华中农业大学生物化学考研试题库附答案 蛋白质的合成.doc

第15章 蛋白质的合成一、 教学大纲基本要求蛋白质合成的一般过程以及参与蛋白质合成的各种大分子（包括翻译因子）的结构与功能，蛋白质合成后的加工形式与转运机制，主要内容包括，1.遗传密码，遗传密码的破译策略，遗传密码的特点，2.蛋白质生物合成中的生物大分子结构及其作用，mRNA，rRNA，核糖体，辅助因子。3.蛋白质生物合成的一般过程，原核生物与真核生物蛋白质合成的异同，常用的原核型与真核型蛋白质合成抑制剂，4.多肽合成后的定向输送与加工，信号肽及信号肽的识别，内质网上多肽的糖基化修饰，高尔基体中多肽的糖基化修饰及多肽的分捡（sorting），线粒体、叶绿体蛋白质的来源。二、 本章知识要点（一）遗传密码1、遗传密码的破译主要利用无细胞体外翻译体系，在外加不同的RNA模板、20种标记的氨基酸后，分析多肽产物的氨基酸序列。美国科学家M.W.Nirenberg等由于在该领域的开创性工作于1968年获诺贝尔生理医学奖。2、遗传密码的特点在64个密码子中有61个编码氨基酸，3个不编码任何氨基酸而起肽链合成的终止作用，称为终止密码子，它们是UAG、UAA、UGA，密码子AUG（编码Met）又称起始密码子。（1）方向性：由mRNA的5向到3编码（2）连读性：编码一个肽链的所有密码子是一个接着一个地线形排列，密码子之间既不重叠也不间隔，从起始密码子到终止密码子（包括终止子）构成一个完整的读码框架，又称开放阅读框架（ORF）。如果在阅读框中插入或删除一个碱基就会使其后的读码发生移位性错误（称为移码）。两个基因之间或两个ORF之间可能会互相部分重叠（共用部分碱基序列）。（3）简并性：几种密码子编码一种氨基酸的现象称为密码子的简并性。如GGN（GGA、GGU、GGG、GGC）都编码Gly，那么这4种密码子就称为Gly的简并密码。只有Met和Trp没有简并密码。一般情况下密码子的简并性只涉及第三位碱基。（4）变偶性：密码子中第三位碱基与反密码子第一位碱基的配对有时不一定完全遵循A-U、G-C的原则，Crick把这种情况称为摇摆性（变偶性），也称摆动配对或不稳定配对。密码子的第三位和反密码子的第一位是摇摆位点。(5)通用性与变异性：密码子在不同物种间几乎是完全通用的，但线粒体和叶绿体内有列外情况，不同生物往往偏爱某一种密码子。（二）蛋白质合成的分子基础1、mRNA，不仅是蛋白质合成的模板，而且参与核糖体的组装与翻译起始（1）原核生物mRNA的结构5端SD序列：在起始密码子AUG上游9-13个核苷酸处，有一段可与核糖体16S rRNA配对结合的、富含嘌呤的3-9个核苷酸的共同序列，一般为AGGA，此序列称SD序列。它与核糖体小亚基内16S rRNA的3端一段富含嘧啶的序列 GAUCACCUCCUUA-OH互补，使得结合于30S亚基上的起始tRNA能正确地定位于mRNA的起始密码子AUG上。许多原核mRNA是多顺反子。转译时，各个基因都有自己的SD序列、起始密码子、终止密码子，分别控制其合成的起始与终止，也就是说，每个基因的翻译都是相对独立的。（2）真核生物mRNA的结构真核mRNA5端具有m7GpppN帽子结构，无SD序列。帽子结构具有参与翻译起始、增强翻译效率的作用。若起始AUG与帽子结构间的距离太近（小于12个核苷酸），就不能有效利用这个AUG，会从下游适当的AUG起始翻译。当距离在17-80个核苷酸之间时，离体翻译效率与距离成正比。真核生物mRNA的Poly（A）尾巴与mRNA的稳定性有关2、tRNA转运活化的氨基酸至mRNA模板上可以说tRNA是一个万能接头：（1）氨酰- tRNA合成酶的识别位点（结合氨酰tRNA合成酶）（2）3端-CCA上的氨基酸运载位点（结合氨基酸），（3）核糖体的识别位点（将氨基酸运送到目的地），（4）反密码子位点（配对mRNA，卸载氨基酸）3、核糖体是蛋白质合成的工厂标记各种a.a，注入大鼠体内，在不同时间取出肝脏，匀浆，离心分离各种亚细胞器，分析放射性蛋白的分布，发现蛋白质的合成是在核糖体上进行的。游离核糖体主要合成细胞质蛋白，内质网核糖体主要合成分泌蛋白和细胞器蛋白。不论原核细胞还是真核细胞，一条mRNA可以被同时几个核糖体阅读，把同时结合并翻译同一条mRNA的多个核糖体称为多核糖体。（三）蛋白质合成的一般过程1、氨基酸的活化和氨酰tRNA的合成活化和连接都发生在氨基酸的羧基上，其羧基与tRNA 3端的自由-OH形成氨酰酯键，从而形成氨酰tRNA，这是一个高能化合物，其能量足以形成肽键。