生化仪器分析与实验技术在药物质控研究中的应用课件

1 生化仪器分析与实验技术在药物质控研究中的应用 2 生化仪器分析与实验技术生命学科研究集多学科为一体 光学 电学 化学 生物化学 免疫学综合性实验技术四大实验技术 光谱分析 电泳技术 免疫学技术 层析技术生化仪器特点 功能多样化 操作智能化 测定微量化 3 生化药品的定义与分类 一般系指从动 植物及微生物中提取 分离 纯化 或用生物化学半合成或用现代技术制得的具有生物化学活性的一类用于临床治疗的药物 氨基酸及其衍生物酶与辅酶核苷酸及其衍生物肽与蛋白多糖类脂类 4 基因工程药物的质控特点目前 研发成果主要集中在蛋白质和多肽类药物 其质控内容主要有 结构确认 理化性质鉴别 纯度与杂质检查 效价与含量测定 生物活性测定基因工程药物来源于活的生物体 细菌或细胞 它的生产涉及到生物材料和生物学过程 如发酵 细胞培养 分离纯化目的产物等 这些过程有其固有的易变性 必须对原材料 培养过程 纯化工艺过程 最终产品进行全面的质量控制 5 临床应用溶栓类tPAUKSKK2tPATNK tPA纤溶酶人水蛭素类似物抗肿瘤门冬酰胺酶TNFa人精氨酸酶抑肽酶舍雷肽酶蕲蛇酶抗病毒利巴韦林阿昔洛韦干扰素聚肌胞苷酸肌苷环磷腺苷降血糖人胰岛素及其类似物 人促胰岛素分泌素治疗心脑血管病弹性蛋白酶胰激肽原酶生长抑素促生长人生长激素制剂促生殖卡贝缩宫素人促卵泡激素人绒促性素人促黄体生成素曲普瑞林制剂抗炎症胰蛋白酶糜蛋白酶复合凝乳酶木瓜酶超氧化物歧化酶胶原酶凝乳酶菠萝蛋白酶酸性蛋白酶溶菌酶玻璃酸酶止血尖吻蝮蛇凝血酶 血凝酶 凝血酶 巴曲酶 蛇毒激凝酶消化复方消化酶片胰酶胃蛋白酶中性蛋白酶淀粉酶胰脂酶治疗高尿酸血症假丝酵母尿酸氧化酶治疗I型戈谢病阿糖苷酶 葡萄糖脑苷脂酶补充营养增强免疫力氨基酸输液脂肪乳脑磷脂卵磷脂猪苓多糖 6 生物化学实验技术1 光谱分析技术2 层析技术3 色谱分析技术4 电泳技术5 免疫学技术6 离心技术7 膜分离技术 7 光谱技术 1 紫外 氨基酸 核苷酸 肽 蛋白 酶 糖 2 红外 氨基酸 核苷酸 辅酶 3 核磁 氨基酸 核苷酸 辅酶 肽 衍生物 4 质谱 氨基酸 小肽 核苷酸 5 拉曼光谱 蛋白 糖 6 圆二色光谱 蛋白 糖 7 原子吸收 蛋白和酶中的金属离子 8 荧光发射 氨基酸 核苷酸 肽 蛋白 8 层析与色谱分析技术 1 纸层析 氨基酸 糖 核苷酸 2 板层析 氨基酸 核苷酸 脂 3 柱层析 氨基酸 核苷酸 蛋白脂 4 气相色谱 有机残留杂质 5 液相色谱 氨基酸 肽 蛋白 核酸 糖 脂 6 气质联用 脂 肽 蛋白 核糖 7 液质联用 肽 蛋白 核糖 8 临界色谱 肽 蛋白 核糖 9 电泳技术 1 纸电泳氨基酸 糖 核苷酸 2 淀粉电泳氨基酸 核苷酸 3 淀粉凝胶电泳糖 核苷酸 4 琼脂凝胶电泳与免疫电泳核酸蛋白质 5 PAGE核酸多肽蛋白质酶 6 SDS PAGE多肽蛋白质酶 7 等电聚焦电泳多肽蛋白质酶 8 毛细管电泳核酸多肽蛋白质 9 等速电泳多肽蛋白质酶 10 现代仪器分析1 DNA序列仪2 氨基酸序列仪N 末端aa序列3 飞行时间质谱分析仪MALDI TOF MS分子量质量肽图纯度糖蛋白微观不均一性4 电喷雾质谱分析仪分子量微观不均一性5 多功能电泳仪分子量纯度等电点电印记双向电泳6 C末端肽段分馏仪7 园二色光谱仪蛋白质二级结构8 激光拉曼光谱仪 