叶绿素荧光是光合作用研究的探针

叶绿素荧光是研究光合作用的探针叶绿素荧光是研究光合作用的一个敏感的探针 叶绿素荧光分析具有灵敏 简便 快速和对植物无破坏损伤的特点 它既可以用于叶绿体 叶片 也可以遥感用于群体 群落 它既是室内光合基础研究的先进工具 也是室外自然条件下诊断植物体内光合机构运转状况 分析植物对逆境响应机理的重要方法 20世纪80年代以来 调制荧光仪 特别是便携式荧光仪的商品化 使荧光分析在光合作用研究中得以广泛应用 而且它在与光合作用紧密相关的植物学和农学等许多学科的研究中也得到广泛的应用 叶绿素荧光动力学研究得到广泛应用的原因1 包含着光合作用过程的丰富信息 光能的吸收与转换 能量的传递与分配 反应中心的状态 过剩光能及其耗散 光合作用光抑制与光破坏 等等2 可以对光合器官进行 无损伤探查 获得 原位 的 insitu 信息 3 近年来测定仪器的性能和自动化程度越来越高 操作步骤越也来越简便 特别是在植物抗性生理 植物生态学 作物生理学以及藻类学的研究中取得了众多研究成果 从应用方面 叶绿素荧光 特别是叶绿素荧光动力学 已经在鉴定植物的各种抗性 筛选抗除草剂植物 检测环境污染及植物对污染的反应 作物增产潜力苗期预测 甚至植物遥感和营养缺乏症等许多领域得到应用 一 叶绿素荧光的发现 Brewster 1834 在观察一束太阳光通过月桂叶片的乙醇提取液时 在反射光方向看到的是红色 而不是绿色 1852年 Stokes认为这是一种光发射现象 命名为荧光 fluorescence 二 叶绿素荧光的来源及其量子产量光合机构吸收的光能有三个可能的去处 1 光化学反应 光合作用 光呼吸 氮代谢 2 放热 又称非辐射能量耗散3 发射荧光这三者之间存在此消彼长的竞争关系 所以可以通过荧光的变化探测光合作用的变化 通常色素分子是处于能量的最低状态 基态 吸收一个光量子后 会引起原子结构内电子分布的重新排列 其中一个低能的电子获得能量而成为激发态 激发能 光化学反应形成同化力 热耗散 荧光 CO2固定光呼吸Mehler反应N代谢 从Chlb到Chla的传递效率几乎达100 故检测不出Chlb的荧光 植物体内发射的荧光大部分来自PSII天线色素系统 Chlorophyll afluorescence 而PSI色素系统基本不发射荧光 实际上 荧光发射出的光能在数量上是很少的 还不到吸收总光能的3 在理论上 荧光量子产量 f 的定义为 f F IaF 发射荧光量子总数Ia 吸收光量子总数 f的大小取决于各种去激途径的竞争 若Kf Kh Kt Kq和Kp分别代表荧光 热耗散 激发能传递 荧光猝灭和光化学反应的去激速度常数 则Chla荧光量子产量 f 与各种K的关系如下 f Kf Kf Kh Kt Kq Kp在以上各种去激途径中 f受Kp的影响最大 在弱光下 PSII原初电子受体QA处于完全氧化状态 即PSII反应中心开放 这时 Kp Kf Kh Kq Kt则所吸收的光量子90 以上用于光化学反应 结果得最小的 f 约0 6 在饱和光下 当QA完全还原时 即PSII反应中心关闭 此时Kp 0 其 f最大 约3 肉眼难以观测到 由此可见 植物体内荧光去激途径仅占总去激途径的一小部分 在溶液中 f可达30 三 叶绿素荧光诱导动力学及其测量叶绿素荧光诱导现象是1931年由德国Kautsky首先发现的 所以又称Kautsky效应 叶绿素荧光诱导动力学是指当暗适应的绿色植物材料转到光下时 其体内叶绿素荧光强度会产生有规律的随时间的变化 图 有几个特征性的点 分别被命名为O I D P S M和T 在照光的第一秒钟内 荧光水平从O上升到P 这一段被称为快相 在接下来的几分钟内 荧光从P下降到T 这一段被称为慢相 快相与PSII的原初过程有关 