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发酵工程完整版发酵的定义 ：无氧条件下，底物脱氢后产生的还原力H未经呼吸链传递而直接交给某一内源性中间代谢产物，以实现底物水平磷酸化的一类低效产能生物氧化反应称为发酵。发酵流程：保藏菌种、斜面活化、扩大培养、种子罐、主发酵、产物分离纯化、成品比拟放大的基本过程：普遍：小型实验中间规模试验(中试)大型规模生产(工业化生产)发酵工程：斜面菌种摇瓶试验(培养基、 温度、 起始pH值、 需氧量、 发酵时间)小型发酵罐中试大规模工业生产 发酵工程的发展经历了哪几个阶段：1. 自然发酵时期2. 纯培养技术时期（列文虎克、巴斯德、科赫发明固体培养基）3. 通气搅拌的好气性发酵工程技术时期（弗莱明发现了青霉素）4. 人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术时期5. 发酵动力学、连续化、自动化工程技术时期6. 生物合成与化学合成相结合工程技术时期发酵过程的基本参数:温度、PH值、罐压、溶解氧、氧化还原电位、空气流量、CO2含量、泡沫等微生物工业发展趋势1、几个转变 ：分解代谢合成代谢 自然发酵人工控制的突变型发酵代谢控制发酵通过遗传因子的人工支配建立的发酵（如工程菌）2、化学合成与生物合成相结合 3、大型、连续化、自动化发酵 发酵罐的容量可达500t，常用的也达20-30t。4、人工诱变育种和代谢控制发酵 微生物潜力进一步挖掘，新菌株、新产品层出不穷。 5、原料范围不断扩大 石油、植物淀粉、天然气、空气、纤维素、木质素等举例说明微生物工业的范围：酿酒工业（啤酒、葡萄酒、白酒） 食品工业（酱、酱油、食醋、腐乳、面包、酸乳）有机溶剂发酵工业（酒精、丙酮、丁醇） 抗生素发酵工业（青霉素、链霉素、土霉素等）有机酸发酵工业（柠檬酸、葡萄糖酸等） 酶制剂发酵工业（淀粉酶、蛋白酶等）氨基酸发酵工业（谷氨酸、赖氨酸等） 核苷酸类物质发酵工业（肌苷酸、肌苷等）维生素发酵工业（维生素B12、维生素B2等） 生理活性物质发酵工业（激素、赤霉素等）名贵医药产品发酵工业（干扰素、白介素等）微生物菌体蛋白发酵工业（酵母、单细胞蛋白）微生物环境净化工业（利用微生物处理废水等）生物能工业（沼气、纤维素等天然原料发酵生产酒精、乙烯等能源物质）微生物治金工业（微生物探矿、治金、石油脱硫等）温故知新填空：微生物工程可分为 发酵 和 提纯 两部分，其中以 发酵 为主。化学工程与发酵工程的本质区别在于 化学工程利用非生物催化剂，发酵工程利用生物催化剂酶 。判断：发酵产品是经微生物厌氧生物氧化过程获得的。单菌发酵：现代发酵工业中最常见，传统发酵工业中很难实现。 混合菌发酵：自然发酵与人工接种发酵相结合液态发酵：发酵基质呈流动状态，如啤酒发酵、柠檬酸发酵等。半固态发酵：发酵基质呈半流动状态，如黄酒发酵、传统稀醪酱油发酵等。固态发酵：发酵基质呈不流动状态。如固态酱油发酵、米醋发酵、大曲酒（白酒）发酵等。 发酵产品主要类型：A微生物菌体1.单细胞蛋白 （饲料添加剂、食品）2.食（药）用菌 （蘑菇、香菇、灵芝、猴头等）3.微生物农药（细菌、真菌、病毒：苏云金杆菌、白僵菌）4.疫苗（细菌、病毒） 第一代：病原微生物及其产物 第二代：基因工程疫苗 第三代：人工合成疫苗5.