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红细胞血型系统 临检与血检教研室 一 输血学定义是围绕将献血者血液输给患者进行救治这一中心 研究 开发 和应用一切可采用的科学技术手段及管理措施 提高血液和血液制品 包括血液代用品和人造血液 的质量和安全性 从而保证临床输血的安全性和有效性 输血发展史 两个里程碑1628年WilliamHarvey发现了循环系统发表了著作 心与血的运动 被誉为生理学最重要的著作 1900年KarlLandsteiner描述了第一个红细胞血型系统 ABO血型系统 启动了现代输血学的发展 开启了免疫血液学的大门 KarlLandsteiner因1900年发现了A B O AB四种血型中的前三种 而于1930年获得诺贝尔医学及生理学奖 现代输血已经成为一门独立的临床医学学科 输血学与相关的生物学 基础医学 临床医学学科 如生物化学 低温生物学 生理学 病理生理学 免疫学 遗传学 分子生物学 医学生物工程学 病毒学 医用高分子学和卫生管理学 相互交叉和渗透 免疫血液学基础 一 抗原免疫原性 可以诱发特异性免疫应答和应答产物 即产生特异性抗体和免疫效应细胞 抗原性 能和抗体等免疫应答产物反应 一 完全抗原即同时显示抗原性和免疫原性 蛋白质 二 半抗原只显示抗原性而无免疫原性 多糖 类脂 三 抗原决定簇 表位 抗原上一种特异性的呈立体排列的化学基团 每一个抗原有多个表位血型抗原是红细胞上的化学构型 依生化性质分为 1 决定簇是糖分子的血型抗原ABH Lweis 也称组织血型抗原 不仅分布红细胞表面 而且存在于大部分上皮细胞 初级感觉神经元 各种体液和分泌物中 出生后逐渐发育成熟 2 决定簇为多肽的有 MNS Rh Kidd等血型系统其化学组成为蛋白质 糖蛋白 脂蛋白仅分布在红细胞及其他血细胞膜上大多数血型抗原出生时已经成熟 但抗原性较弱 二 抗体抗体是体内免疫系统所产生的蛋白质 为对某种抗原起反应所形成 且能与该抗原或关系相近的抗原发生特异性反应血型抗体是免疫球蛋白 Ig 的一部分 IgG与IgM抗体1 IgM抗体是高效的凝集素 可有效地使补体活化 能引发补体介导的红细胞溶解 在盐水介质中能够直接凝集红细胞的抗体 为完全抗体 A型 B型的ABO抗体以IgM为主 2 IgG抗体是唯一能通过胎盘屏障的免疫球蛋白 有结合补体的能力 不完全抗体多数为IgG类 在盐水介质中能使红细胞致敏 需通过抗人球蛋白或其他介质使红细胞凝集 O型人抗 A B以IgG类抗体为主 红细胞血型 他们活着是为了什么 TherelationshipbetweenABOgroupandpersonality 血型 bloodgroup 1 血型的概念狭义只指存在于红细胞上的特异性同种抗原 广义应包括血液各成分的抗原在个体间出现的差异已经发现并为国际输血协会承认的血型系统有30种 其中最重要的两种为 ABO血型系统 和 Rh血型系统 血型是血液系统的一种遗传多态性 血型系统基因是独立遗传的 是产生抗原抗体的遗传性状 2 红细胞血型的现状国际输血协会 ISBT TheInternationalSocietyofBloodTransfusion 的最新报告 红细胞血型抗原为 血型系统30个 近300个抗原血型集合5个 11个抗原血型系列两个 低频抗原组700系列33个抗原 高频抗原组901系列12个抗原基本上已克隆了所有的血型基因 一 ABO血型系统 ABO血型系统 一 概述1 1900年被发现 