氨基酸 + ATP氨酰tRNA合成酶/ Mg2+氨酰AMP-酶 + PPi氨酰AMP-酶tRNA氨酰tRNA + AMP + 酶2、专门的起始tRNAi启动蛋白质的合成原核生物的起始氨酰-tRNA的合成机制：Met-tRNAifMet甲酰化酶fMet-tRNAifMetMet-tRNAifMetMet + tRNAifMetMet-tRNA合成酶延伸氨酰-tRNA的合成机制：Met + tRNAMetMet-tRNA合成酶Met-tRNAMet真核生物的起始氨酰-tRNA的合成机制：Met + tRNAiMetMet-tRNA合成酶/起始因子子Met-tRNAiMet延伸氨酰-tRNA机制：Met + tRNAMetMet-tRNA合成酶/延伸因子Met-tRNAMet3、蛋白质合成的一般过程三个阶段：起始、延伸、终止。分别由不同的起始因子、延伸因子和终止因子（释放因子）参与。（1）翻译的起始：翻译是从形成起始复合物开始的，小亚基与mRNA结合，起始氨酰tRNAi进入P位点，它的反密码子与mRNA上的起始密码子AUG碱基配对。大亚基与小亚基结合形成起始复合物。（2）延伸过程：延伸方向：mRNA：5 3，新生肽：N C。肽链延伸分三步进行：新的氨酰tRNA进入核糖体的A位点；肽键形成（转肽）；核糖体移位。这三步构成了肽链延伸的一个循环。入位：第二个氨酰tRNA通过密码子反密码子的配对作用进入核糖体的A位点（氨基位点）。转肽：在大亚基上肽酰转移酶（peptidyl transferase）的作用下，A位点氨基酸的A-氨基亲核攻击P位点氨基酸的羧基基团并形成肽键，生成的二肽连在A位点的tRNA上，该过程称为转肽作用（transpeptidation），此时，P位点上卸载的tRNA从核糖体上离开。核糖体移位（translocation，也可称转位）：核糖体沿着mRNA向3方向移动1个密码子位置，携带肽链的肽酰-tRNA转移到P位点，A位点空出以便接纳下一个氨基酸。（3）翻译的终止由于终止密码子不能结合任何氨酰tRNA，于是肽链合成的终止因子（又称释放因子）识别并结合到终止密码子上，接着肽酰转移酶的酯化酶功能转变成水解功能，将肽链从P位点tRNA上水解掉，核糖体释放掉mRNA并解体成大小亚基，翻译结束。在翻译过程中除了核糖体大小亚基、 mRNA和氨酰tRNA外，还需要GTP和许多蛋白辅助因子。这些辅助因子有的起催化作用，有的起改变和稳定构象作用。4、蛋白质翻译后的加工形式翻译完成后，一些肽链能直接折叠成最终的活性形式，不需要加工修饰，然而经常的情况是新生肽链需要加工修饰（称为翻译后加工或翻译后修饰）包括：切除前体蛋白的部分肽段和N端的Met，在特定氨基酸残基的侧链上添加一些基团（共价修饰）、插入辅因子，还有些单肽要聚合成多亚基蛋白。翻译后加工有两方面目的：功能需要定向转运的需要（这在真核生物中尤为复杂，合成的蛋白要定向运输到细胞质、质膜、各种细胞器如叶绿体、线粒体、溶酶体、过氧化物酶体等）。（四）原核生物的蛋白质合成1、翻译起始在原核生物中需要三个起始因子参与：IF1，IF2，和IF3。IF1，IF2促进fMet-tRNAifmet、mRNA与30S小亚基的结合，IF3促进核糖体大小亚基分开。（1）IF3首先结合在30S亚基上，防止它过早地与50S亚基结合。（2）mRNA结合到30S亚基上。mRNA通过自身的SD序列与16S rRNA的3端配对结合而使它处于核糖体上的恰当的位置，SD序列与16S rRNA的配对还为识别起始密码子和Met密码子提供了一种机制。（3） IF1、IF2-GTP、fMet-tRNAifMet结合到30S亚基上，IF3离开，形成前起始复合物。IF2是一个GTP结合蛋白，它先与30S亚基结合并促使起始氨酰tRNA（ N甲酰甲硫氨酰tRNA，fMet-tRNAfmet ）的反密码子与mRNA 上的AUG结合（P位点）。（4）50S大亚基结合到30S小亚基上，IF1、IF2-GDP离开，形成起始复合物。GTP水解成GDP释放的能量引起30S亚基构象变化，50S亚基结合到30S亚基上，同时IF2和IF3释放。因此，原核生物肽链合成的起始复合体由mRNA、70S核糖体、fMet-tRNAifMet组成。2、延伸（1）新氨酰tRNA入位新的氨酰tRNA在延伸因子EF-Tu-GTP的帮助下进入核糖体的A位点。延伸因子EF-Tu是一个GTP结合蛋白，氨酰tRNA入位后，EF-Tu-GTP水解，EF-Tu-GDP从核糖体上释放下来，在第二个延伸因子EF-Ts帮助下EF-Tu-GDP释放掉GDP并重新结合一分子GTP再生成EF-Tu-GTP。（2）肽键形成（转肽，Transpeptidation）现在认为肽酰转移酶活性存在于50S亚基23S rRNA上。驱动肽键形成的能量由P位点上的氨基酸与它的tRNA的高能肽酰酯键供。嘌呤霉素抑制肽键形成，原因是它类似于氨酰-tRNA3上的AMP，形成肽酰嘌呤霉素，新生肽链延伸被迫终止。