin andoxidativestressintheagingbrain IntJBiochemCellBiol36 12 2376 2391 Review 有研究指出 周期性终生服用抗脂解药物抑制胰岛素的分泌与轻度节食共同发挥抗衰老作用 推测其机理可能为短暂的血浆低胰岛素水平刺激了机体的抗衰老细胞修复机制 这种机制就是细胞的自噬 DonatiA CavalliniG CarresiC GoriZ ParentiniI BergaminiE 2004 Anti agingeffectsofanti lipolyticdrugs ExpGerontol39 7 1061 1067 透射电镜观察自噬体 感染细胞 阴性对照细胞 雷帕霉素处理细胞 GFP LC3转染细胞检测自噬体形成 阴性对照细胞 雷帕霉素处理细胞 感染单个细胞 感染合胞体 LC3转化的Western blot检测 1 4 7 10 13 2 5 8 11 14 3 6 9 12 15 依次为第6 12 18 24 36小时的阴性对照组 雷帕霉素处理组 毒株感染组 6h 12h 18h 24h 36h p62的Western blot检测 阴性对照组 依次为ND