微生态制剂（细菌：乳酸菌、双歧杆菌）B代谢产物（分为初级代谢产物、次级代谢产物，这是一类当前最主要的微生物发酵产品，也是开发潜力最大的一类）；酒精、酱油、食醋、酸奶、谷氨酸、柠檬酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素、抗生素、毒素、激素、色素等 C酶酶制剂工业是利用微生物发酵，获得与生物体内的酶具有相同功能的酶制剂。近几年，酶制剂的生产和应用研究已普遍引起各国的重视，已在食品、发酵、纺织、医药、造纸、皮革、化工、石油、畜牧饲料等部门得到应用。我国主要应用在食品方面，其中产量较大的是-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖异构酶、蛋白酶和脂肪酶。发酵工程三要素：原料、菌种、工艺条件如何理解：传统工艺，原料决定菌种，现代工艺，菌种决定原料 传统工艺的发酵原料是一种选择培养基，利用这种选择作用，把自然界带入的各种野生菌，在发酵基质上进行选择富集培养，这些微生物生长和代谢的结果可生产出有特殊风味的食品。 现代工艺在使用纯种发酵剂前，我们必须对原料进行灭菌，以防止其他杂菌对发酵的干扰。 发酵产品主要有哪些附加值一、发酵有利于食品保藏 ：食品发酵后，改变了食品的渗透压、酸度、水的活性等，从而抑制了腐败微生物的生长，有利于食品保藏。 二、发酵产品的保健作用：有些食品经过微生物发酵后，不仅能产生酸类和醇类等，还能产生某些抗菌素可抑制致病菌和肠内腐败菌。有些发酵食品还具有预防心脑血管疾病、整肠、改善便秘、降低胆固醇、增加免疫功能和抗癌等功能。三、发酵增加了食品的营养价值：一方面，发酵通过微生物对营养物质的降解作用，有利于营养物质的消化吸收。另一方面，食品经过发酵后可以提高某些营养组分如蛋白质的含量，并提高其吸收率，甚至通过微生物的发酵作用，还可以产生一些维生素。 温故知新1、写出生产以下产品的主要菌种： 啤酒（啤酒酵母）、黄酒【霉菌（根酶、曲霉）、酵母菌、细菌】、味精（谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌）、柠檬酸（黑曲霉）、食醋（霉菌、酵母菌、醋酸菌）、酸奶（乳酸菌）2、发酵工艺控制中，主要应监控 温度 、 PH值 、 溶解氧 、泡沫、氧化还原电位等。微生物工业发酵的基本过程菌种发展总趋势，如何理解发酵菌氧化菌野生菌变异菌自然选育代谢控制育种诱变育种基因重组定向育种工业菌种选育的定义、方法菌种选育：按照生产要求，根据微生物遗传变异理论，利用自然菌种筛选、人工诱变育种、代谢控制育种或基因重组定向育种等方法得到优良菌种的工作。方法：(1)自然选育：从自然界土壤、水、空气、动物、植物、矿物等样品中分离筛选得到菌种的方法。 (2)生产育种：长期生产过程中自然突变获得优良菌株。 (3)抗噬菌体菌株的选育（如去除吸附位点）(4)诱变育种：采用物理、化学诱变因素处理微生物细胞，提高基因的随机突变几率，然后通过定向筛选获得所需优良菌株。(5) 代谢控制育种：通过改变微生物菌种的代谢途径或代谢自动调节系统（如增加特定基因拷贝数来提高限速酶含量）而使微生物发生异常代谢，使所需中间代谢产物过量积累。(6) 基因重组定向育种：通过转化、转导、杂交和原生质体融合等遗传学方法和技术定向地重组微生物DNA，使微生物的功能发生定向的改变。工业菌种衰退的定义、防止方法菌种衰退的概念 ：指菌种整体在多次接种传代过程中逐渐造成生产能力降低，表现为发酵力（如对培养基的利用）或繁殖力（如孢子的产生）下降或发酵产物得率降低的现象。 防止菌种衰退的方法 ：1.