（3）核糖体移位（translocation）核糖体在移位需要另一个GTP结合蛋白EFG（延伸因子，又叫移位酶）的参与，现在认为，GTP水解成GDP时释放出的能量促使核糖体构象发生变化，驱动肽酰tRNA从位点移动到位点。3、终止原核生物有三个释放因子（RF-1, RF-2, RF-3）参与终止。RF1识别UAA和UAG，RF2识别UAA与UGA，RF3作用尚不清楚，可能促进RF1与RF2的活性。识别过程需要GTP，并改变了核糖体的构象，使肽酰转移酶的功能发生瞬时变化，转变成酯酶功能，将连接肽链与P位点tRNA的肽酰酯键水解开，肽链从核糖体上释放，mRNA与tRNA解离，核糖体解体。4、原核生物蛋白质合成中的能量计算ATPA（GTP）高能磷酸键甲酰-甲硫氨酰-tRNA合成ATP-AMP2起始（IF-2）GTP-GDP1第二个a.a-tRNA合成ATP-AMP2第二个a.a-tRNA进入核糖体（EF-TU）GTP-GDP1核糖体移位（EF-G）GTP-GDP1终止GTP-GDP1合成二肽需8个高能磷酸键，其后每加一个a.a需4个高能磷酸键，合成n个氨基酸的多肽总共需要4n个高能磷酸键。例如，合成200个a.a残基的多肽至少需要8+1984=800（4n=4200=800）个高能磷酸键。5、蛋白质合成的抑制剂尽管原核生物与真核生物在蛋白质合成方面有许多相似之处，但也存在差异，这些差异正是一些抗生素治疗和研究应用的基础。抗生素作用普遍抑制剂嘌呤霉素（puromycin）普遍抑制剂，类似氨酰-tRNA的3端，进入A位，产生未成熟肽链原核专一抑制剂氯霉素与原核50S亚基结合，竞争性抑制肽转移酶（氨基连接类似肽键）链霉素、新霉素、卡那霉素结合到原核30S亚基上引起读码错误，导致合成的多肽连一级结构改变四环素与原核30S亚基结合，干扰氨酰tRNA的结合红霉素干扰核糖体移位，抑制原核肽链延伸真核专一抑制剂放线菌酮（又环己酰亚胺，cycloheximide）抑制真核肽酰转移酶活性白喉毒素与eEF-2结合并共价修饰His，抑制真核的肽链移位作用6、原核生物的翻译后加工修饰一些新生肽链从核糖体上释放下来后可以直接折叠成最终的三维结构。但多数情况下是新生肽要经过一系列的加工修饰，才具有功能。（1）切除加工：包括去掉N端的甲酰甲硫氨酸和信号肽序列。信号肽（Signal peptide），也叫引导肽（leader peptide），是决定新生肽最终去向的一段序列，通常较短，典型情况下位于N端。在细菌中的一个例子就是多肽要插入细胞质膜必须借助信号肽序列。（2）糖基化：尽管在原核生物中，绝大多数的复合糖是糖酯，但是，也有少量的糖蛋白的报道，例如Halobacterium细胞表面的糖蛋白，有关原核生物糖基化的机制及其功能都还不知道。（3）甲基化：甲基转移酶利用硫酰苷甲硫氨酸对特定蛋白进行甲基化修饰。在大肠杆菌和有关细菌中发现的一种甲基转移酶能甲基化膜结合的化学受体蛋白的谷氨酸残基。这种甲基转移酶和另外一种甲基酯酶催化的甲基化/去甲基化过程在细菌趋化性的信号转导中起重要作用。（4）磷酸化：近年来，已经发现由蛋白激酶和蛋白磷酸化酶催化的蛋白质磷酸化/去磷酸化在原核生物中十分普遍。磷酸化/去磷酸化在细菌趋化性和氮代谢中有调控作用。7、原核生物的翻译调控蛋白质的合成是一个非常耗能的过程，其合成必然要受到严格的调控。原核细胞对蛋白质合成的调控主要发生在起始阶段。发现有以下几种方式：（1）原核生物中，蛋白质合成的调控多在转录的水平上（操纵子模型）进行。因为：（1）转录与翻译直接偶联，转录后不久就开始翻译，（2）原核生物mRNA的半衰期很短，大约13分钟，随着环境条件的改变，细胞内产生的mRNA种类会迅速改变。（2）mRNA翻译速率也是调控位点。翻译速率的调控大多是由于SD序列的差异造成翻译起始效率的不同。因为SD帮助识别AUG和启动翻译的起始，因此SD序列的变化能影响翻译的起始效率从而调控了mRNA的翻译速率。（3）相对过剩的蛋白质翻译产物对自身多顺反子mRNA翻译的负调控。多顺贩子mRNA的其中一个产物相对过剩时能抑制整个多顺贩子mRNA的翻译。原核的55种核糖体蛋白由20个操纵子编码。细菌的良好生长要求这些蛋白质的合成之间及其与rRNA的合成之间协调起来。例如PL11操纵子编码核糖体蛋白L1和L11，如果L1相对过剩就会占用了可利用的23SrRNA，结果抑制PL11mRNA的翻译。在23SrRNA缺乏的情况下，L1蛋白也会结合在PL11mRNA的5端抑制自身操纵子的翻译。（五）真核生物的蛋白质合成真核细胞的蛋白质翻译需要大量的蛋白因子，翻译后加工和定向输送比原核复杂得多。1、翻译起始真核的翻译起始比原核更复杂，因为：真核mRNA的二级结构更为多样和复杂。真核mRNA是经过多重加工的，它被转录后首先要经过各种加工才能从细胞核进入细胞质中，并形成各种各样的二级结构。