感受态细胞制备及各种感受态的特点

感受态细胞制备制备感受态常用的方法是电击法和cacl 2 制备法，以下介绍cacl 2 制备法：1、可以从 -80 冰柜中， 取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板 （由于 rocetta含有氯霉素抗性，需要涂布在氯霉素抗性的平板，后面的都是如此）上划线，并将菌种迅速放回-80 保存，在划线板上做好相应标记， 于 37 培养过夜。2、从37 培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于2mlep管中， 37 ，220rpm震荡培养约6 个小时至对数生长中后期；将该菌悬液以1:100 的比例接种于50mllb 液体培养基（ 2 瓶）中 ,37 振荡培养2.5 小时至 od600=0.5 。注意：接种比例不得大于1:10 。3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管 （ 50ml ）中，在冰上放置510min ； 注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。4、4 5000g离心 5 分钟。用预冷的去离子水洗涤沉淀，4 5000g离心 5 分钟；note ：此步主要是为了洗去培养基中的盐等5、沉淀加入 2ml 预冷的 0.05mol/l cacl2-15% 甘油混合溶液， 轻吹散，冰浴 5 分钟，4 5000g离心 5 分钟；6、沉淀加入2ml 预冷的 0.05mol/l cacl2-15% 甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞悬液。分装成50100 l 的小份，贮存于-70 可保存半年。含 15% 甘油的 0.05mol/l cacl2 制备方法 :称取 0.28gcacl 2(无水 ,分析纯 ),溶于 50ml 重蒸水中 ,加入 15ml 甘油 ,定容至 100ml, 高压灭精品资料菌。感受态细胞的特征感受态：通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源dna 的状态。感受态细胞的特征：（1） ）细胞表面暴露出一些可接受外来dna的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露） 。（ 2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使dna 直接穿过质膜进入细胞）。（ 3 ）受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的dna 分子不易被切除或破坏。实验室常用的感受态细胞1. dh5 菌株克隆菌株： dh5 是一种常用于质粒克隆和高拷贝质粒的稳定复制的菌株。e.colidh5 在使用 puc 系列质粒载体转化时，其80lacz m15 基因产物可与载体编码的半乳糖苷酶氨基端实现互补， 可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。rec a1 和 end a1 的突变有利于克隆 dna 的稳定和高纯度质粒dna 的提取。基因型： f-、80dlacz m15 、(laczya-argf)u169、deor 、reca1 、enda1 、hsdr17(rk -，mk +)、phoa 、 supe44 、- 、thi-1 、gyra96 、rela12. top10菌株克隆菌株：该菌株适用于高效的dna 克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。基因型： f-、mcra (mrr-hsdrms-mcrbc)、 80、lacz m15 、 lac 74 、 reca1 、ara 139 (ara-leu)7697、 galu、galk、rps 、 (strr) enda1、 nupg3. bl21(de3)菌株：蛋白表达菌株： 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体t7 启动子的表达载体 （如 pet 系列） 的基因。该菌株用于t7 rna聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主，t7 噬菌体 rna 聚合酶基因的表达受控于噬菌体 de3 区的 acuv5 启动子，该区整合于bl21 的染色体上。该菌株适合于非毒性蛋白的表达。基因型： f-、ompt 、 hsds （ rb- m b-）、gal 、 dcm （ de3 ）4. bl21(de3) plyss菌株蛋白表达菌株：该菌株含有质粒plyss ，因此具有氯霉素抗性。plyss 含有表达t7 溶菌酶的基因， 能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。基因型： f-、ompt、hsds （ rb- m b-）、gal 、 dcm （ de3 ）、 plyss、camr5.rocetta感受态特征：蛋白表达菌株rosetta系列菌株来源于bl21 系列宿主菌，该系列菌株含有原本在大肠杆菌中稀少的真核细胞密码子，增加了真核细胞的蛋白表达水平。（1 ）rocetta（ de3 ）该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充大肠杆菌缺乏的6 种稀有密码子 （ aua 、agg 、aga 、cua 、ccc 、gga ）对应的 trna ，这样 rocetta菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制，提高外源基因尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。 trna 基因由它们的天然启动子驱动。基因型：f- 、 ompt 、 hsdsb (rb - m b - )、gal 、dcm 、lacy1(de3) 、prare(argu， argw ，ilex ， glyt ， leuw ， prol)(cmr )补充：稀有密码子对蛋白表达的影响：数氨基酸都有一个以上的密码子，对e.coli 密码子应用情况分析表明一些密码子很少使用,尤其是精氨酸密码子aga , agg , cgg , cga；异亮氨酸的密码子aua ；亮氨酸的密码子cua 和甘氨酸的密码子gga 和脯氨酸的密码子ccc 很少被用到。 目的基因中含有过多的稀有密码子被认为是低表达水平和产生不完全产物的一个原因。当在氨基端附近出现多个稀有密码子的时候，情况更为严重，许多研究表明，精氨酸的密码子aga 和 agg 的高频出现可能大大影响蛋白的产量。当这些密码子出现在n- 端附近时候，这种影响将达到最大。多个实验室报道，在宿主菌中增加同类trna 时那些含有稀有密码子基因的蛋白产量将大大提高。rosettatm 菌株可以增加精氨酸稀有密码子agg 和 aga, 异亮氨酸的密码子aua ；亮氨酸的密码子cua 和甘氨酸的密码子gga 和脯氨酸的密码子ccc 。因此 ,很适合用于表达那些含e.coli 稀有密码子基因的目的蛋白.（引用自网址/blog-602687-688311.html）（2） ）rosetta 2 (de3) plyss 来源于 rosetta(de3) ，本菌株含有 prare2 质粒，除了能够提供原 rosetta(de3) 宿主菌含有 aua, agg, aga, cua, ccc, 和 gga 六个稀有密码子的 trna 外，还提供了第七个稀有密码子 cgg 的 trna 。同时， prare2 质粒具有氯霉素抗性。 rosetta2(de3)plyss 载体通过提供稀有密码子，使得该宿主菌相对于其他大肠杆菌，能够提供更加 “通用 ”的蛋白质表达， 从而提升目的蛋白表达水平。de3 是溶源性的de3,所以带有 t7rna 聚合酶的染色体拷贝。该菌株适用于pet 系列载体，及其他t7 启动子系列载体。含有plss 质粒， plyss 质粒能够产生t7 溶菌酶，可以有效降低目的基因的基础表达水平。plyss 质粒使得该菌株具有氯霉素抗性。plyss 质粒的起始复制位点是p15 origin, 这使得该质粒能够和puc- 及 pbr322- 衍生的质粒互相共存。转化1、 转化的原理：溶液中的ca 离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，在42 ，90s 热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使dna 进入细菌细胞中。2、 转化的步骤：（1） ）取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化的细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中。（2） ）向感受态细胞中加入目的dna（ 50ul 感受态细胞能够被1ng 超螺旋 dna 所饱和），轻弹混匀，在冰浴中静置30min ；注意： 一次转化感受态细胞的建议用量为50ul ，可以根据实际情况分装使用，应注意所用 dna 体积不能超过感受态细胞悬液体积的十分之一，也有说法是不能超过5% 。不能加入太多 dna ，会影响转化效率，体积不能超过10ul ，所以连接时做 10ul 连接体系可用一半做转化，剩下的放在4c。（3） ）将离心管置于42 度水浴中放置90s ，然后快速转移到冰浴中，使细胞冷却2-3min （一般 2min ），该过程不要摇动离心管；（4） ）向每个离心管中加入500ul 无菌的 lb 培养基（不含抗生素） ，混匀后置于37 度摇床震荡培养45min （150rpm ），目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。（5） ）将离心管内容物混匀，可吸取适量（可吸取200-300ul ，也可据情况而定）转化产物涂布平板，而如果预计的克隆较少，可通过离心（4000rpm ， 2min ）后，吸掉部分上清，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。注意：涂布剩余的菌液可置于4 度保存，如果次