蛋白二级结构与构象生物膜结构 11 9 库仑水分测定仪684KF微量水分10 多功能荧光微板仪SPECTRAMAXGEMINIXS体外细胞活性残余DNA11 多功能酶标仪SPECTRAMAX190型体外细胞活性宿主蛋白12 液相色谱质谱仪分子量质量肽图13 不溶性微粒测定仪HIAC ROYCO8103型制剂中微粒14 高效液相色谱仪岛津惠普沃特斯纯度与杂质检查效价与含量测定肽图谱15 高效毛细管电泳仪肽图谱纯度含量 12 16 液闪仪放免活性测定17 多角光散射仪多亚基蛋白多糖 13 质控内容 结构确认 理化性质检测 纯度与杂质检查 含量测定 生物活性测定 效价测定 安全性检查主要质控技术 生化分析技术 生物学技术 14 1 HPLC法 分子筛 反相 疏水相互作用 阴离子交换 氨基柱 鉴别和肽图谱测定 胰酶 V8酶 胃蛋白酶 检查有关物质或高分子蛋白或游离PEG 含量测定 2 多肽与蛋白质的Western blotting及其免疫学测定 3 等电聚焦法电泳法检测等电点和异构体 4 SDS PAGE法测定蛋白和多肽分子量和纯度 5 底物法或凝块裂解法测定酶活性 6 分子杂交 免疫法检测残余DNA 7 免疫分析法检测E coli肽或宿主蛋白 8 体外细胞培养法测定效价 9 高校毛细管电泳检测纯度 10 银染SDS PAGE法检测解离亚基或聚合物 15 肽图谱测定与分析目的鉴别蛋白质一级结构是否改变方法裂解 分离 检测裂解 化学法 溴化氢 Met羧基端 酸性条件 5 5 二硝基苯甲酸 Cys pH8 0 酶法 专一性蛋白水解酶胰蛋白酶 碱性aaArg和Lys羧基端 对Arg Pro Lys Pro健无作用胰凝乳蛋白酶 芳香族aa羧基端 内肽酶 Lys羧基端 V8蛋白酶 酸性aaAsp和Glu羧基端 PBS pH8 0 Asp X 乙酸BS pH84 0 梭菌蛋白酶 Arg羧基端 凝血酶 专一裂解Arg Gly键胃蛋白酶 16 肽段分离 HPLC C18C8HPCE 胶束 聚焦 区带 凝胶模式 SDS PAGE 15 胶浓度 Tricine 三甲基甘氨酸 肽段检测 紫外检测器214nm肽图谱质谱检测器肽段分子量质量肽图 17 重组人胰岛素及其类似物理化性质 18 人胰岛素与胰岛素类似物肽图分析 人胰岛素V8酶切位点示意图 19 人胰岛素及其类似物的RP HPLC肽图谱1 片段 2 片段 3 片段 4 片段 5 片段 和 的聚合 20 21 等电聚焦电泳分析材料 试剂及仪器等电点标准蛋白 凝胶支持膜 GelBondRPAGfilm 电泳电源 EPS3500 恒温水循环器 MultiTempII 水平电泳槽 MultiphorII 均为Pharmacia公司产品 电泳玻璃板及其固定装置 Bio RadMini型 实验方法溶液的配制丙烯酰胺贮液 10 过硫酸铵溶液 10 AP 电极液阴极液 1mol LNaOH 阳极液 1mol L磷酸 甲基红指示液 固定液 脱色液 染色液考马斯亮蓝G0 1g 加脱色溶液100ml 等电点标准蛋白溶液的制备取一小瓶等电点标准蛋白 溶于100 l无离子水中 4 存放待用 样品溶液制备取rhbFGF脱盐样品适量 用水配成3mg ml的溶液 取此溶液90 l加Amphline10 l 甲基红指示液2 l 混匀备用 22 凝胶的制备玻璃板的处理将水平制胶模具中的小玻璃板一面加几滴硅烷化试剂 