学习情景十药物的浓缩精品教案.doc

学习情景十 药物的浓缩课程目标及学习内容学习目标知识目标1.了解生物药物浓缩的基本原理；2.熟悉结晶、冷冻浓缩和膜浓缩过程及设备；3.掌握结晶、冷冻浓缩和膜浓缩工艺参数的调节方法。技能目标1.学会结晶、超滤和透析浓缩生物药物的操作规程；2.熟练应用结晶、超滤和透析进行生物药物浓缩操作。学习内容理论知识点1.结晶、冷冻浓缩和膜浓缩基本原理；2.结晶的方法和影响因素；3.膜浓缩原理及影响因素。学习方法建议项目引领纲要案例分析总结现场模仿操作头脑风暴讨论工作任务1.赖氨酸的结晶浓缩；2.超滤浓缩溶菌酶稀溶液；3.透析袋浓缩容菌酶。小组讨论设计工厂参观实习总结报告书写重点结晶、透析操作规程建议学时9难点浓缩工艺参数的选择和调节子学习情景一 结晶浓缩【任务引出】氨基酸、蛋白质、多糖等物质在纯度达到一定程度时会结晶而从溶液中沉淀下来，从而得到浓缩。在药物生产过程中有许多药物都能通过结晶浓缩。结晶既是药物浓缩的过程，也是药物与杂质分离的过程。结晶技术在药物生产过程中广为应用。【基本知识】一、结晶基本知识1.什么叫结晶液态（溶液或溶融状态）或气态中的物质，其原子、离子或分子按一定的空间次序规则排列而形成固体的过程叫结晶。生成的固体叫晶体。早在5000多年前，人们已开始利用太阳能蒸发浓缩海水制取食盐。现在结晶已发展成为从不纯的溶液里制取纯净固体产品的经济而有效的操作。许多化工产品（如染料、涂料、医药品及各种盐类等）都可用结晶法制取，得到的晶体产品不仅有一定纯度，而且外形美观，便于包装、运输、贮存和应用。2.结晶的过程当溶质在溶液中溶解和沉积达到饱和后，溶质扩散到溶剂中的速度等于溶剂中的溶质沉积形成固体的速度，此时扩散和沉积达成动态平衡。如改变条件，例如减少溶剂，则表现出溶质大量沉积在固体表面上，直到溶液中溶质浓度降低到一定数值后，再一次达到新的溶解和沉积平衡。晶体结构模型当溶解和沉积平衡被打破，产生固体沉淀现象时，最先产生的微小颗粒称为晶核，晶核在溶剂中有较大的溶解度，如果溶液中溶质浓度小不饱和，生成的晶核将会溶解。只有溶液是过饱和溶液时晶核才会稳定，其余溶质才会在晶体核上沉积，晶体才会生长。所以，结晶过程分为过饱和溶液的形成、生成晶核、晶体生长三个阶段。（1）饱和溶液的形成可采取四种办法制备饱和溶液。饱和溶液的冷却：溶质的溶解度随温度升高而增大，随温度降低而减小。加热制成饱和溶液，然后降温，则形成过饱和溶液。蒸发部分溶剂：将饱和溶液中的溶剂移出后即成过饱和溶液。移出饱和溶液中溶剂的方法有加热蒸发、减压真空蒸发。此法应用于温度变化对溶解度影响不大的场合。化学反应结晶：加入化学试剂或调节溶液PH值，使溶质发生反应生成新的溶解度更小的化合物，从而形成过饱和溶液。解析法：向溶液中加入抗溶剂或沉淀剂，使溶质的溶解度降低，形成饱和溶液的过程。抗溶剂或沉淀剂可以是固体、液体或气体。抗溶剂本身溶解度大，因占用了大量的溶剂是原来溶质成为过饱和溶液。解析法所使用的抗溶剂常用氯化钠、甲醇、乙醇、丙酮等。加入氯化钠结晶的方法叫盐析结晶法，加入有机溶剂结晶的方法叫有机溶剂结晶法。也可通入氮气进行结晶。（2）晶核的形成晶体的生长是在晶核上完成的。单位时间单位体积内溶液中生成新晶核的数量称为成核速度。成核速度是决定晶体产品颗粒度分布 的重要因素。成核速度过大生成的晶体就小，成核速度过小，生产效率不高。要形成高质量晶体药物一定要控制好成核速度。影响成核速度的因素有：过饱和度：过饱和度越高成纥速度越快，当过饱和度达到一定值后，成核速度反而降低。温度的影响：温度越高成核速度越快，当超过某一特定温度后反而降低。溶质性质的影响：溶质本身性质是决定成核速度的关键。可采用诱导法加快晶体核形成速度。晶核诱导法是采用加入晶种的办法。自然形成晶核的机会不是很大，加入晶种能诱导晶核的形成。同种物质、相同晶形的物质、惰性无定形物质都可以作为晶种物质使用。