在输血工作中是最重要的血型抗原系统 2 根据红细胞膜上是否有A B抗原可将人分为四种血型A B O AB 3 Landsteiner分布规律 A型血清含有抗B B型血清含有抗A O型血清含有抗A抗B AB型血清不含抗A抗B 妊娠5 6周胎儿RBC可测出ABO抗原新生儿ABO血型抗原性约为成人的20 20岁左右ABO血型的抗原性最强人ABO血型的抗原终身不变ABO血型抗原的分布 RBC WBC Plt其他组织细胞体液及分泌液 二 ABO血型的遗传基础1 ABO抗原的遗传先后有两种学说 即 两对独立的等位基因 和 三复等位基因 现一般接受后者ABO血型系统的产生由ABO Hh Sese基因控制ABO遗传座位在第9号染色体的长臂3区4带基因Hh和Sese紧密相连在第9对染色体上 A基因和B基因对于O基因是显性基因 ABO血型的遗传 三 ABO血型的鉴定血液中持续存在ABO抗体 除新生儿 正定型 查抗原 用已知的标准抗A和抗B血清来测定红细胞上有无相应的A抗原和B抗原反定型 查抗体 用已知的标准A型红细胞和标准B型红细胞来测定血清中有无相应的抗A抗体和抗B抗体 四 ABO血型表型的频率从北向西南的方向 B基因频率逐渐下降而O基因频率逐渐升高云 贵 川和长江中下游A基因频率升高两广 福建 台湾O型基因频率较其他地区高在不同人种 不同民族间ABO血型分布也表现出差异 在整个汉族中 B型血占20 主要是有匈奴 突厥 鲜卑 女真 契丹 西夏融入于汉族的血液中造成的A型血占40 主要分布在南方 是由楚苗南蛮等古老民族融入华夏集团演变而来的AB是B型血人南下跟A型血人繁杂而成的 O型血是一种非常古老的最早血型 主要分布在中原地区 血缘来源是黄帝集团和东夷集团 五 ABO血型抗原的生化合成ABO基因产物是糖基转移酶 转移酶将糖基移到红细胞膜前体物质上 形成抗原 ABH抗原的前身物质 主要为糖蛋白的糖脂 红细胞寡糖连 Sese基因 ABH抗原不仅存在于血细胞上 其他组织细胞上也可发现 血型物质以唾液中有无分为分泌型和非分泌型分泌型和非分泌型受控于Sese基因SESE为分泌型80 Sese 称非分泌型 六 ABO血型系统的抗原亚型亚型是指属同一血型抗原 但抗原结构和性能或抗原位点数有一定差异 A亚型 A亚型最主要的血清学特征是红细胞抗原数减少 红细胞与试剂血清表现为弱凝集或不凝集 与抗 H反应较强 某些人血清中有抗 A1A抗原的主要两种亚血型A1和A2 构成A型血的99 99 A2或A2B均不超过A型和AB型的1 A2抗原数比A1少 糖基转移酶的活性也较低A1和A2表型鉴别简表 ABO血型系统的抗原亚型 A3 B3Ax BxAm BmAel BelAw Bw ABO血型系统的抗原变异型 孟买型基因型为hh表型的个体红细胞膜上缺乏A B H抗原 血清中含有抗A 抗B 抗H抗体类孟买型表型的个体红细胞膜上缺乏H抗原 H基因受到抑制基因的影响 产生的少量H抗原在A或B基因的作用下转化为A或B抗原 ABO血型系统的抗原变异型 CisAB型母亲是AB型 父亲是O型 两个子女均为AB型 A与B基因均在同侧染色体上遗传大多的顺式AB型的血清有弱的抗B抗体 六 ABO血型系统与临床1 输血 选择血型相同的供血者 进行交叉配血完全相合才能输血2 母婴ABO血型不合引起的新生儿溶血病3 器官移植时 受者与供者也必须ABO血型相符才能移植 二 Rh血型系统 应该怎么做 车祸伤者大出血 急需输血查为RH阴性血医院及血库无RH阴性血若不输血患者生命垂危 1 在紧急输血时 