用擦镜纸均匀涂布于玻璃板表面 室温放置干燥后 用无离子水冲洗表面 去掉水滴 备用 制胶将凝胶支持膜疏水面一侧紧贴在大玻璃板上 膜两侧边缘放置隔片带 0 5 0 7mm 将小玻璃板硅烷化处理的一面朝膜放在隔片带上 固定 凝胶液 丙烯酰胺 无离子水 载体两性电解质 6 3 4 5 1 2 经充分脱气处理后 加10 AP和TEMED 0 03 0 06 混匀 沿平板一端灌入 勿使产生气泡 凝胶凝固后 去掉玻璃板 待用 预电泳将制好的胶铺在电泳槽内冷却板中央 4 预冷30分钟 将电极条分别用阴 阳极电极液充分湿润 去掉多余电极液后 平行置于凝胶两端 电极垂直平置于电极条上 保持适当的压力 200V 预电泳20分钟 加样先将滤纸片 0 5cm 0 5cm 排放在距阴极端2或3cm处 分别样品液 标准液各10 l加在滤纸上 电泳先200V恒压电泳20min后 恒流8mA 电压升至550V后 再恒功率12W电泳 当电压升至1200V时 停止电泳 固定与染色将胶片置于固定液中1小时 取出置脱色液中平衡30分钟 再置染色液中20分钟 最后将胶片置脱色溶液中直至本底透明 2 2凝胶的制备 23 等电聚焦方法学的考虑等电聚焦分析的条件凝胶中有稳定的 连续的和线性的pH梯度 常用两性缓冲离子建立载体两性电解质pH梯度 或是将缓冲基团成为凝胶介质的一部分即固相pH梯度 后者灌胶技术比较复杂 电泳时需要高电压 且电泳时间长 原理在支持介质中放入载体两性电介质 通以直流电后 在两极之间形成稳定 连续和线性的pH梯度 当带电的蛋白质分子进入此体系时 移动并聚焦于相当其等电点的位置 由此可见 IEF是依照等电点的不同将蛋白质分子分离 根据蛋白带在pH梯度中的位置可测得该蛋白质的等电点 24 等电聚焦实验条件的考查支持介质在分析IEF中常用聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶作为支持介质 前者适于分析分子量小于30万蛋白质 后者适于分子量大至200万的大分子 我们用聚丙烯酰胺凝胶为支持介质 并考查了凝胶浓度为3 5 9 和交联度为3 时对结果的影响 实验中发现 3 胶太软 难操作 而9 胶又较硬 易断裂 结果以5 T较合适 载体两性电介质是IEF最关键的试剂 它直接关系到pH梯度的形成以及蛋白带的聚焦 我们比较了市售产品Ampholine LKB Pharmalyte Pharmacia 和国产Ampholine国产的试剂在有效期内使用可以达到国外同类产品的效果在凝胶和样品溶液中 载体两性电介质的最适浓度为10 阳 阴极电极溶液作用是为了避免样品或载体在阳极氧化或在阴极还原 电极液的选择会影响最终的pH梯度 特别是在靠近电极条位置 我们比较了1mol L的磷酸 乙二胺 NaOH HPES NaOH H3PO4电极液 结果以NaOH H3PO4为最适 盐离子干扰pH梯度的形成并使蛋白带畸变 有些离子还会产生高电流而导致烧胶样品中有盐 大于0 1mol L时 应先脱盐 样品加样位置影响聚焦效果 采用滤纸片加样法可把样品加在凝胶上不同的位置 对碱性蛋白而言 应靠阴极加样 即两电极距离的1 3处 有助于蛋白快速聚焦 25 pH梯度和pI的测定平板电泳胶可以用表面电极或等电点标准蛋白测定pH梯度 但前者需要昂贵的表面电极和pH计 操作麻烦 干扰因素多 常采用等电点标准蛋白测定pH梯度 