作好菌种保藏工作2尽可能使每次培养条件适合而一致3尽量减少传代次数 4应使用幼龄菌培养 菌种复壮的概念与方法菌种复壮：在菌种已衰退情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退群体中找出少数未衰退的个体，以恢复原有典型性状的措施。衰退菌种复壮的方法 1.单细胞菌株分离法 2沸水筛选法：菌液用沸水处理后进行单细胞菌株分离，从而挑选出优良菌体。 3.改变培养条件法：采用有利于高产菌株而不利于低产菌株的条件来选出高产菌株。 4.通过宿主体复壮5.诱变处理法：对发生回复突变进行重新诱变育种。工业菌种保藏原则与方法原则：挑选优良纯种，最好是休眠体（如孢子、芽孢等），创造一个最有利于休眠的环境条件（如低温、干燥、缺氧、营养物质缺乏等），就可以达到菌种保藏的目的。同时，作为可行的方法，还要考虑方法的经济和简便。方法：1.斜面低温保藏法：菌种在斜面培养基上培养，生长旺盛后存放在4-8的冰箱中，一般半年要移植一次。适合保藏实验室常用菌种。2.低温冰箱保藏法：菌种经液体培养后，加入无菌甘油，使甘油含量为30-40%，置于-80低温冰箱中保存，保存期为1-10年。适用于保存各类微生物菌体。 3.石蜡油封保藏法 ：医用石蜡油灭菌冷却后加在斜面菌种上,超过斜面顶部1cm，在室温下或冰箱里可保存1-10年。几乎所有微生物都适用。 4.砂土保藏法： 将干的孢子、芽孢与彻底灭菌的砂土混合后装入砂土管，放入装有吸湿剂的干燥器或大试管中，加橡皮塞用蜡封严，置阴凉干燥处或冰箱中可保藏1-10年。适合于孢子、芽孢等的保存。5.硅胶保藏法 ：以纯净硅胶代替砂土,其他与砂土保藏法一样。 6.冷冻干燥保藏法 ：瓶中加入菌体或孢子悬液，-40低温冰箱冷冻1h，室温真空干燥固封，可保存10-数10年。适用于保存各类微生物菌体。保存运输方便。 7.液氮超低温保藏法 ：菌种密封于安踣瓶中, 慢速冻结器中以每分钟下降1的速度下降到-35，再迅速降温至-196，并在该温度下的液氮超低温罐中保存，保存期为3-9年。适用于保存各类微生物菌体。 工业菌种扩大培养工艺与级数获得活力旺盛的、接种数量足够、纯而壮的培养物。种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。斜面菌种一级种子摇瓶培养二级种子罐培养发酵罐 （二级） 尽量采用二级发酵斜面菌种一级种子摇瓶培养二级种子罐培养三级种子罐培养发酵罐 （三级）举例谷氨酸生产的种子制备：斜面培养一级种子培养二级种子培养发酵 温故知新1. 菌种选育指按照生产要求，根据微生物遗传变异理论，利用 自然菌种筛选 、 人工诱变育种 、 代谢控制育种 或 基因重组定向育种 等方法得到优良菌种的工作。 2.微生物菌种保藏的常用方法有 斜面低温保藏法 、 低温冰箱保藏法、冷冻干燥保藏法、 砂土保藏法 、硅胶保藏法和 液氮超低温保藏法 等。？3.高丝氨酸缺陷型菌株由于缺乏高丝氨酸脱氢酶，不能合成 高丝氨酸 ，从而走另一代谢途径，使 赖氨酸 大量积累。 培养基种类：1. 按成分不同划分：天然培养基、半组合培养基、组合培养基2. 按物理状态不同划分：固体培养基、半固体培养基、液体培养基、脱水培养基3. 按功能不同划分：选择培养基、鉴别培养基4. 按培养目的不同划分：种子培养基、孢子培养基、发酵培养基发酵培养基设计的原则要“投其所好”， 明确目的 ，是实验室用还是工业大生产用，是种子扩大培养还是生产发酵产物？要求获得菌体还是积累代谢产物，是正常代谢产物还是异常代谢产物，是为异养菌设计的还是为自养菌设计的？