Rh阴性的病人可以输给同样 Rh阳性血液做为应急之用 2 若Rh阴性受血者沒有相同血型的血可用 型Rh阴性的红血球是可以的选择 3 Rh阳性的血浆只要与受血者的红血球合血试验相合 可任意给Rh阴性的病人输用 4 Rh抗原亦不存在血小板表面 输血小板時可取用含红血球在四毫升以下的制品输给Rh阴性的病人 5 和医生讨论 是否可延后再输血 6 每个病人在输血前都会做抗体筛检试验 有抗 抗体出现者 最好是输Rh阴性的血球 但在紧急情況下 亦可输Rh阳性血 在必要 紧急的时机 变通的输血考量 是对病人最有利的处理方式 如果医护人员或家属硬是坚持要给病人输完全相同血型的Rh阴性的血液 可能反而延误了病情 导致严重的后果 输血治疗知情同意书说明有关输血治疗中可能出现的风险患者本人 患者家属签字 Rh是恒河猴 RhesusMacacus 外文名称的头两个字母科学家发现恒河猴和多数人体内的红细胞上存在Rh血型的抗原物质 故而命名 猕猴适应性强 容易驯养繁殖 生理上与人类较接近 因此是生物学 心理学 医学等多种学科研究工作中比较理想的试验动物 恒河猴实验 证明了爱存在三个变量 触摸 运动 玩耍 1940年Karl Landsteiner和亚历山大 所罗门 维纳发现了Rh因子 这项发现拯救了很多从母亲那里得到不匹配的Rh因子胎儿的生命 卡尔 兰德斯坦纳 Karl Landsteiner 的生日 每年的6月14日定为 世界献血者日 Rh血型系统 一 Rh血型系统概述1 Rh血型系统是最复杂的遗传多态性血型系统之一2 Rh血型系统内目前发现有50种抗原 D抗原最重要 临床常根据其有无分为Rh阳性或阴性 其次为E C c e3 大约85 的高加索人 白种人 或99 6 的中国人为Rh阳性4 Rh血型系统有重要的临床意义 Rh血型系统 二 Rh血型系统的遗传与命名有两种传统理论 三种命名法 Rh血型系统的遗传与命名 1 Fisher Race CDE命名法 Rh血型有1号染色体断臂上三个紧密相连的基因位点 每个位点有一对等位基因 D d C c E e 三个基因是以一个复合体的形式遗传 如Cde cDE 有8种基因组合 符合大多临床现象 现在仍然使用 Rh血型系统的遗传与命名 2 Wiener Rh Hr 命名法Rh基因在染色体上只有一个基因位点与Fisher race不同 Wiener命名法把Rh血型视为一个复合抗原认为Rh基因产生的凝集原 包括一系列因子 每一个因子有一种抗体去识别 命名相对简单 Rh血型系统的遗传与命名 3 数字命名法以抗原发现先后对抗原编号 主要用于计数机录入 三 Rh血型系统的表型及基因型1 Rh血型系统的表型Rh血型系统的表型种类与能获得的抗血清有关 根据获得抗血清的多少确定表现型种类 五种抗血清 抗D 抗E 抗C 抗e 抗c Rh血型系统的表型及基因型 2 Rh血型系统的基因型Rh血型系统的抗原表达被认为是受控于两个基因RhD和RhCE为两个紧密连锁的基因构成 分别编码D抗原以及CE抗原没有相应的 d 基因 因此没有 d 抗原和 d 抗体 四 Rh血型抗原与抗体1 Rh血型抗原 Rh血型的抗原性可能仅次于ABO血型系统Rh血型抗原中D抗原的抗原性最强 依次为E C c e 红细胞上正常D抗原数1万到3 3万弱D抗原数200 1万增强D抗原数7 5 20万 Rh血型抗原 2 D抗原的分类正常的D抗原弱D型 Du型 weakD 与正常的D抗原无质差别 但数量很少 弱D红细胞与IgM类抗 D试剂反应呈阴性 抗球蛋白方法检测为阳性氨基酸改变位于细胞膜内或是跨膜区不完全D型 