H1N1 SIV（猪流感病毒）HA蛋白的生物信息学分析、高效挑战杯宣传册

H1N1 SIV（猪流感病毒）HA蛋白的生物信息学分析、高效可溶表达及鉴别诊断SIV的夹心ELISA方法的建立作者：谢易恒 李栋 苏培穗 陈成果 周科 黄慧雄指导老师：谢青梅 副教授作品编号：DC244072 作品类别：自然科学类学术论文作品简介：H1N1亚型猪流感病毒（SIV）的HA蛋白在流感病毒传染的过程中刺激机体产生的中和抗体可以抵抗病毒感染。本研究对H1N1 SIV HA蛋白进行了生物信息学分析；并成功构建了重组质粒pBCX-HA，将重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中高效可溶表达；Western-blot分析表明可溶表达的融合蛋白HA与H1N1亚型SIV阳性血清具有良好的免疫反应性；用纯化的HA融合蛋白筛选HA特异性的SIV单克隆抗体，建立了高特异性的检测H1N1 SIV的ELISA方法，为猪流感病毒的快速诊断奠定基础。本研究选用pBCX高效可溶表达载体高效表达H1N1 SIV 的HA蛋白。用msyB基因作为融合伴侣，使HA融合蛋白高效可溶表达，突破了传统大肠杆菌表达系统包涵体表达外源蛋白（多肽）的技术瓶颈。msyB基因编码蛋白是大肠杆菌本身的蛋白，是一种高可溶性多肽，本身在大肠杆菌中表达量很高，其作为载体蛋白具有稳定性、可溶性和表达水平高的特性。当被诱导表达时，msyB多肽作为载体可与同外源蛋白一道分泌到大肠杆菌的胞质中表达，大大增加了外源蛋白的可溶性，且表达的外源蛋白能够产生正确折叠。对那些在胞内表达且表达产物对细菌有毒性的外源基因来说，可以减弱其毒性，提高表达量，提高融合蛋白的稳定性。因此选用大肠杆菌msyB多肽基因是构建高效可溶表达载体的最优融合伴侣基因之一。 pBCX载体的结构示意图采用RT-PCR的方法扩增H1N1 SIV的HA基因后，将其克隆到高效可溶表达载体p-BCX上，成功构建重组载体质粒pBCXHA并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达。H1N1亚型SIV HA基因的RT-PCR扩增产物电泳结果 HA融合蛋白的不同小时诱导SDS-PAGE 分析 HA基因表达产物Westen blot分析 SDS-PAGE可检测到分子量约为94.0ku的融合蛋白，通过薄层凝胶扫描分析表明表达产物占菌体总蛋白的29.5。Western-blot证实，可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫反应性。纯化表达的HA融合蛋白作包被抗原用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选，成功筛选到2株猪流感病毒针对HA蛋白抗原表位的单克隆抗体；用制备的SIV单克隆抗体，建立了高特异性的检测H1N1亚型SIV的夹心ELISA方法，为猪流感病毒的快速检测提供有效的方法。抗原稀释度抗体稀释倍数1：801：1201：1601：2001：2401：2801：202.3522.9333.4323.6913.3904.1081：402.7173.3164.2203.9134.2784.2091：803.1084.0514.2914.5894.8294.9101：1003.7754.6515.0095.2645.4865.2171：2004.2505.0985.2295.1625.6885.2171：4004.1024.8105.0425.2105.6215.3801：6004.1054.7165.2365.2995.1065.2591：8004.1754.3295.2395.1355.3515.237H1N1 SIV HA抗原抗体最佳稀释度确定 据了解当前猪流感免疫疫苗主要时灭火疫苗及弱毒疫苗，因此对亚单位疫苗及基因疫苗的研究就显得有广阔的前景，从