一些mRNA与几种类型的蛋白质结合在一起形成一种复杂的颗粒状，有时称核糖核蛋白粒（ribonucleoprotein particle）,在翻译之前，它的二级结构必须改变，其中的蛋白质必须被去掉。核糖体需要扫描mRNA以寻找翻译起始位点。真核mRNA没有SD序列来帮助识别翻译起点，因此核糖体结合到mRNA的5端的帽子结构并向3端移动寻找翻译起点。这种扫描过程很复杂，知之甚少。真核翻译起始用到的起始因子（eIF）至少有9种 ，多数的功能仍需进步研究。eIF3的功能类似IF3，防止核糖体大小亚基过早结合，eIF2-GTP类似与IF2-GTP，促进起始aa-tRNA、mRNA与小亚基的结合，eIF4能识别并结合在mRNA的帽子结构上。起始复合物的形成过程：（1）40S小亚基-(eIF-3)结合到(eIF-2-GTP)-Met-tRNAi Met复合物上形成40S前起始复合物（40S preinitiation complex）。这里，eIF-2-GTP介导了起始tRNA与40S小亚基的结合，然后eIF-2-GDP通过eIF-2B（鸟苷酸释放蛋白）再生。此时，由于eIF-3和40S小亚基相结合，eIF-6和60S大亚基相结合，所以小亚基暂时还不能与大亚基相结合。（2） 40S前起始复合物结合到mRNA5端形成40S起始复合物。消耗1个ATP。该过程需要ATP，另外还需要一些起始因子（eIF-4A、eIF-4B、eIF-4F、eIF-1）。eIF-4F能识别并结合在mRNA5端的帽子结构上，eIF-4A（一种ATPase）和eIF-4B（一种helicase）改变mRNA的二级结构。（3）40S起始复合物向3端移动扫描mRNA寻找适当的起始密码子（通常是5端附近的AUG），直到Met-tRNAiMet与之配对。除酵母外的高等真核生物：GCCGCCpurCCAUGG（4） 60S大亚基与40S复合物结合形成80S起始复合物，eIF2-GDP、eIF3离开此时，60S大亚基上的eIF-6已经被释放。在形成复合物过程中，在eIF-5参与下，eIF-2-GTP水解成eIF-2-GDP。eIF-2，eIF-3，eIF-4A，eIF-4B，eIF-4F，eIF-1从起始复合物上释放。2、延伸（1）入位真核生物入位需要延伸因子为EF-1，它是多亚基蛋白，同时具有EF-Tu、EF-Ts的功能。50kD的延伸因子eEF-1-GTP与aa-tRNA结合，引导aa-tRNA进入A位点后，eEF-1-GTP水解，随后eEF-1-GDP离开核糖体，在eEF-1、eEF-1的帮助下，eEF-1-GDP再生为eEF-1-GTP。在真菌（如酵母）中，需要另一个延伸因子eEF-3与eEF-1共同引导aa-tRNA的入位。（2）肽键形成（转肽）核糖体大亚基的肽酰转移酶活性催化A位点-氨基亲核攻击P位点的aa的羧基，在A位点形成一个新的肽键。P位点上卸载的tRNA从核糖体上离开（3）核糖体移位移位需要一个100kD的延伸因子eEF-2-GTP。eEF-2-GTP结合在核糖体未知的位置上，GTP水解成释放的能量使核糖体沿mRNA移动一个密码子的位置，然后eEF-2-GDP离开核糖体。3、终止真核细胞中有两个释放因子eRF-1和eRF-3（GTP结合蛋白）介导终止。当GTP结合到eRF-3后它的GTPase活性就被激活，eRF-1和eRF-3-GTP形成一个复合物，当UAG，UGA，UAA进入A位点时，该复合物就结合到A位点上，接着GTP水解促使释放因子离开核糖体，mRNA被释放，核糖体解体成大小亚基，新生肽在肽酰转移酶催化下被释放。4、真核生物蛋白质合成中的最低能量计算ATP（GTP）高能磷酸键甲硫氨酰-tRNA合成ATP-AMP2起始（IF-2）GTP-GDP2第二个a.a-tRNA合成ATP-ADP2第二个a.a-tRNA进入核糖体（eEF-1 -GTP）ATP-AMP1核糖体移位（eEF-2-GTP）GTP-GDP1终止（eRF-3-GTP）GTP-GDP1合成二肽需9个高能磷酸键，其后每加一个a.a需4个高能磷酸键，合成n个氨基酸的多肽最低需要4n+1个高能磷酸键。例如合成200个a.a残基的多肽至少需要9+1984=801（4n+1=4200+1=801）个高能磷酸键5、真核生物的翻译后加工许多真核生物的新生肽都要经过翻译后加工或修饰，这种加工修饰可以发生正延伸着的肽链中和翻译后。（1）切除加工典型的情况包括切除N-端甲硫氨酸、信号肽序列和切除部分肽段将无活性的前体转变成活性形式。一些酶的前体（称为前体酶proenzyme，或酶原zymegen）或无活性的多肽前体（称为前体蛋白，proprotein）只有切除特定的肽段后才能从无活性形式转变成活性形式。（2）糖基化真核生物中糖基化修饰很普遍。通常情况下，分泌蛋白的寡糖链较复杂，而内质网膜蛋白含有较高的甘露糖。（3）羟基化在结缔组织的胶原蛋白和弹性蛋白中pro和lys是经过羟基化的。