PartialD D抗原弱表达 并且血清中含有抗 D抗体的Rh阳性者 基因表达不完全的基因基础主要是D基因和CE基因形成的杂交基因和D基因部分缺失 氨基酸改变位于细胞膜外 Rh血型抗原 不完全Du型 PartialDu型 抗原数量少 质也不同于正常D抗原增强D D 型 CE基因沉默 不表达其产物 3 Rh血型抗体多数为IgG抗体除抗D外 抗E最为常见 次为抗c 抗E多为IgG 偶有IgM 抗e较少见有些Rh抗体常在一起发生通常抗E和抗c较多见 但抗c不易检出 故平常含有抗E的人受血时 应考虑抗c输入CCDee型人的血液 五 D抗原和临床1 RhD 孕妇产生HND HDN的发病示意图 D抗原和临床 2 D不完全型的相关问题常规检测D抗原时 如果盐水法为阴性 应进一步使用间接抗球蛋白试验检测弱D作为献血者为阳性弱D作为受血者为视为D阴性 只能接受D阴性血液D不完全型的孕妇有机会产生HND Rh血型抗原检测 六 Rh D 血型鉴定的常用方法单克隆抗体IgM类 可在盐水介质 室温或37 环境中凝集IgG采用间接抗球蛋白试验玻片法 单克隆试剂IgM IgG 试管法 单克隆试剂IgM IgG 酶介质法 IgG试剂 微柱凝胶法 临床意义 1 新生儿溶血病Rh抗体引起HDN比ABO溶血严重 发育程度 补体2 溶血性输血反应临床输血意义仅次于ABO血型2 3产生抗体 三 红细胞血型血清学检测技术 免疫血清学技术的基石 血型抗原与抗体 一 血型抗原的发育在胚胎早期A和B抗原就开始产生 但到出生时 还没有完全发育 与抗A和抗B试剂血清反应比成人弱 2 4岁时才能充分表现出抗原性 Rh抗原在胎儿早期就充分发育并维持整个一生 脐带血或新生儿的红细胞Rh血型与成人一样强 血型物质 blood groupsubstance 存在于体液中的可溶性红细胞血型抗原 有的血型物质是红细胞合成的 有的非红细胞合成 Lewis为血浆中的血型物质吸附到红细胞表面 从而表达该抗原 二 红细胞血型抗体分类规则抗体指ABO血型系统有规律产生的抗A和抗B 符合Landsteiner规则 是反定型的依据 不规则抗体是指抗A 抗B以外的抗体 这些抗体除少数可以天然产生外 主要是由输血或妊娠使机体暴露于外来抗原免疫所致 完全抗体在盐水介质中与相应的红细胞血型抗原发生肉眼可见的凝集反应的抗体称为完全抗体 IgM抗体绝大部分是完全抗体不完全抗体大部分IgG抗体与具有相应抗原的红细胞在盐水介质中能够特异性结合 但不发生肉眼可见的凝集反应 该类抗体被称为不完全抗体 很多IgG类抗体是不完全抗体 但不是所有IgG抗体都是不完全抗体 如O型人血清中的IgG抗体以及单克隆IgG类的血型抗体也能在盐水介质中出现肉眼可见的凝集反应 按抗体与抗原反应的最适温度 分为冷型抗体 coldantibody 和温型抗体 warmantibody 血型抗体的产生出生时 正常的抗A和抗B还没产生或较弱 到三个月时 反应基本上与成年人的一样 5 10岁时 抗体的产生达到高峰 具有较高效价 Rh抗体主要通过输血或妊娠免疫而产生 一般在初次免疫后2 6个月内出现 经再次免疫后 3周内抗体浓度可达到高峰 二 血凝实验 血凝实验是指抗体和红细胞在液体介质中发生的肉眼可见的凝集反应 其原理是抗体分子在相邻的红细胞表面抗原决定簇之间搭桥 使之形成肉眼可见的颗粒状凝集团块 凝集可分为直接凝集 directagglutination 和间接凝集 indirectagglutination IgM抗体造成的直接凝集 