镍柱蛋白纯化

镍柱蛋白纯化一、 原理ni2+ 发生螯合，螯合后的ni2+ 能与 his 上的咪唑环发生特殊的相互作用，从而实现蛋白质的分离。影响蛋白质/多肽与金属离子鳌合力大小的因素主要是蛋白质表面可结合的氨基酸（种类、数目和分布）、金属离子的种类和密度、层析条件（等）ph 、盐的种类和浓度、添加剂二、缓冲液的配制 (500mlph=7.4)binding buffer:pbnacl50ml14.625g20mm 咪唑1.8g（ 550mm ）镍柱里面含有琼脂糖微球体，在琼脂糖鳌合介质的作用下微球体与washing buffer:pb50 mmnacl14.625g5mm0.45g10 mm0.9g15 mm1.35g20 mm1.8g40mm3.6gelutionbuffer:pb50mlnacl14.625g100 mm9g200mm18g400mm600mm咪唑45g咪唑63g精品资料三、操作步骤此步骤过镍柱的所有溶液、 上清蛋白都要先用滤膜过滤，所有液体过镍柱的速度要严格控制2.5ml /min ，中间镍柱不能进气泡1、5 倍镍柱体积去离子水洗涤，去除空气和20% 乙醇(5ml /min) 2、510 倍镍柱体积 binding buffer平衡3、上蛋白样品4、5 倍镍柱体积 wsahingbuffer洗脱杂蛋白 (his 标签含有 6 个组氨酸，结合能力强于含有单个组氨酸的杂蛋白)，此步骤设洗脱梯度5、5 倍镍柱体积 elution buffer洗脱目的蛋白，此步骤设洗脱梯度6、5 倍体积去离子水清洗掉缓冲液7、20% 乙醇保存于4注意： 洗脱可能会把金属离子和蛋白质的复合物一起洗下来四、镍柱重生 （介质使用约 3-20 次，具体与原料来源、样品体积等有关）1. 镍柱用去离子水清洗2. 5 倍镍柱体积 edta重生镍柱 (20 mm pb + 0.5 m nacl +50 mm edta，ph 7.4)3. 5 倍体积binding buffer平衡4. 5 倍体积去离子水清洗5. 20 倍体积1m naoh洗涤6. 水洗至中性7. 5 倍柱体积挂镍8. 用 5 倍体积以上的纯水清洗层析柱，去除游离的金属离子9.20%乙醇保存4五、注意事项1、推荐在中性至弱碱性的条件下（ph 78 ）结合重组蛋白，磷酸盐buffer 是常用的缓冲液， tric-cl 在一般情况下可用，但要注意它会降低结合强度2、避免在 buffer 中包含 edta 或柠檬酸盐等螯合剂3、若重组蛋白以包涵体形式表达，在所有buffer 中添加 6m 盐酸胍或 8m 尿素4、避免缓冲液中有高浓度的供电子基团，如：nh4 ，甘氨酸，精氨酸， tris5、各种 buffer 中不能含有高浓度的强还原剂，比如dtt ，防止二价 ni 被还原6、不能含有离子型的去垢剂，比如sds, 防止 ni 流失7、buffer里可加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度可高达 50%8、buffer 中 n