此外，在乙酰胆碱酯酶（降解神经递质乙酰胆碱）和补体系统（参与免疫反应的一系列血清蛋白）都发现有4-羟辅氨酸。（4）磷酸化蛋白磷酸化参与代谢调控和信号转导以及蛋白与蛋白之间的相互作用。（5）亲脂修饰最常见的亲脂修饰是酰化和异戊二烯化。豆蔻酰化却是最常见的酰化形式之一。蛋白质亲脂修饰后可以改变膜结合能力和特定的蛋白与蛋白之间的相互作用。（6）甲基化通过甲基转移酶进行。在2，3-二磷酸核酮糖羧化酶（rihilose-2,3-biosphosphate carboxylase）、钙调蛋白（calmodulin）、组氨酸（histone）、某些核糖体蛋白和细胞色素C中都有甲基化的赖氨酸残基。（7）二硫键形成二硫键通常只发现于分泌蛋白（如胰岛素）和某些膜蛋白中，在细胞质中由于有各种还原性物质（如谷胱甘肽glutathione和硫氧还蛋白thioredoxin）所以细胞质蛋白没有二硫键。因为内质网腔是一个非还原性环境，所以粗糙内质网上的新生肽只暂时形成二硫键。当新生肽进入内质网腔时，一些肽链可能会按氨基酸次序依次暂时形成二硫键，但最终会通过交换二硫键位置的形式形成正确的结构，内质网中可能还有一种二硫键异构酶（disulfide isomerase）催化该过程。6、真核生物的翻译调控真核细胞对蛋白质合成的调控。比原核广泛，发现有以下几个层次, （1）mRNA向细胞质的运输核膜创造的转录与翻译的隔离为基因的表达提供了一个重要的调控机会。mRNA向细胞质的运输是一个受到严格控制的过程，至少需要mRNA5端的帽子和3端的poly A尾巴。mRNA的选择性剪接也是一种调控环节。（2）mRNA的稳定性mRNA 的半衰期从20分钟到24小时。在mRNA上有一些去稳定序列（destablization sequence）,它们的二级结构是核酸酶的底物，也有些稳定序列（stablization sequence）。特定蛋白与mRNA上特定序列的结合能影响它的稳定性。3端的腺苷化和去腺苷化会影响它的稳定性和翻译活性。在核中，mRNA被加工后运输到细胞质时含有100200个polyA尾巴，当polyA缩减到30个以下时整个mRNA就会被降解。在特定条件下polyA能被选择型地延长或缩短。（3）翻译的负调控一些阻遏蛋白能结合在特定mRNA的5端阻止翻译的进行，如铁蛋白的合成。铁蛋白是储铁的蛋白，主要发现于肝细胞中。铁蛋白mRNA上有铁应答元件（IRE），阻遏蛋白可以结合在上边，当细胞中铁浓度高时，那么大量的铁原子就结合到阻遏蛋白上，使它从IRE上解离，铁蛋白mRNA就可以被翻译。（4）起始因子磷酸化。网织红细胞中血红素缺乏，激活血红素控制抑制剂（HCI），使eIF2磷酸化，eIF2和eIF2B解离，不能起始翻译。当遭遇热休克、病毒感染、生长因子缺乏等逆境时，真核细胞eIF-2就发生磷酸化，大部分蛋白质的合成降低，而一些hsp和其它蛋白的翻译增强，以应付热休克和其他胁迫条件，但其机理还不清楚。（六）蛋白质合成后的转运由于真核细胞的结构和功能很复杂，所以蛋白质合成后的定向转运（targeting, translocation）的机制也很复杂。需要新生肽的信号序列（signal peptide）或导肽序列（leader seqnence）和分子伴侣（chaperonins），其作用是保持新生肽链的未折叠状态和导引该肽到细胞器膜上的受体位置。多肽的两种转运机制：1、翻译转运同步机制（cotranslational transfer）分泌蛋白、质膜蛋白、溶酶体蛋白、内质网和高尔基体滞留蛋白等。首先在游离核糖体上合成含信号肽的部分肽段后就结合到内质网上，然后边合成边进入内质网腔，经初步加工和修饰后，部分多肽以芽泡形式被运往高尔基体，再经进一步的加工和修饰后被运往质膜、溶酶体或被分泌到胞外。具体过程：（1）内质网（RER）上合成的蛋白质的定位与加工结合在细胞质mRNA上的核糖体合成N端疏水的信号序列信号识别颗粒（SRP）与信号序列结合，翻译暂停，以待SRP与RER膜上的坞蛋白（docking protein）结合（SRP：核蛋白复合体，含有几种蛋白质和一分子小RNA）坞蛋白结合核糖体，结果核糖体结合到了RER上。dSRP释放，翻译重新开始，进入实质性翻译过程翻译将完成时，需运送的新生肽链将由内质网膜结合的蛋白酶切去信号序列，释放到内腔，将留在内质网的蛋白质则保留信号序列。（2）高尔基体的作用通过RER出芽方式将RER腔中初步糖基化的蛋白质装入囊泡携带蛋白质的囊泡到达高尔基体顺面，与高尔基体膜融合，蛋白质进入膜内。在高尔基体完成糖基化，高尔基体的多层膜囊有利于分选。高尔基体反面出芽，将糖基化蛋白质装入囊泡，产生溶酶体、过氧化物体、乙醛酸体或到细胞膜。