IgG间接凝集反应 致敏阶段 间接凝集反应 真凝集阶段 在盐水凝集法或低离子强度盐水法的基础上 加入抗人球蛋白抗体 抗抗体 通过抗人球蛋白抗体特异性搭桥作用 促进红细胞的凝集 载体不同1 平板法2 试管法3 微孔板法 试管中红细胞凝集强度的判断 凝集反应判定标准 4 1个凝块 背景清晰 无游离红细胞3 2 3个凝块 背景清晰 无游离红细胞2 多个小凝块 背景稍浑浊 游离红细胞较少1 无数的小颗粒 背景浑浊 有游离红细胞W 肉眼呈 粗颗粒 样 有较多的游离红细胞阴性 肉眼观察不到凝集 镜下全为游离红细胞 试管法血凝实验的特点及应用 特点 快速 准确 结果可靠 缺点是影响因素多 灵敏度低 应用 应用极为广泛 如血型的鉴定 交叉配血 抗体鉴定与IgG效价测定等 影响红细胞凝集反应的因素 反应温度 30 37 溶液的pH值 pH6 8 7 2孵育时间 30mins离子浓度降低抗原与抗体反应介质的离子 如Na Cl的浓度 能够使抗原抗体间相反电荷恢复和增加 增强吸引力 从而能提高抗原与抗体的结合速度 抗原抗体的比例增加抗原红细胞数量 则会减少每个红细胞结合抗体的量 因而减弱其凝集 若适当增加抗体比例 则有助于对弱反应抗体的检出 但要注意前带现象 1 盐水凝集法 是操作最简单的方法 所需设备简单 影响因素的干扰多 灵敏度相对较低 要求抗A血清效价 1 128抗B血清效价 1 64 而冷凝集素效价 1 4 对抗原抗体反应的亲和力和特异性还有较高要求目前只有一些基层医院血库仍将此方法作为血型检查的主要方法 2 低离子强度盐水法当降低介质溶液的离子强度时 可减少红细胞外围的离子云的强度 促进IgG分子在两个红细胞间的桥连 进一步促进红细胞间的凝集 ABO血型全自动微板法检测技术 原理待测微板进入自动扫描暗室中 扫描U型孔底中线上40个点的透光度 凝集孔的RBC凝块聚集于孔中央 透光度小 而外周游离的RBC很少甚至没有 透光度大 透光度曲线呈 U 型 设定此类曲线为阳性参考曲线 非凝集孔的RBC均匀分布 透光度曲线平缓呈 型 设定此类曲线为阴性参考曲线 微孔板在酶标仪上读数后每孔的曲线与设定的参考曲线相比较 根据程序设定的ABO血型正反定型结果模式统计判定样本的血型 优点 1采用自动化加样 加样量精确 迅速2酶标仪判读 血型结果自动打印3由于离心 沉淀 振荡 提高了弱抗体的检出率4试剂用量少 经济5 降低了实验者的工作强度 减轻精神压力 酶处理试验技术 RBC表面唾液酸所带负电荷 使RBC之间保持相对稳定距离 IgG为单倍体 结合抗原跨度小于RBC间距离 不会引起凝集 某些蛋白水解酶 可减少负电荷的数量 最常用的酶有 木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶 原理 蛋白水解酶 作用于红细胞表面的多糖链 切断带有负电荷的羧基集团的唾液酸 减少红细胞表面负电荷 缩短红细胞之间的距离 分类 一步法二步法 三 微柱凝胶免疫实验 Microcolumngelimmuno assayMGIA MGIA本质 是血凝实验 即红细胞抗原抗体在微柱腔内的凝胶介质中发生肉眼可见的凝聚反应 抗原抗体反应与凝胶分子筛技术相结合的产物 通过调节葡聚糖凝胶的浓度来控制分子筛孔径大小 使分子筛只允许游离红细胞通过 从而达到分离凝集红细胞和游离红细胞的目的 卡式检测法 微柱凝胶试验 法国Dr YvesLapierre在1990年首先发明的一项免疫学检测新技术 是微柱凝胶技术与以上所有实验技术相结合的产物 