以蛋白迁移距离为横座标 等电点为纵座标 绘制pH梯度曲线 由样品的迁移距离即可求出其pI值 线性回归方程为y 1 2593x 10 808 0 9939 由IEF图谱可见rhbFGF样品聚焦在9 3附近 由pH梯度曲线得到的等电点为9 4 n 5 RSD 1 0 与文献值 pI 9 6 相比 重组rhbFGF的等电点偏低 这可能是因为重组rhbFGF含有17个氨基酸的融合蛋白 使其组成与天然hbFGF有差别 rhbFGF的IEF图谱 见图1 pH梯度曲线 见图2 26 rhbFGFIEF图谱Lane1 2 3 rhbFGF样品Lane4 等电点标准蛋白 pH梯度曲线 27 3 504 555 205 856 556 857 358 158 458 659 3 rh PTH 1 34 的IEF电泳结果ResultoftheIEFgelelectrophoresislane1 pImarkerpH3 5 9 3lane2 standardofPTH 1 34 lane3 5 samplesofrh PTH 1 34 28 SDS PAGE检测分析多肽与蛋白质多肽分离Tricine SDS PAGE凝胶的配制浓缩胶空间胶分离胶组成16 5 10 4 丙烯酰胺溶液1 0ml6 1ml10ml凝胶缓冲液3 1ml10ml10ml甘油 2 0g10 AP溶液80 l120 l120 lTEMED8 l12 l12 l加水至终体积12 5ml30ml30ml 29 分离原理凝胶组成 浓缩胶 空间胶 分离胶 浓缩胶的主要作用在于防止对流及浓缩样品 空间胶有助于提高分子量低于5KD多肽的分辨率 在pH6 8 8 8范围内 Tricine pK8 15 作为尾随离子 在浓缩胶中具有较大的相对迁移率 移动比甘氨酸快 因此对样品的浓缩效应集中在低分子量范围 多肽的分离效果与3种胶的高度比有关 通过试验我们发现浓缩胶 空间胶 分离胶的高度比为1 1 4比较合适 不同的起始电压也影响分离效果 我们试用了80V和35V 发现35V更有利于多肽的分离 30 凝胶染色方法 银染法0 04 0 1ug灵敏度高 标准多肽分子量染色清晰 但地龙 水蛭提取物银染后 背景较深 小分子蛋白难与其它着色物质分开 这可能是由于提取物中所含糖类和其它物质干扰银染 考马斯亮蓝R 250和G 250染色0 2 5ugR 250 样品中小分子蛋白条带不易着色 这可能是受所含糖类物质的干扰 G 250 凝胶着色均匀 而且背景着色易脱去 显出清晰的条带 31 电泳样品的处理1还原SDS处理在样品溶液加入SDS 还原剂 巯基乙醇 4 5 有臭味DTT 2 3 无味 不会影响其他样品 100 3 5min 有时还原剂可能被氧化 冷却后补加 以防蛋白质重新折叠和亚基的缔合 加入EDTA可防止DTT氧化 2非还原SDS处理在样品溶液加入1 SDS 100 3 5min 二硫键未断裂 不完全去折叠 3烷基化还原SDS处理碘乙酰胺 保护巯基不被氧化 多巯基蛋白质测定的分子量略有增加 32 蛋白印迹与免疫学测定应用原料与制剂中不同蛋白组分的鉴别与定量方法与原理将电泳分离的蛋白或多肽转移到固定基质上 以特异性抗体为探针 它与附着于固定基质上靶蛋白或多肽发生特异性反应 对蛋白或多肽电泳图谱上的特定组分进行定性定量分析 实验步骤电泳 转移 封闭 免疫检测特点将高分辨率的电泳技术与灵敏专一的免疫探测技术结合起来 