对于蛋白质或酶，加入某些金属离子才能形成晶核。（3）晶体的生长在过饱和溶液中形成晶核后，随时间延长晶核或晶种逐渐张大，这个过程叫晶体的生长。伴随晶体的生长新的晶核在不断地形成，如果晶核生长速度大于晶体生长速度，得到的是微小的晶体或无定形沉淀，如果晶体生长速度大于晶核生长速度得到的是粗大均匀的晶体，工业上希望得到粗大均匀的晶体，便于后续过滤、洗涤和干燥操作。影响晶体生长的因素有杂质、搅拌速度、温度和过饱和度等。杂质的存在会影响晶体生长速度和晶体形，也会影响晶体的纯度；搅拌促进扩散，加速晶核的形提高晶体生长速度，但要防止晶族的形成；温度升高有利于扩散，使结晶速度加快，过饱和度增高使结晶速度增大，但同时引起黏度增加，结晶速度降低。二、结晶过程控制条件1.溶液浓度要形成过饱和溶液，生物大分子的质量分数控制在3%5%比较适宜，小分子如氨基酸可适当提高。2.样品纯度多数生物大分子需要相当的纯度才会结晶，因杂质的存在是结晶物质分子规则化排列的空间障碍。一般地说，纯度越高越容易结晶，结晶母液浓度接近或超过50%。3.溶剂溶剂对结晶影响严重，需要通过试验选择合适的溶剂。选择适宜的溶剂时应注意以下几个问题：（1）选择的溶剂应不与欲纯化的化学试剂发生化学反应。例如脂肪族卤代烃类化合物不宜用作碱性化合物结晶和重结晶的溶剂；醇类化合物不宜用作酯类化合物结晶和重结晶的溶剂，也不宜用作氨基酸盐酸盐结晶和重结晶的溶剂。（2）选择的溶剂对欲纯化的化学试剂在热时应具有较大的溶解能力，而在较低温度时对欲纯化的化学试剂的溶解能力大大减小。（3）选择的溶剂对欲纯化的化学试剂中可能存在的杂质或是溶解度甚大，在欲纯化的化学试剂结晶和重结晶时留在母液中，在结晶和重结晶时不随晶体一同析出；或是溶解度甚小，在欲纯化的化学试剂加热溶解时，很少在热溶剂溶解，在热过滤时被除去。（4）选择的溶剂沸点不宜太高，以免该溶剂在结晶和重结晶时附着在晶体表面不容易除尽。4.PH 蛋白质等两性物质在等电点附近容易结晶。5.温度生物药物一般都是热敏性物质，一般要求在较低的温度下进行，可选择在020范围，有些还可以选择在更低的温度下进行。通过降温结晶时，降温速度越快晶体越小，降温慢则结晶颗粒比较大。6.时间蛋白质等生物大分子立体结构复杂，其结晶过程比较困难，因而需要较长的时间才能结晶。生物大分子的结晶时间差别很大，有的只要数小时，有的需要数天甚至数月才能完成。结晶罐三、结晶方法1.盐析法主要用于生物大分子如蛋白质、酶、多肽等物质的结晶。（1）加硫酸铵固体盐（2）加硫酸铵饱和溶液（3）透析结晶2.有机溶剂结晶法一般用于生物小分子的结晶。（1）有机溶剂沉淀结晶法（2）挥发性有机溶剂法3.等电点法调节等电点结晶4.其他方法（1）温度差 （2）加入金属离子四、结晶操作过程 1.制过饱和溶液 2.调节PH值 3.加晶种 4.过滤、洗涤、干燥、称量。【实践活动】工作任务赖氨酸的结晶浓缩完成方式工作进程工作项目需要完成的活动内容查阅资料图书资料摘要：独立进行文献资料摘要：现场测试项目指标PH赖氨酸浓度溶剂用量温度参数 样品量小组合作实测结果分析计划指标含义赖氨酸的回收率小组讨论工艺参数样品体积加热温度低温温度PH值搅拌速度器材型号沉淀罐型号制定方案工艺路线小组讨论填写器材选型实施步骤检查方法人员分工组长职责小组讨论填写工艺员职责质检员职责实施过程小组讨论的方案，进入实训室逐步实施，取得相关数据和产品。小组合作项目指标溶剂用量晶体质量晶体形状回收率小组合作实测结果小组自评小组合作子学习情景二 超滤浓缩法【任务引出】因生物药品对热敏感，为保持其生物活性，浓缩时，一般不会采用加热蒸发移除溶剂的方法。可以采用超滤或透析法浓缩。