2、翻译后转运机制（posttranslational translocation）叶绿体蛋白和线粒体蛋白在细胞质游离核糖体上被完全合成后通过新生肽的信号序列（引导肽Leader peptide）直接运往目的地并被加工。（七）蛋白质的折叠近年来，已经确定，生活细胞中蛋白质的折叠和转运是在分子伴侣的帮助下进行的。其中大部分是hsp。它存在于所有的生物中，从细菌到高等动植物已发现了几种类型的分子伴侣。此外，它们还存在于原核性质的细胞器中，如线粒体、叶绿体和内质网。到目前为止发现所有的分子伴侣在序列同源性上都很高。分子伴侣在蛋白折叠方面的作用表现在两方面：（1）从多肽开始合成到折叠的这段时间里，分子伴侣可以保护多肽链不受其他蛋白的攻击，一些线粒体和叶绿体蛋白在插入细胞器膜之前必须保持未折叠状态。（2）帮助蛋白质正确快速地折叠或组装成多亚基蛋白。在蛋白质折叠中有两类分子伴侣：（1）Hsp70s。Hsp70s是在折叠的早期阶段起作用的分子伴侣家族。大量的Hsp70s。大量的Hsp70s单体结合在未折叠的疏水的正延伸肽段上。每一个Hsp70s有两个结合位点：未折叠多肽结合位点和ATP结合位点。多肽从Hsp70s上释放需要能量。内质网的Hsp70s还是多肽跨膜转运所必须的。（2）Hsp60s。一旦未折叠的多肽从Hsp70s上被释放，它就结合到一些Hsp60s上（也称chaparonins,cpn60s）。Hsp60s形成一个巨大的桶状结构，它有两个盖，位折叠蛋白进入桶中，Hsp60s帮助它形成正确的结构。分子伴侣还能帮助因各种胁迫而部分去折叠蛋白的重新折叠，如果不能重新折叠的话，分子伴侣就促进它的降解。（八）蛋白质的生命周期蛋白质的的半寿期不仅与其合成有关，还与它的选择性降解有关，真核细胞中蛋白质的选择性降解有两条途径：1、不依赖ATP的溶酶体途径，没有选择性，主要降解外源蛋白、膜蛋白及长寿命的细胞内蛋白。2、依赖ATP的泛素途径，在胞质中进行，主要降解异常蛋白和短寿命蛋白，此途径在不含溶酶体的红细胞中尤为重要。泛素是一种8.5KD（76a.a.残基）的小分子蛋白质，普遍存在于真核细胞内。一级结构高度保守，酵母与人只相差3个a.a残基，它能与被降解的蛋白质共价结合，使后者活化，然后被蛋白酶体（proteasomes）降解。三、 重点、难点重点：遗传密码，遗传密码的特点; 蛋白质生物合成中的生物大分子结构及其作用，mRNA，rRNA，核糖体，辅助因子; 蛋白质生物合成的一般过程，原核生物与真核生物蛋白质合成的异同，常用的原核型与真核型蛋白质合成抑制剂; 多肽合成后的定向输送与加工，信号肽及信号肽的识别，内质网上多肽的糖基化修饰，高尔基体中多肽的糖基化修饰及多肽的分捡，线粒体、叶绿体蛋白质的来源。难点：蛋白质合成的一般过程以及参与蛋白质合成的各种大分子（包括翻译因子）的结构与功能，蛋白质合成后的加工形式与转运机制.四、典型例题解析例题15-1：细胞内至少要有几种tRNA才能识别64个密码子？解：当遗传密码破译后，由于有61个密码子编码氨基酸，于是人们预测细胞内有61种，但事实上绝大多数细胞内只有50种左右，Crick也正是在这种情况下提出了摇摆假说并合理解释了这种情况。根据摇摆性和61个密码子，经过仔细计算，要翻译61个密码子至少需要31种tRNA，外加1个起始tRNA，共需32种。但是，在叶绿体和线粒体内，由于基因组很小用到的密码子少，因此叶绿体内有30种左右tRNAs，线粒体只有24种。例题15-2：有一段mRNA编码Met-Thr-Phe-Ile-Trp，用一种化学试剂使这段mRNA发生单一碱基的缺失突变，结果肽链变为：Met-Pro-Ser-Tyr-Gly，请分析：（1） 缺失发生在哪一个密码子中（2） 缺失的是哪一个碱基（3） 野生型mRNA的碱基序列是怎样的？解：（1）突变后从Thr开始，氨基酸顺序不同于野生型，说明，缺失突变发生在第二个密码子-Thr密码子上。（2）根据氨基酸的序列，可以排除mRNA的所有可能的序列：野生型肽链的序列：野生型mRNA的序列：Met- Thr- Phe- Ile- TrpAUG- ACU- UUU- AUU- UGGC C CA AG突变后：Met- Pro- Ser- Tyr- GlyAUG- CCU- UCU- UAU- GGUC C C CA A AG G G通过比较，不难发现，缺失的是第四个碱基A，即Thr密码子的第一位碱基（3）由于缺失突变会造成移码突变，野生型mRNA的序列为：AUG-ACC-UUC-AUA-UGG例题15-3：用一种化学诱变剂处理某种单链RNA病毒，得到两种突变体，它们合成的某种蛋白质中分别用Ser和Leu取代了野生型中的Pro。继续用这种诱变剂处理这些突变体，同一位置的氨基酸残基都变为Phe。推测（1） 病毒中编码这4种氨基酸的密码子，（2） 这种诱变剂的诱变机制是什么？