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第二章细胞反应动力学 2 1微生物反应过程概论 2 1 1微生物反应过程主要特征 1 微生物是该反应过程的主体 2 微生物反应的本质是复杂的酶催化反应体系 3 微生物反应是非常复杂的反应过程 复杂性表现 代谢成网络化分布 并相互影响 无法完全了解清楚反应体系中的细胞生长 基质消耗和产物生成 三者的动力学规律既有联系 又有明显差别 且有各自的最佳反应条件 时变性强 非线性无法准确计量 定量5 多相 气相 液相和固相多组分 培养基中多种营养成分 多种代谢产物 细胞内也具有不同生理功能的大 中 小分子化合物 复杂的群体性 同时存在不同生理特性 不同活力的细胞群体 与酶反应比较 2 1 2微生物反应动力学的描述方法 微生物反应动力学包括细胞生长动力学 反应基质消耗动力学和代谢产物生成动力学 其中细胞生长动力学是其核心 为了描述细胞培养过程的细胞质量 底物质量 产物质量的变化关系 在细胞反应动力学中用细胞反应的速率 细胞反应的比速率 细胞反应的得率等来描述 其定义分别如下 1 细胞反应的速率表示为单位反应体积 单位时间内的某一组分的量的变化 在细胞反应中主要的反应的速率有 细胞生长速率式中CX 细胞浓度 g L t 时间 h 细胞浓度通常用单位体积的培养液中的细胞 或菌体 的干燥质量表示 细胞浓度一般用质量单位表示 很难用摩尔单位表示 底物消耗速率式中CS 底物浓度 g L 或 mol L 氧消耗速率式中CO 单位体积的培养液中O2的消耗量 g L 或 mol L 产物生成速率式中CP 产物浓度 g L 或 mol L CO2生成速率式中CCO2 单位体积的培养液中CO2生成量 g L 或 mol L 热量的生成速率式中CH 单位体积的培养液中热量的生成量 kJ L 2 细胞反应的比速率 单位时间内单位菌体消耗基质或形成产物 菌体 的量称为比速 是生物反应中用于描述反应速度的常用概念 不同反应间的对比 消除细胞量的效应 在细胞反应中主要的反应的比速率有 细胞的比生长速率 1 h 底物的比消耗速率 1 h 或 mol g h 氧的比消耗速率 1 h 或 mol g h 产物的比生成速率 1 h 或 mol g h CO2的比生成速率 1 h 或 mol g h 热量的比生成速率 kJ g h 3 细胞反应的得率 细胞对底物的得率在间歇的培养过程中的细胞对底物的得率一般是随着培养时间而变化的 即因随着培养的进行培养基的营养成分的组成 细胞的活性是变化的 所以瞬时的细胞对底物的得率可表示为 间歇培养的细胞对底物的总得率 细胞对氧的得率在间歇的培养过程中的细胞对氧的瞬时得率为 产物对底物的得率在间歇的培养过程中的产物对底物的瞬时得率为 生成的热量对底物的得率在间歇的培养过程中生成的热量对底物的瞬时得率为 2 2细胞反应计量学反应计量学是对反应物系的组成或反应的程度的量化的研究 通过反应计量学可以得到反应组成分的数量关系及变化规律 反应计量学反应工程学的理论基础反应热力学反应动力学 微生物细胞化学组成的主要物质为C H O N 及P S K Na等 可将细胞以一般的化学物质的表达形式写作C H O N 典型的微生物细胞的组成为CH1 8O0 5N0 2 例如 大肠杆菌细胞的化学组成 以干基计 2 2 1忽略产物生成的细胞生长过程的计量关系对忽略产物生成的细胞生长过程的计量关系可表示为CmHnOl aO2 bNH3cC H O N dCO2 eH2O底物碳源氮源细胞对C元素 1 对H元素 2 对O元素 3 对N元素 4 上述4个细胞反应的计量方程 不足以计算a b c d e等5个未知量 因而再寻找1个方程 如在好氧型培养时 可定义呼吸商作为第5个方程 5 联立1 5式 有解得细胞反应方程的a b c d e等5个系数 2 2 2细胞反应的化学平衡通式底物用于转化为细胞的化学平衡式为aCmHnOl bO2 cNH3 dC H O N eH2O fCO2底物细胞 1 底物用于转化为产物的化学平衡式为a CmHnOl b O2 c NH3 d C H O N e H2O f CO2产物 2 将a a 乘 2 式有aCmHnOl ab a O2 ac a NH3 ad a C H O N ae a H2O af a CO2 3 以F表示底物转化为产物的分率 则 1 F 为底物转化为细胞的分率 用F乘 3 