用于培养菌体种子的培养基营养应丰富，氮源含量较高；用于生产代谢产物的发酵培养基氮源一般应比种子培养基低，若代谢产物是次级代谢产物，要考虑是否加入特殊物质；工业生产发酵培养基，应选择来源广泛、价格低廉的原料。发酵培养基设计的基本步骤1.调查研究：菌种来源、生理特性、生物合成途径,产物化学性质、提炼方法、质量要求等，以便“投其所好”。2.培养基成分的确定：C/N比、重要金属非金属等、复合培养试验3.发酵条件的确定：温度、起始pH值、溶解氧、氧化还原电位、渗透压等查阅文献，借鉴经验，借助单因子试验与复合因子试验（如正交试验法）等对培养基成分与发酵条件进行优化。4.补料：对碳及氮的代谢予以适当控制，或添加各种养料和前体物质。 5.不断完善：在生产实践过程中不断调整改进。 代粮发酵主要原料野生植物淀粉、野生植物纤维、木屑水解物、石油原料与产品（如石蜡、醋酸、乙醇等）、空气原料（碳酸气） 前体物质、促进剂的概念前体物质：在有些氨基酸、核苷酸、抗生素等发酵中添加一些特殊物质能获得较高的产率，它们在发酵中主要起避免反馈抑制、作为产物的前身等作用，这些特殊物质称为前体物质。 促进剂：在氨基酸、抗生素和酶制剂发酵过程中，可以在发酵培养基中加进某些对发酵起一定促进作用的物质，称为促进剂。 促进剂作用原理（以抗生素生产为例）促进剂在抗生素生产中的作用原理：1.起生长因素作用 2.推迟菌体自溶 3.抑制了某些合成其它产物途径而使之向所需产物途径转化 4.降低了产生菌的呼吸 5.改变发酵液的物理性质，改善通气效果 6.与产物结合，防止反馈抑制 抗生素的用途1.治疗人类各种病症(如肺结核) 2.用于饲料工业的添加剂(注意用量 )3.食品工业的冷藏、冷冻的保存剂 4.防治农作物病虫草 （农用抗生素）抗生素提纯主要方法：大多数抗生素是从滤液中提取的。1.吸附法 ： 利用活性炭、氧化铝等吸附剂吸附发酵液中的抗生素，再以适宜的pH值和洗脱剂洗脱，以达到浓缩和提纯目的。此法选择性不高，获得产品纯度较低。 2.溶媒萃取法：利用抗生素在不同的pH值下在水或有机溶剂中的溶解度不同，反复提取以达到浓缩和提纯的目的。 3.离子交换法：利用某些抗生素盐类可解离为阳离子和阴离子，经离子交换树脂达到提纯和浓缩的目的。 此法的优点是成本较低，产品纯度较高，在生产上较为经济和安全。4.沉淀法：利用某些抗生素和酸碱或金属盐类，形成不溶性或溶解度极小的复盐，使抗生素从发酵液中沉淀析出，然后进一步精制。 新抗生素生产工业化途径1.抗生素生产菌株的分离及筛选：大部分抗生素生产菌是从土壤中分离的，特别是富含有机氮的土壤，所以常用肥沃的菜园或森林等处的土壤作为分离抗生素生产菌的来源,进行分离和筛选。2.抗生性药理试验：分离的某一菌株可使用检定菌(如:病理性葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、真菌等)确证是否能生产抗生素物质。常用方法有：（1）交叉划线试验法 （2）打点法3生成新抗生素的确证：生成的抗生素到底是新产品还是已知的，就需对其进行一系列的试验，连续测定并记载此抗生素对各种检定菌的生长阻止情况，然后对照抗菌性带表，即可确定该抗生素的种类或为新品种。4.工业化阶段：如果发现了新的抗生素，还应该检测它对动物的毒性。如果得到了良好的临床应用试验结果，就可开始探讨工业生产的发酵条件，顺序为振荡培养、小型发酵槽、试验工厂等。包括确立培养基的组成、培养条件的选择和精制设计等等。同时在生产过程中应不断注意菌株的改良问题。