【基本知识】一、超滤膜及性能基本知识 （参见学习情景超滤切割生物大分子）二、超滤设备的型号选择（参见学习情景超滤切割生物大分子）三、超滤操作过程与维护注意事项（参见学习情景超滤切割生物大分子）【大家做】工作任务超滤浓缩溶菌酶稀溶液完成方式工作进程工作项目需要完成的活动内容查阅资料图书资料摘要：独立进行文献资料摘要：现场测试项目指标色泽密度黏度浊度PH值小组合作实测结果分析计划指标含义溶菌酶的浓缩倍数小组讨论工艺参数样品体积膜面积样品流量压力膜孔径器材型号卷式超滤膜超滤器型号制定方案工艺路线小组讨论填写器材选型实施步骤检查方法人员分工组长职责小组讨论填写工艺员职责质检员职责实施过程小组讨论的方案，进入实训室逐步实施，取得相关数据和产品。小组合作检查效果项目指标PH值压力样品体积滤过液体积浓缩倍数小组合作实测结果小组自评小组合作子学习情景三 透析浓缩【任务引出】透析袋的截留分子量与超滤膜类似，不过透析袋规格小，使用方便，所以在处理样品量不大时，可以用透析袋代替超滤膜进行生物药物稀溶液的浓缩。【基本知识】一、透析袋基本知识1.透析通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。2.透析袋透析袋是完成透析操作的工具，是用半透膜制成的圆桶状口袋。透析袋的规格参数有直径，截留分子量。透析袋直径不是很大，一般为10 mm100 mm，长度可任意剪切。透析袋的截留分子量一般为800014000。制作透析袋的透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO通常为1万左右。3.透析原理将生物大分子样品溶液置入透析袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4透析，升高温度可加快透析速度。为了提高透析速度，把高分子（6 00012 000）聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖等撒在透析袋外即可，这样透析速度会得到很大的提高。【跟我做】透析袋的制做与维护1.透析袋的准备商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm50 mm不等。为防干裂，出厂时都用10的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。（1）剪取适当长度的透析袋。通常长度为10cm、20cm和30cm。（2）将透析袋放入大体积的5mm01LEDTA，200mm01lN9HC03溶液中。（3）煮沸5min。倾弃EDTANaHC03液，用去离子水轻轻漂洗。再加大量的 5mm01LEDTA，200mmolL溶液并煮沸5min。在上述步骤中，应注意透析袋一定要浸泡于溶液中。（4）弃去第二次洗液，彻底用去离子水清洗；然后，加入大量的去离子水漂洗并盖好(最好是用铝箔)。（5）高压灭菌10min，冷却后4储藏备用。在大多数实验时，加入002叠氮钠不影响透析结果，并可防止微生物的生长。使用时，戴上手套，取出适当长度的透析袋，用大量的去离子水或蒸馏水流水彻底冲洗其内外面。2.使用方法一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可以使用特制的透析袋夹夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。含盐量很高的蛋白质溶液透析过夜时，体积增加50是正常的。为了加快透析速度，除多次更换透析液外，还可使用磁子搅拌。透析的容器要大一些，可以使用大烧杯、大量筒和塑料桶。小量体积溶液的透析，可在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。检查透析效果的方法是：用1 BaCl2检查(NH4)2SO4，用1 AgNO3 检查NaCl、KCl等。【大家做】工作