式有FaCmHnOl Fab a O2 Fac a NH3 Fad a C H O N Fae a H2O Faf a CO2 4 用 1 F 乘 1 式有 1 F aCmHnOl 1 F bO2 1 F cNH3 1 F dC H O N 1 F eH2O 1 F fCO2 5 4 式与 5 式相加 有aCmHnOl b F a b ab a O2 c F a c ac a NH3 Fad a C H O N d 1 F C H O N e F a e ae a H2O b F a f af a CO2 细胞反应的化学平衡通式 2 3细胞反应的碳平衡2 3 1细胞反应的碳元素平衡对细胞的反应过程的底物 S 产物 P 细胞 X 和CO2之间可建立其碳元素平衡关系 或式中qS 底物的比消耗速率 mol g h 细胞的比生长速率 1 h qCO2 CO2的比生成速率 mol g h qP 产物的比生成速率 mol g h 1 1mol底物中的碳元素的含量 g mol 例如葡萄糖为底物时 1 72 g molglucose 2 1g细胞中的碳元素的含量 g g 一般 2 0 5 gC gbiomass 3 1molCO2中的碳元素的含量 g mol 3 12 g molCO2 4 1mol产物中的碳元素的含量 g mol 例如产物为乙醇时 4 24 gC molethanol 产物为乙酸时 4 24 gC molaceticacid 产物为乳醇时 4 36 gC mollacticacid 2 3 2细胞反应的碳源平衡对细胞反应 底物的消耗 CS 可由如下项组成满足于细胞生长所需的碳源底物消耗 CS G细胞维持的碳源底物的消耗 CS m生成产物的碳源底物的消耗 CS P即 或引入细胞对底物的得率及产物对底物的得率的概念 有 或 其中YX Smax 细胞对底物的理论得率 YP Smax 产物对底物的理论得率 YX Smax的意义为用于同化为细胞的碳源底物消耗所得到的细胞的得率 即称之为 细胞对底物的理论得率 或 细胞对底物的最大得率 表示细胞对底物得率的最大的可能性 YX Smax与YX S的单位为g mol或g L h mol L h YP Smax的意义为用于异化为产物的碳源底物消耗所得到的产物的得率 即称之为 产物对底物的理论得率 或 产物对底物的最大得率 表示产物对底物得率的最大的可能性 YP Smax与YP S的区别在于 YX Smax与YX S的区别在于 在以培养细胞为目的的细胞反应的过程中 代谢产物的积累可忽略不计的情况下 有上式为qS关于 的直线方程 可通过这一直线方程求取YX Smax和m 将上式改写 有 即是1 YX S关于1 的线性方程 截距为1 YX Smax 斜率为m 2 4细胞反应的ATP的平衡经典的生物化学指出 在有氧条件下TCA循环葡萄糖 38ADPCO2 H2O 38ATP在嫌气条件下酵解途经葡萄糖 2ADP乳酸 2ATP 细胞对ATP的得率YX ATP一般底物为供能的限制性底物时 在厌氧条件下YX ATP 10 gbiomass molATP 能量生长的偶联型与非偶联型细胞的生长过程依靠ATP的高能键释放的能量将细胞的构成材料合成为细胞的高分子物质 如蛋白质 DNA RNA 脂类 多糖等 能量生长的偶联型当有大量的细胞构成材料时 细胞的生长取决于ATP的供能 这种生长为能量生长的偶联型 能量生长的非偶联型当缺少细胞构成材料或细胞生长受抑制时 细胞的生长取决于细胞构成材料的供给 这时多余的ATP的高能键会被酶分解 能量以废热释放 这种生长为能量生长的非偶联型 此时YX ATP 10 gbiomass molATP 2 5细胞反应的能量平衡通过对细胞反应的能量平衡来确定在反应过程中的能量的相对利用 有机物的氧化焓变和有效电子转移微生物细胞利用碳源的分解过程所释放的能量 通过ATP等贮能物质 获得自身生长的能量 所有物质的氧化总是伴随着电子转移 物质在氧化过程中 每个氧气分子可以接受4个电子 将物质在氧化过程中伴随着能量释放所进行的电子转移称为有效电子转移 例如H2 0 5O2 H2O H 241 4kJ mol其有效电子转移数为2 记作2 ave 葡萄糖完全氧化的反应C6H12O6 6O2 6CO2 6H2O其有效电子转移数为6 4 24 ave mol 大量的试验表明 有机化合物的氧化时 每转移1个有效电子 平均释放111kJ的热量 记作 Have 111kJ ave 例如葡萄糖完全氧化的反应以有效电子转移计算的释放的能量为 H葡萄糖 111 24 2664kJ mol用测热计测定的葡萄糖燃烧过程得到的是 H葡萄糖 2813kJ mol H葡萄糖 与 H葡萄糖相差不到6 这样的误差在工程上是可以接受的 用有效电子转移计算有机物所释放的能量 在工程上十分方便 H 实际反应的焓变 H 以有效电子转移为基准的反应的焓变 在单一碳源的细胞培养过程中以焓变表达的能量平衡式为式中 HS HX HP 以有效电子转移为基准的碳源底物 细胞 产物氧化的焓变 HX 22 15kJ gbiomass 当仅考虑细胞的C H O N等组分时 以有效电子转移为基准的细胞氧化的焓变 HX 18 6kJ gbiomass 细胞反应过程的通风与反应热好氧发酵中 当产物只有CO2时细胞反应过程的通风量与反应热之间的关系式为上式可写作式中qQ 细胞反应过程的反应热比生成速率qO 细胞反应过程的比耗氧速率 HO 细胞呼吸 耗氧 反应的焓变 HO K 444kJ mol 0 444kJ mmol 对实际的反应试验得设计反应器的冷却面积和冷却水用量的依据判断供氧的状况 当通风不足时会 研究反应速度及其影响因素并建立反应速度与影响因素的关联 反应动力学模型 反应器特性 反应器的操作模型 操作条件与反应结果的关系 定量地控制反应过程 发酵反应动力学的研究内容 模型的简化 模型描述的是细胞群体动力学行为均一细胞模型 细胞间无差别 确定论 非分离 模型与概率论 分离 模型3 细胞组成均一化结构模型与非结构模型均衡生长与非均衡生长4 反应体系均相化 游离细胞 分离化与均一化模型 结构模型 动力学模型的简化 非结构模型 分批培养中微生物的生长 当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到一定程度 细胞开始分裂 这时细胞生长很快 比生长速率几近常数 这个时期称为对数生长期 在对数生长期内的微生物细胞的生长速率为以t 0 CX CX0 t t CX CX为边界条件对上式积分 有定义为微生物培养的倍增时间 2 5细胞生长动力学无抑制的细胞生长动力学模型 Monod方程 模型假定 均衡生长 浓度为唯一变量不考虑细胞间的差别 对细胞群体的动力学行为进行描述只有一种限制性基质单一反应 一步限速反应 细胞得率为一常数 适用于对数期和减速期 是经验模型Ks为饱和常数 其值等于 为 m一半时的限制性底物浓度 注意 Ks数量级 当底物浓度CS远小于饱和常数KS时 Monod方程可简化为此时的细胞生长速率为关于底物浓度的一级动力学关系 当底物浓度CS远大于饱和常数KS时 Monod方程可简化为此时的细胞生长速率为关于底物浓度的零级动力学关系 初始底物浓度过高时 双底物限制 高浓度的底物的抑制的作用细胞反应的比生长速率与底物浓度的关系为令 得 产物抑制 延迟期动力学 tL 延迟期的总时间 稳定期动力学 对数死亡模型 影响比死亡速率kd的因素 活化能 与微生物种类有关温度 培养基成分的受热破坏也可看做一级反应 其kd也遵循阿累尼乌斯方程 活化能大的反应 其反应速度随温度的变化也大 反之亦然 对培养基灭菌过程培养基中杂菌细胞的受热死亡培养基中营养成分的受热损失 高温快速灭菌原理 其它致死模型 循序死亡模型 2 6底物消耗动力学 物质流 合成新的细胞物质合成胞外物质能量流 进行胞内反应进行胞外物质合成反应维持胞内外浓度梯度 2 6 1 当细胞反应过程消耗的底物仅用于生长细胞 底物浓度的变化与细胞浓度变化可关联为 当底物消耗只用于细胞生长时有 若CX0很小可忽略 则上式可简化为当反应开始时 CX值相对较低 此时提高CX值 有利于其生长速率的提高 当反应后期 CX值较高 而相应CS值很低 此时若继续提高CX值 则其生长速率继续下降 rX有一个最大值 rX CX关系曲线 氧的消耗动力学 2 6 2包括维持代谢的底物消耗动力学对于在热力学意义上的远离平衡态的活细胞 为了维持其活性 需要获取高能物质并将其化学能转化为热能 以维持细胞的渗透压 修复DNA RNA和其他大分子物质 因此能量消耗不仅是用于细胞生长上 同时也用于细胞的维持上 提供细胞反应的能量的来源是以碳源为底物的物质 则底物的消耗速率可表示为 式中m 细胞的维持常数 g g h 1 h 或 mol g h 底物的比消耗速率可表示为 氧的消耗动力学 2 6 3包括产物生成的底物消耗动力学 2 