1994年此项技术获得了美国FDA FoodandDrugAdministration 的认可 经过不断改进和临床大量应用 目前 在多数发达国家 此项技术已作为常规的红细胞血型血清学检测技术应用于临床 工作原理 微柱 柱体上端 柱体过滤介质 颗粒直径26 103nm的葡聚糖凝胶 凝胶间缝隙只允许游离红细胞通过缓冲液 低离子介质 加或不加抗血清 工作原理 红细胞和抗血清加在凝胶上部 反应 低速离心后观察凝集的红细胞 被阻挡在小柱中凝胶的上部或中央 证明发生凝集反应 判断凝集反应阳性游离的红细胞 被挤过装有过滤介质的小柱 而到达小柱的底部 证明未发生凝集 判断凝集反应阴性 微柱凝集试验技术分类 中性胶特异性胶 含有特意性抗体抗球蛋白胶 抗球蛋白胶 可进行IgG类抗体的检测 结果判读模式 4 红细胞复合物位于胶表面 3 大部份红细胞复合物位于胶表面 小部分位于胶中上部 2 大小部分位于胶中部 小部分位于胶中上部 1 复合物位于胶中近底部 与阴性管结果对照 如有差别 即可判断 d p 对某特异性抗体 同时存在阴性与阳性细胞 而发生混合反应 Hemo 溶血反应 离心后红细胞沉积在微柱凝胶管底部 微柱凝胶免疫实验的特点 灵敏度和准确性高 重复性好简便 不需要清洗红细胞标本用量少有利于新生儿等标本检测实验全过程标准化标准化的孵育时间 离心时间以及结果判读消除了主观因素对弱反应结果的判读 减少了人为错误的发生实验结果客观性强 而且稳定 可以长期保存 微柱凝胶免疫实验临床应用 红细胞血型鉴定交叉配血抗体筛查新生儿溶血病的检测 四 抗人球蛋白试验 antihumanglobulintest AGT Coombs试验 原理 抗人球蛋白试验 又称Coombs试验 是检查不完全抗体的一种方法 用人血清免疫家兔 产生抗人球蛋白抗体 即抗抗体 将抗人球蛋白抗体 抗抗体 加入已经致敏的红细胞盐水悬液中 红细胞表面的不完全抗体Fc段与抗人球蛋白抗体的Fab段发生特异性结合 使红细胞发生凝集 本试验可分为直接抗人球蛋白试验和间接抗人球蛋白试验 直接抗人球蛋白试验 directantiglobulintest DAT 检测红细胞是否在人体内被不完全抗体致敏的试验 间接抗人球蛋白试验 indirectantiglobulintest IAT 间接抗球蛋白试验是一种检测血清中不完全血型抗体的方法 即用已知抗原的红细胞测定受检血清中相应的不完全抗体 或用已知抗血清测定受检红细胞上相应抗原 IAT的临床应用 红细胞血型定型用已知特异性的不完全抗体与被检红细胞孵育 洗涤后加入抗人球蛋白试剂 可鉴定该红细胞血型 对输血前患者 新生儿不完全抗体的筛查与鉴定用已知血型抗原的红细胞和被测血清孵育 可鉴定血清中的不完全抗体 抗体效价的检测将倍比稀释的血清加入已知血型抗原的红细胞中 孵育后加入抗人球蛋白试剂 可测定血清中不完全抗体的效价 相容性配血 DAT的临床应用 新生儿溶血病 HDN 的诊断母体的IgG抗体穿过胎盘结合到胎儿红细胞免疫溶血性输血反应患者同种异体不完全抗体的确证受血者输人红细胞后 免疫产生抗体 输入的红细胞可被该抗体致敏 而出现DAT阳性 自身免疫溶血性贫血的辅助诊断自身免疫溶血性贫血患者可产生针对自身红细胞的抗体 这些抗体可结合到红细胞膜上而使细胞存活期缩短 或直接溶血 Rh血型鉴定的原理 酶介质法凝聚胺试验抗球蛋白试验人源盐水介质抗D试验低离子强度溶液试验 在盐水介质中 IgG抗体不凝集RBC IgM抗体凝集RBC示意图 在盐水介质中 在凝聚胺 酶处理下IgG抗体可凝