温故知新1、实验室最常用培养基是（C ）A、天然培养基 B、组合培养基 C、半组合培养基 2、一般来说，发酵培养基要求（ A ）A、碳源丰富 B、氮源丰富 C、原料精细3、在微生物工业菌种筛选中最常用的是（ B ），在食品或环境等微生物指标检测中常用（ A ）A、鉴别培养基 B、选择培养基 C、液体培养基4、制备固体培养基时需在液体培养基中加入 1.5-2.0% 琼脂。概念：淀粉水解糖、液化、糖化、糖蜜预处理 淀粉水解糖：在工业生产上将淀粉水解为以葡萄糖为主的水解液的过程称为淀粉水解糖的制备，制得的水解液称为淀粉水解糖。液化：利用a-淀粉酶将淀粉液化转化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加的过程；糖化：利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程 糖蜜预处理：发酵前对糖蜜进行稀释、酸化、灭菌及澄清等过程称为糖蜜前处理 糖蜜是甘蔗或甜菜制糖的副产物。结合淀粉水解糖的制备方法与各自优缺点，思考实际生产中，该如何对方法进行选择集中酸法与酶法优点、克服两者缺点的方法，可分为：酸酶法 酶酸法适用于：颗粒坚硬原料 颗粒不均匀、杂质较多原料不适用于： 正好相反从水解糖液的质量和降低糖耗、提高原料利用率来说，选择酶法；从水解速度来说，选择酸法 ；综合考虑各方面因素，选择酸酶结合法，尤其是酶酸法 甘蔗糖蜜与甜菜糖蜜的主要区别：甜菜中蔗糖较多，而转化糖含量极少，但总糖量接近。甘蔗糖蜜呈微酸性，而甜菜糖蜜则呈微碱性。甜菜糖蜜中总氮量较丰富。糖蜜作为发酵原料的适用性：1含糖量很高。2主要含非结晶糖，回收困难。3含大量的可发酵性糖，无需糖化。 谷氨酸发酵糖蜜预处理的方法与各自原理（详见课本30页）1、 糖蜜预处理法：包括活性炭处理法、树脂处理法、亚硝酸处理法；通过吸附或者破坏部分生物素以出去过量的生物素。2、 添加化学药剂：包括青霉素、表面活性剂、抗氧化剂等；通过化学药剂改变细胞膜结构，增加其对谷氨酸的渗透性。3、 追加糖蜜法：当谷氨酸产生菌细胞生长达到最大值，产酶系统完全形成时，添加过量的生物素也不会影响发酵。因此可先以葡萄糖培养基培养，当菌体生长达到最大值时，再加生物素含量多的糖蜜进行发酵，就可以提高谷氨酸的生成量。4、 营养缺陷型变异株法：目前的糖质原料发酵的谷氨酸产生菌以生物素缺陷型为主。采用人工诱变的方法使其变为其他营养缺陷型则可以在生物素过量的培养基中发酵形成大量谷氨酸。温故知新1、淀粉水解糖制备中,酸酶结合法可分为酸酶法与酶酸法,对于杂质较多原料,宜采用 酶酸 法,对于颗粒较坚硬原料,宜采用 酸酶 法,在工业生产中,综合考虑各方面因素，较多选择 酶酸法 法。2、发酵前对糖蜜进行 稀释 、 酸化 、 灭菌 及 澄清 等过程称为糖蜜前处理 。发酵机制：指微生物通过其代谢活动，利用基质合成人们所需要的产物的内在规律。 代谢控制发酵：人为地改变微生物的代谢调控机制，使有用中间代谢产物过量积累，这种发酵称为代谢控制发酵。巴斯德效应：在好气条件下，酵母发酵能力降低的规律称为巴斯德效应。鲜啤酒：未经巴氏灭菌或超滤即出售。新鲜、爽口，保质期短。生啤酒：未经巴氏灭菌，但经超滤等进行无菌过滤后出售。新鲜、爽口，保质期较短。熟啤酒：经巴氏灭菌后出售。苦味增加，有熟味，保质期长。干酒：糖度小于1%， 酒精度15%-16%，代表为元红酒（即状元酒）甜酒：糖度大于19%， 酒精度20%，代表为香雪酒所谓“加饭酒”，即是在发酵期间，加大饭量和曲量，使酒精、糊精、糖分等含量较多，低温缓慢发酵（发酵时间长，约需3个月），酒味醇厚。