解：（1）两次诱变的结果可以表示为：ProPheLeuSer在这4中氨基酸中，Pro有4个密码子，Ser和Leu各有6个密码子，Phe有2个密码子。化学诱变剂处理一般都是脱氨基/氨基化，脱甲基/甲基化，处理一次发生单碱基的突变，因此，每次变化前后的密码子只有一个碱基发生改变，据此可以分析出病毒中编码这些氨基酸的密码子为：Pro（CCU）Phe（UUU）Leu（CUU）Ser（UCU）或Pro（CCC）Phe（UUC）Leu（CUC）Ser（UCC）例题15-4：除了存在与AUG相对应的反密码子以外，蛋氨酰-tRNA有特殊的性质可满足翻译的起始阶段的需求吗？解：是的。蛋氨酸有两个tRNA，这两类tRNA可依据当它们负荷蛋氨酸时被转甲酰酶甲酰化的能力加以区别。这两类被称为：tRNAfMet和tRNAMet。前者可被甲酰化生成N-甲酰基Met-tRNA(或缩写为fMet-tRNA)并且特异地与多肽链的起始有关。可以推测，此种情况中，RNA结构的独特性质是起始过程所必需。例题15-5 氯霉素在作为抗生素治疗动物的细菌感染时有副作用。其原因何在？解： 氯霉素通过抑制核糖体大亚单位肽基转移酶可阻断细菌的翻译过程。它不妨碍真核生物核糖体大亚单位的肽基转移酶。然而，动物细胞线粒体中的核糖体与细菌核糖体相似，氯霉素可阻断该细胞器的蛋白质合成。这是该药物用于动物治疗时副作用产生的原因。例15-6:为什么在细菌和真核生物中嘌呤霉素均可作为翻译抑制剂发挥其作用？解：嘌呤霉素与氨基酰-tRNA的3端的结构相似（特别是苯丙氨酰-tRNA），在翻译过程中嘌呤霉素与其竞争。在所有生物中，氨基酰-tRNA的3端的结构是相同的。例15-7:mRNA遗传密码排列顺序翻译成多肽链的氨基酸排列顺序，保证准确翻译的关键是什么?解：保证翻译准确性的关键有二：一是氨基酸与tRNA的特异结合，依靠氨酰tRNA合成酶的特异识别作用实现；二是密码子与反密码子的特异结合，依靠互补碱基配对结合实现，也有赖于核蛋白体的构象正常而实现正常的装配功能。例15-7:为什么m7GTP能够抑制真核细胞的蛋白质合成，但不抑制原核细胞的蛋白质合成?相反人工合成的SD序列能够抑制原核细胞的蛋白质合成，但不抑制真核细胞的蛋白质合成?解：m7GTP之所以能够抑制真核细胞的蛋白质合成是因为它是真核细胞mRNA的5帽子结构的类似物，能够竞争性地结合真核细胞蛋白质合成起始阶段所必需的帽子结合蛋白(一种特殊的起始因子)。原核细胞mRNA的5端没有帽子结构，因此m7GTP不会影响到它翻译的起始。SD序列是存在于原核细胞mRNA的5端非编码区的一段富含嘌呤碱基的序列，它能够与核糖体小亚基上的16SrRNA的3端的反SD序列通过互补结合，这种结合对原核细胞翻译过程中起始密码子的识别非常重要，将人工合成的SD序列加到翻译体系中，必然会干扰到mRNA所固有的SD序列与16SrRNA的反SD序列的相互作用，从而竞争性抑制原核细胞蛋白质合成的起始。例15-8:尽管蛋白质的水解在热力学上是有利的，但是由泛素介导的蛋白质选择性降解却需要消耗ATP。试解释ATP对于这种形式的降解为什么是必需的。解：由泛素介导的蛋白质定向水解不同于消化道内发生的蛋白质的非特异性降解，它需要存在一种识别机制以识别将要被水解的蛋白质，为了保证在识别过程中不发生错误，也许还存在一种校对机制。正像其他的校对事件，如DNA复制过程中的校对以及氨酰-tRNA合成酶在氨基酸活化反应中的校对等，都是以消耗能量为代价的。因此在泛素介导的蛋白质降解之中，消耗ATP可能有利于识别过程的高度忠实性。例15-9:简述原核细胞与真核细胞(细胞质)的蛋白质生物合成的主要区别。如果要在原核细胞中高效表达真核细胞的基因，需要注意什么?解：原核生物的蛋白质合成与真核生物的蛋白质合成的主要差别表现在以下几个方面：（1） 起始AA：原核生物是fMet，真核生物是Met（2） 核糖体：原核生物是70S(30S+50S)，真核生物是80S(40S+60S)（3） 抑制剂的敏感性：原核受抗菌素药物抑制，真核不受抗菌素药物抑制（4） 原核生物翻译与转录是偶联的，而真核生物不存在这种偶联关系。（5） 原核生物的起始tRNA经历甲酰化反应，形成甲酰甲硫氨酰-tRNA，真核生物则不。（6） 采取完全不同的机制识别起始密码子，原核生物依赖于SD序列，真核生物依赖于帽子结构。（7） 原核生物的mRNA与核糖体小亚基的结合先于起始tRNA与小亚基的结合，而真核生物的起始tRNA与核糖体小亚基的结合先于mRNA与小亚基的结合。（8） 在原核生物蛋白质合成的起始阶段，不需要消耗ATP，但真核生物需要消耗ATP。（9） 参与真核生物蛋白质合成起始阶段的起始因子比原核复杂，释放因子则相对简单。（10） 原核生物与真核生物在密码子的偏爱性上有所不同。