7产物生成的动力学醇类有机酸类细胞代谢生物产品抗生素类酶制剂 Gaden根据代谢产物的生成速率和细胞的生长速率的关系分为 生长偶联型 GadenI 半生长偶联型 GadenII 非生长偶联型 GadenIII 2 7 1生长偶联型模型 GadenI 是指与细胞生长与代谢产物生成同步的一类细胞反应模型 所生成的产物一般为底物分解代谢的产物 如乙醇 乳酸 葡萄糖酸等代谢属于这一类型 生长偶联型的产物生成的动力学模型为式中YP X 单位质量的细胞生成的产物量 即产物对细胞的得率 g g 或 mol g 2 7 2半生长偶联型 GadenII 半生长偶联型的细胞反应 其产物的生成与底物消耗仅有间接的关系 产物是能量代谢的间接结果 在细胞生长期内 基本无产物生成 如柠檬酸和氨基酸的生产属于半生长偶联型 半生长偶联型的动力学方程可用Luedeking Piret方程表示式中 常数 2 7 3非生长偶联型 GadenIII 产物的生成与细胞的生长无直接偶联关系 它是次级代谢产物 它的特点是当细胞处于生长阶段时 并无产物积累 而当细胞生长停止后 产物却大量生成 属于此类型的有抗生素 微生物毒素等代谢产物的生成 非生长偶联型的动力学模型为 GadenI GadenIII GadenII 负相关模型 如黑曲霉生产黑素 考虑产物分解 二次函数模型 2 8动力学参数估计2 8 1微分法LB作图 2 8 2积分法对于酶反应 对细胞反应最简单的情况底物消耗只用于细胞生长 必须用试差法求解 因而积分法只适用于最简单的动力学方程 积分后得 2 8 3计算机寻优法利用计算机强大的计算能力 寻找一组最优的参数 使得模型计算值与实验值差值平方和最小 例 在某分批发酵过程中测得不同时刻的细胞浓度及底物浓度 假设其底物消耗动力学符合其中Yx s 0 3 m 4h 1 试分别用Monod方程和Tessier方程建立其细胞生长动力学模型 并判断哪个模型更能描述该发酵过程 最终建立细胞生长及底物消耗动力学模型 用matlab语言求解动力学参数 MATLAB是英文MATrixLABoratory 矩阵实验室 的缩写 由美国MathWorks公司推出的用于数值计算和图形处理计算 除了具备卓越的数值计算能力外 它还提供了专业水平的符号计算 文字处理 可视化建模仿真和实时控制等功能 MATLAB的基本数据单位是矩阵 它的指令表达式与数学 工程中常用的形式十分相似 故用MATLAB来解算问题要比用C FORTRAN等语言简捷得多 MATLAB是国际公认的优秀数学应用软件之一 寻优函数 Fmincon函数 积分函数 Ode45函数 用Runge Kutta法求数值积分 温度对生长的影响 不同微生物的生长对温度的要求不同 根据它们对温度的要求大致可分为四类 嗜冷菌适应于0 260C生长 嗜温菌适应于15 430C生长 嗜热菌适应于37 650C生长 嗜高温菌适应于650C以上生长 每种微生物对温度的要求可用最适温度 最高温度 最低温度来表征 在最适温度下 微生物生长迅速 超过最高温度微生物即受到抑制或死亡 在最低温度范围内微生物尚能生长 但生长速度非常缓慢 世代时间无限延长 在最低和最高温度之间 微生物的生长速率随温度升高而增加 超过最适温度后 随温度升高 生长速率下降 最后停止生长 引起死亡 1 微生物对温度的要求不同与它们的膜结构物理化学性质有密切关系根据细胞膜的液体镶嵌模型 细胞在正常生理条件下 膜中的脂质成分应保持液晶状态 只有当细胞膜处于液晶状态 才能维持细胞的正常生理功能 使细胞处于最佳生长状态微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度范围相一致 二 微生物与温度相关性的原理 什么是液晶状态 液晶状态是指某些有机物在发生固相到液相转变时的过渡状态称为液晶态 由固态转变为液晶态的温度称为熔点 以T1表示 由液晶态转变为液态的温度称为清亮点 以T2表示 T1与T2之间的温度称为液晶温度范围 那么为什么不同微生物对温度的要求不同呢 根据细胞膜脂质成分分析表明 不同最适温度生长的微生物 其膜内磷脂组成有很大区别 嗜热菌只含饱和脂肪酸 而嗜冷菌含有较高的不饱和脂肪酸 2 蛋白质结构 通过对嗜冷酶的蛋白质模型和x一射线衍射分析表明 嗜冷酶分子间的作用力减弱 与溶剂的作用加强 酶结构的柔韧性增加 使酶在低温下容易被底物诱导产生催化作用 嗜冷菌具有在0 合成蛋白质的能力 这是由于其核糖体 酶类以及细