巴斯德效应机制（49）：1、 磷酸果糖激酶：好气条件下，糖代谢进入TCA循环，产生柠檬酸等，并通过氧化磷酸化产生大量ATP,柠檬酸浓度增加反馈抑制磷酸果糖激酶的合成，ATP加强这种阻遏作用，同时ATP也可以反馈抑制磷酸果糖激酶的活性。2、 己糖激酶：磷酸果糖激酶受到抑制，导致6-磷酸果糖积累，6-磷酸果糖：6-磷酸葡萄糖=3：7时达到动态平衡，6-磷酸葡萄糖积累，反馈抑制己糖激酶，抑制葡萄糖进入细胞，从而导致葡萄糖利用率降低3、 丙酮酸激酶：好气条件下，丙酮酸激酶活性降低，次酶受磷酸果糖激酶催化生成的1，6-二磷酸果糖的激活，当磷酸果糖激酶活性降低时，丙酮酸激酶活性降低，磷酸烯醇式丙酮酸积累，从而反馈抑制己糖激酶活性，降低酶解速度。啤酒、黄酒生产原理啤酒的生产原理：1.大麦经发芽得到麦芽。2.麦芽糖化所得糖在啤酒酵母作用下进行酒精发酵生成二氧化碳和乙醇。3.同时，麦芽在发酵过程中产生了有机酸、高级醇和酯类，与啤酒花共同形成啤酒独特的风味。黄酒的生产原理：1.糖化：在酒曲、酒药的作用下，糯米经糖化，淀粉分解为糊精、多糖、葡萄糖等。2.酒精发酵：在酒药、酒母的作用下，糯米经酒精发酵，得到酒精。3.其他变化：原料在发酵过程中产生了糖分、糊精、有机酸、氨基酸、酯类、甘油、维生素等，得到了香味醇厚，营养丰富的黄酒。啤酒：水， 酒之血； 麦芽，酒之肉（骨）；酒花，酒之眼； 菌种，酒之魂。啤酒花的作用：1.酒花油与苦味酸赋予啤酒独特的香味和爽口的苦味；2.酒花树脂可提高啤酒泡沫持久性；3.沉淀蛋白质，有利于啤酒澄清；4.抑菌防腐。如何理解在黄酒生产中,米为酒之肉,水为酒之血1.米：米是酒的肉。糯米做的黄酒质量最好，其原因有二：（1）糯米淀粉含量比其他米高，蛋白质等其他成分少，所以糯米酒杂味少；（2）糯米中的淀粉几乎全是支链淀粉，易于糊化而难以糖化彻底，所以糯米酒残留糊精和低聚糖较多，酒的口味较甜厚。2.水：水是酒的血。水质的好坏直接影响酒的质量。（1）水是酒的主要成分（约占80%）；（2）水是物料和酶的溶剂；（3）水中的微量元素是微生物繁殖所必需的养分。温故知新1、糖酵解与巴斯德效应的三个关键酶均是 己糖激酶 、 磷酸果糖激酶 和 丙酮酸激酶 。2、在啤酒生产中， 酒花 被喻为酒之眼， 菌种 被喻 为酒之魂。3、葡萄糖经EMP途径生成 丙酮酸 ，在厌氧条件下，在酵母菌作用下继续生成 乙醇 ，在乳酸菌作用下继续生成 乳酸 。柠檬酸的主要用途：1.在食品工业上:a.用作清凉饮料、糖果业等的酸味料。b.由于柠檬酸是水果的天然成分，不仅是良好的酸味剂，同时具有增溶、缓冲和抗氧化作用，使饮料中的其他成分交融协调，形成调和的口味和气味。 c.也可用作油脂等的抗氧化剂。2.在医药上:a.柠檬酸钠用作输血剂，柠檬酸铁铵用作补血剂。同时可用于血液和血浆的保存，以及制造人造血浆等。b.因为柠檬酸具有抗凝血作用，同时溶解度高，酸根能被直接吸收代谢而无积累。3.在化学工业上:缓冲剂、催化剂、激活剂、增塑剂、鳌合剂、吸附剂、稳定剂、消泡剂等 4.在日常生活中:保健饮品 柠檬酸的生物合成途径图: 葡萄糖经过EMP途径生成丙酮酸，一方面丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-COA；另一方面丙酮酸羧化作用生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰-COA缩合生成柠檬酸。 黑曲霉生产柠檬酸，有那些特有的优势？1.