要想在原核系统之中高效地表达真核生物的基因必须注意以下几点： 对于含有内含子的基因不能直接从基因组中获取，可以通过人工合成的方法或者从cDNA库中获取。 需要在真核生物基因的上游加入SD序列。 使用原核生物强的启动子。 如果是人工合成某一蛋白质的基因,需要考虑原核生物对密码子的偏爱性。例15-10:写出六种已知的蛋白质肽链生物合成后的共价修饰方式并简述其生物学意义。解：(1)糖基化，影响肽链的折叠，以及蛋白质的分泌和定位。(2)磷酸化，对信号转导的调控。(3)甲基化，影响组蛋白等蛋白质和其它所谓分子的相互作用。(4)羟化。某些蛋白质中的脯氨酸和赖氨酸经羟化后，可以进一步糖基化。(5)乙酰化，防止肽链降解。(6)酰化，一些蛋白质中的甘氨酸、半胱氨酸被豆蔻酰化或棕榈化，可有利于和质膜的结合。 (7)谷氨酸的羧化，可在一些凝血因子等蛋白质中引进钙离子结合位点。(8)酪氨酸的碘化，这反应发生在甲状腺球蛋白上，导致甲状腺素的形成。(9)遍在蛋白化，作用细胞内一些短周转蛋白降解的信号。(10)ADP核糖化。调节一些酶的生物活性。应该注意的是，肽链中一些残基侧链的共价修饰，有的发生在蛋白质的成熟过程中，有的则发生在蛋白质成熟以后。在体内起到调控作用的化学修饰，多数属于后者。例15-11:在大肠杆菌细胞中从mRNA和游离的氨基酸开始翻译1分子76肽需要彻底氧化分解多少分子的葡萄糖以提供所需要的ATP?如果在厌氧细菌内合成同样的多肽，则至少需要消耗多少分子的葡萄糖?解：合成1分子76肽大约需要消耗764=304分子的ATP，而1分子葡萄糖在细菌体内彻底氧化可产生32分子的ATP，因此合成1分子76肽，需要彻底氧化304/32=10分子的葡萄糖。在厌氧细菌内，1分子葡萄糖最多能够产生2分子的ATP(通过糖酵解)，因此合成同样的多肽需要消耗304/2=152分子的葡萄糖。例15-12:蛋白质定向(targeting)和分检(sorting)到内质网与到线粒体在机制上有哪些主要的差别?解：主要差别有：(1)前者的转运是一个共翻译的过程，而后者是在翻译完成后进行的。此外，信号肽的特征也不同，前者富含疏水氨基酸，而后者富含Ser/Thr并间隔含有碱性氨基酸。(2)前者需要信号识别颗粒(SRP)，后者不需要。(3)前者在停靠在内质网膜上是需要消耗GTP，而后者进入线粒体需要膜电位。例15-13:尽管IF-2，EF-Tu，EF-G和RF-3在蛋白质合成中的作用显著不同，然而这四种蛋白质都有一个氨基酸序列十分相似的结构域。你估计此结构域的功能会是什么?解：这四种蛋白质都能够结合GTP，并且有GTPase的活性，因而都属于G蛋白超家族的成员。它们参与结合GTP的结构域在氨基酸序列上具有很大的相似性应不难理解。五、单元自测题（一）、名词解释1、 无细胞翻译系统2、 密码子(codon)3、 摆动配对(wobblepairing)4、 核糖体循环(ribosomecycle)5、 多核糖体(polyribosome)6、 操纵子(operon)7、 顺式作用元件(cis element)8、 反式作用因子(trans factor)9、 锌指(zincfinger)10、 亮氨酸拉链(1eudnezipper)11、 螺旋环螺旋(helix-loop-helix)12、 跳跃翻译(jump translation) 13、 蛋白质内含子（二）填空题1、在64个密码子中，终止密码子是 、 、 ，编码Met兼作翻译起始信号的密码子是 ，编码Trp的密码子是 。2、反密码子第 位碱基和密码子第 碱基的配对允许有一定的摆动，称为变偶3、在原核细胞翻译起始时，小亚基16SrRNA的3端与mRNA5端的 之间互补配对，确定读码框架，fMet-tRNAf占据核糖体的 位置，4、在肽链延伸时，由核糖体大亚基的 酶催化核糖体P位置的 与A位置的 形成肽键。5、每一次延伸循环掺入一个氨基酸的同时，消耗 分子的GTP，核糖体沿 的方向解读mRNA的编码序列，肽链从 延伸，直到A位置出现终止密码子时， 结合到核糖体上，新生的肽链被释放。6、在真核细胞中，已合成的蛋白质通过内质网膜运输时有 、 、 和 等参与了识别和运送作用。7、内质网膜表面附着的大量核糖体是 的场所，内质网膜腔内是 的场所。高尔基体的重要功能是 和 。8、蛋白质磷酸化是可逆的。蛋白质磷酸化时，需要 酶，而蛋白质去磷酸化需要 酶。9、在蛋白质的生物合成中，需要起始tRNA，在原核中为 ，在真核中为 ，最后合成的蛋白质N端不含有甲硫氨酸，因为 。10、肽基转移酶在蛋白质生物合成中的作用是 。11、氨酰合成酶在和Mg+存在下选择正确的氨基酸加到tRNA的3末端，使之氨酰化的过程，取决于 。12、蛋白质生物合成过程中，核糖体内需能步骤都与 水解为 和无机磷有关。13、为保证蛋白质合成的正确性，氨酰tRNA合成酶除了对特定氨基酸有很强 之外，还能对“错误