灵敏度1 5ng 蛋白质或多肽条带不会扩散 操作简便 试剂用量少 便于对蛋白质或多肽进行各种分析 33 关于实验上的一些考虑1 电泳 SDS对被分离组分活性的影响2 固相纸膜 NC膜 常用0 45um 分子量小于20000时 用小孔膜 0 1 0 2um 还有尼龙膜 重氮苄氧甲基纤维膜3 转移 缓冲液 离子强度 pH值 稳定性 Towbin缓冲液 tris 甘氨酸 pH8 3 加甲醇20 甲醇作用 解离SDS蛋白复合物中的SDS 增强与膜的结合能力 电泳印迹 阳极 NC膜 凝胶 阴极垂直槽式 12Hr 大量转移缓冲液 高场强 需冷却 海绵垫 滤纸 NC膜 凝胶 滤纸 海绵垫 水平半干式 1 5 2h 低电流 少量转移缓冲液 板 滤纸 NC膜 凝胶 滤纸 版 34 水平半干式转印取6张滤纸浸泡于转移缓冲液中 取硝酸纤维膜 0 45 m 一张浸泡于去离子水中 5 10min 用水淋洗石墨板 用纸巾擦干电极板上的液滴 将电泳后的胶片浸于转移缓冲液中 依次放置阳极板 3层滤纸 硝酸纤维素膜 电泳胶片 3层滤纸 阴极板 滤纸 纤维素膜和胶片应大小相同 每放一层要精确对齐 各层之间不留气泡 以0 65mA cm2设置电流 恒流转移1 2hr 关闭电源 停止转印 35 4 封闭用封闭试剂将膜上非蛋白结合区饱和 以减少非特异性结合 降低显色背景 2ml封闭液 cm2 封闭试剂 3 脱脂奶粉 BSA 明胶 加入0 3 吐温 20可改善封闭效果5 蛋白多肽检测非特异性检测了解分离情况 转印效果丽春红S染色 显色短 能被洗去 不影响免疫显色印度墨水 总蛋白染色 显色久 便宜 灵敏度高氨基黑10B 考马斯亮蓝 影响免疫显色特异性检测加入蛋白或多肽的抗体溶液 4 反应过夜 用Tris盐溶液洗膜3次 每次10min 加入酶标抗体溶液 置室温反应1 2hr 洗膜同前 取出膜置显色液中 室温下显色 至出现色斑 用水漂洗 观察结果 36 标记酶底物显色特点碱性磷酸酶BCIP NBT蓝紫色显色久辣根过氧化物酶DAB棕色色易退BCIP 5 溴4 氯 3 吲哚磷酸NBT 氮蓝四唑DAB 3 3 二氨基联苯胺 37 甲状旁腺激素 parathyroidhormone PTH 是维持机体血钙平衡的重要激素之一 其基本生理作用是通过增加成骨细胞及破骨细胞数目 促进骨吸收及生长 大量临床应用研究表明 PTH是目前治疗骨质疏松症的最重要药物之一 目前应用于临床研究的主要有hPTH 1 84 1 38 及 1 34 片段 均为基因工程产品 有关此类产品的质控方法研究重点 生物学活性肽含量测定国际标准品同一性鉴别杂质分析理化对照品 38 氨基酸分析方法柱前衍生法 PITC衍生法 OPA FMOC衍生法 AQC衍生法 DNFB衍生法柱后衍生法 茚三酮衍生检测法 OPA衍生检测法直接分析法 电化学检测法 蒸发光散射检测法 39 方法及灵敏度的比较 1柱后茚三酮衍生的自动分析仪法 50 100ng 2柱后OPA衍生的自动分析仪法 15ng 3柱前异硫氰酸苯酯衍生法 100 150ng 4柱前OPA衍生法 3ng 5柱前AQC衍生法 10ng 6柱前2 4 二硝基氟苯衍生法 100ng 7DABS Cl衍生法 10ng 8柱前FMOC Cl法 2ng 40 28种氨基酸分离图谱 AgelaXBP C18柱 4 6 250mm 41 甲状旁腺激素