黑曲霉能够利用糖类、乙醇和醋酸等发酵生成柠檬酸2.黑曲霉中存在EMP途径的所有酶 3.黑曲霉中80%的葡萄糖分解代谢走EMP途径4.黑曲霉中存在TCA的酶系柠檬酸为什么能过量积累？1.锰离子缺乏，抑制蛋白质合成，导致NH4+浓度升高，有氧时黑曲霉走不产ATP的侧系呼吸链，解除了对磷酸果糖激酶的抑制，促进EMP途径畅通。2.丙酮酸羧化酶不被调节控制，源源不断提供草酰乙酸。3.丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA和两个CO2固定反应的平衡，及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。3.顺乌头酸水合酶催化建立柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7的平衡，造成柠檬酸最初的积累。4.柠檬酸的积累使pH值下降，抑制了异柠檬酸脱氢酶和顺乌头酸水合酶的活力，促进了自身进一步积累。柠檬酸生产调节措施？1、菌种:选育优良菌株2、发酵条件: 锰离子缺乏 有氧 控制Fe2+含量 pH值2.0-2.5左右温故知新：1、柠檬酸生产最常用的原料是 薯干 ，菌种为 黑曲霉 。2、葡萄糖经过 EMP 途径生成丙酮酸，一方面丙酮酸氧化脱羧生成 乙酰-COA ，另一方面丙酮酸羧化作用生成 草酰乙酸 ，草酰乙酸与乙酰-COA在 柠檬酸合成 酶作用下缩合生成柠檬酸。 3、锰离子缺乏，抑制 蛋白质 合成，导致细胞内 NH4+ 浓度升高，解除了柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制，促进EMP途径的畅通。4、柠檬酸的积累使pH值下降，抑制了 异柠檬酸脱氢酶和顺乌头酸水合酶的活力，促进了自身进一步积累。1. 谷氨酸生产工艺原理(1)淀粉水解糖的制备: 将淀粉先用-淀粉酶液化，后在高温下加酸糖化得到葡萄糖。(2)发 酵:使微生物在特定条件下改变原来的代谢途径，从而积累大量中间代谢产物谷氨酸。(3)谷氨酸提取(等电点锌盐法): 谷氨酸在等电点时溶解度最低。将发酵液pH调至等电点3.22，在冷冻条件下谷氨酸析出。谷氨酸母液仍为谷氨酸饱和溶液，利用谷氨酸锌难溶的性质。采用冷冻pH6.3（谷氨酸锌等电点）条件下，将谷氨酸锌沉淀。在酸性条件下，溶解谷氨酸锌，再调pH至3.22，谷氨酸结晶析出。2.谷氨酸生物合成途径图3.解释表5-3现象：（1）生物素贫乏培养基中积累大量谷氨酸，生物素丰富培养基中几乎不积累谷氨酸。（2）生物素贫乏培养基培养的细胞内谷氨酸含量较生物素丰富的培养基中培养的少，且较容易洗出。机理：生物素是脂肪酸生物合成中的辅酶，生物素缺乏时，不饱和脂肪酸合成受阻，造成磷脂含量不足，细胞膜结构不完整，提高了通透性，有利于谷氨酸分泌到培养基中，消除了谷氨酸对其自身合成的抑制，同时谷氨酸也较容易洗脱。4.谷氨酸生产菌种选育模型（1）生物素缺陷型（2）油酸缺陷型（3）甘油缺陷型（4）温度敏感突变株5.谷氨酸生物合成调节措施1.菌种 选育，如对氟乙酸抗性菌株。2.发酵条件 生物素限制 氟乙酸控制1. 谷氨酸生产常用菌种为 谷氨酸棒杆菌与 黄色短杆菌 。2. 谷氨酸生产淀粉水解糖的制备一般采用 酶酸法,而谷氨酸提取一般采用 等电点锌盐法 。3.糖经EMP和HMP途径生成的丙酮酸经氧化脱羧生成乙酰-COA ，经CO2固定生成草酰乙酸 ，两者合成 柠檬酸 进入三羧酸循环，由三羧酸循环的中间产物-酮戊二酸 在谷氨酸脱氢酶 的催化下，还原氨基化合成谷氨酸。1. 发酵过程中温度的应用技巧 1.接种后培养温度应适当提高 2、发酵液温度上升时，控制在菌体最适生长温度 3、主发酵旺盛阶段，控制在代谢产物合成最适温度 4、到发酵后期，适当升高温度 5、好氧发酵，通气条件较差时，适当降低温度。 6、培养基浓度较低或较易利用，适当降低温度。2.pH值对微生物生长与发酵的影响 1、不同微生物对pH值要求不同。 2、同一微生物生长最适pH值和发酵最适pH值往往不同。 3、同一微生物在不同pH值下，可能形成不同发酵产物。 4、控制一定的pH值是防止杂菌污染的一个重要措施。3.发酵过程中pH值的调节及控制 1、初始pH值 2、缓冲体系 3、加酸、加碱 4、补料 添加碳酸钙法 氨水流加法 尿素流加法 4. 溶解氧控制的意义 1、供氧对需氧微生物必不可少 2、发酵液中的微生物只能利用溶解状态下的氧 3、氧在水中微溶，在发酵液中更难溶 4、在现代高浓度发酵工艺下，氧的供需矛盾更加尖锐 5、发酵工业中氧的利用率很低5. 发酵过程中搅拌对溶氧的作用1.把大气泡打成微小气泡，增加了接触面积与接触时间2.使液体作湍流运动，增加了气液接触时间3.减少气泡周围液膜与菌体表面液膜厚度4.使菌体分散，避免结团，增加接触面积 6.泡沫产生的原因，泡沫过多的危害原因：1、好氧发酵中，需通入大量无菌空气。 2、为增加溶氧，必须进行剧烈搅拌。 3、发酵过程中往往会产生CO2等气体，也会凝聚成气泡。危害：1、造成发酵罐装料系数减少，降低生产能力。 2、严重时造成排气管大量逃液。 3、升到罐顶可能从轴封渗出，增加染菌机会。 4、部分菌丝黏附在罐盖或罐壁上而损失。 5、影响通气搅拌正常进行，妨碍菌体呼吸，造成代谢异常，终产物产量下降或菌体提早自溶，进而 促使更多泡沫生成。7. 消泡方法、原理与各自优缺点1.化学消泡原理：消泡剂是一些表面活性剂，其表面张力较低，接触到气泡膜表面时，气泡膜局部表面张力降低，破坏了力的平衡，造成气泡破裂，产生气泡合并，最后导致泡沫破裂。优点：消泡迅速彻底，效果好。 不需改造现有设备。 不仅适用于大规模生产，也适用于小规模发酵试验。缺点：对氧的溶解有一定程度的影响。 容易带来杂菌污染。2.机械消泡原理：靠机械强烈的震动，压力的变化，促使气泡破裂.优点：不影响氧的溶解。 罐内消泡不增加杂菌污染。缺点：不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素。 需要一定的设备和消耗一定的动力。8. 补料定义、作用与内容 补料定义：在发酵过程中间歇或连续补充某些养料以维持菌的生理代谢活动和产物合成的需要。 作用：1、控制抑制性底物浓度 2、解除或减弱分解代谢物的阻遏 3、使发酵过程最优化 4、可纠正异常发酵 内容：1、补充能源和碳源。 2、补充菌体所需要的氮源。 3、加入微量元素或无机盐。 4、加入前体物质或促进剂。1. 泡沫是 气体 被分散在少量 液体 中的胶体体系，泡沫间被一层液膜隔开而彼此不相连。2.消泡方法有两种，分别是 化学消泡 与 机械消泡 。 3.补料过程中，主要是补充 能源和碳源、氮源、微量元素或无机盐与前体物质或促进剂。 染菌：在发酵培养中侵入了除菌种外，有碍生产的其他微生物。总染菌率：一年内发酵罐中染菌的批数与总投料批数之比。1.染菌的危害 1.浪费大量原料，造成巨大经济损失 2.扰乱生产秩序，破坏生产计划 3.遇到连续染菌又找不到原因，影响生产积极性 4.降低发酵产率、提取得率、产品质量 5.提高三废治理难度2. 不同时期染菌对发酵的影响与挽救方