慢相则主要与类囊体膜上和间质中的一些反应过程有关 经过暗适应后的叶片从黑暗中转入光下 叶片的荧光产量随时间而发生的动态变化 称为Kautsky效应 荧光的这种动态变化所描绘出的曲线即Kautsky曲线 完整的Kautsky曲线可分为两部分 从开始照光到荧光产量达到最大值时的荧光上升部分 所用时间很短 只需0 5 2 0s 称为快速荧光动力学曲线 此后 荧光产量降低 并逐渐达到一个稳恒值 时间大致需要8 10min 称为慢速荧光动力学曲线 荧光产量降低是荧光猝灭 Quench 的结果 所谓荧光猝灭 是指叶绿素吸收光量子后的部分激发能通过光化学途径或以热的方式散失 从而使荧光发射量减少的现象 叶绿素荧光诱导动力学曲线 非调制式荧光仪 可把荧光诱导动力学曲线划分为 O点 原点 I 偏转 D 小坑 P 最高峰 S 半稳态 M 次峰 T 终点 这几相 phase 其中从O P相为快速上升阶段 约1 2秒 从P S相为荧光慢速下降 猝灭 阶段 4 5分钟 低温荧光在77K 196度 液氮中 小 与温度有关的酶反应和电子传递能力对荧光水平的影响被避免 因此只有原初光化学反应被反映出来 77K荧光是测定PSII光化学效率 Fv Fm 的一个重要工具 健康植物叶片的Fv Fm值为0 832 77K荧光常用于研究两个光系统之间的能量分配 PSI在735nm处的荧光增加往往是PSII向PSI增加分配的结果 调制荧光用于测定荧光的光源被调制 也就是使用很高频率不断开关的光源 而且检测器通过选择性放大仅仅检测这种调制光激发的荧光 因此可以在背景光 特别是在田间很强的太阳光存在的情况下测定相对的荧光产额 荧光猝灭 使荧光产量从它的最大值 Fm 下降的各种过程 分为两大类 光化学猝灭 qP 代表被开放的PSII反应中心捕获并转化为化学能的那部分能量 非光化学猝灭 qN 代表各种非光化学去激过程所耗散的能量 调制式荧光仪测定原理 MR 经调制的弱测量光 2mmolm 2s 1 l 583nm 绿光 频率600HzAR 作用光 白光 持续照射 SR 饱和脉冲光 白光 8500mmolm 2s 1 照射0 5sFR 弱远红光 7 10mmolm 2s 1 l 700nm D 荧光检测器 A 信号放大器 SF 短波滤光片 LF 长波滤光片 荧光猝灭 任何使荧光产额低于其最大值的过程 光化学猝灭 由光化学反应引起的荧光产额的降低 它依赖于氧化态QA的存在 非光化学猝灭 由非光化学过程如热耗散过程引起的荧光产额的降低 非光化学猝灭涉及三个不同的机理 qE 依赖类囊体膜内外的质子浓度差 暗豫驰的半时间T1 2小于1分钟 qT 依赖状态1向状态2的转换 增加向PSI的能量分配 qI 与光合作用的光抑制有关 表现为Fv Fm的下降 叶绿素荧光分析方法示意图 荧光参数的意义Fv Fm最大光化学效率 PSII Fm Fs Fm PS 实际光化学效率Fv Fm PS 最大天线转化效率P PSII PFD光化学反应速度NPQ Fm Fm 1非光化学猝灭qp Fm Fs Fm F0 光化学猝灭系数qN Fm F0 Fm F0 非光化学猝灭系数D 1 Fv Fm 吸收光能通过热耗散消耗的部分 1 基础荧光参数 Fo 最小荧光产量 也称初始荧光产量或基础荧光产量 是对充分暗适应叶片 PS 反应中心处于完全开放状态 照以极弱的测量光后发出的荧光 此时光化学猝灭系数qP 1 非光化学猝灭系数qNP 0 一般认为 这部分荧光是在天线中的激发能尚未被反应中心捕获之前 由天线叶绿素发射出的 当存在天线热耗散时 Fo会降低 当反应中心失活或遭到破坏时 Fo会升高 已知过高的温度往往使PSII放氧复合体脱离 反应中心失活 此时Fo会明显提高 因此 可以用Fo随温度的变化动态来反映高温对光合器的危害 并用来评价植物的抗热性 Fm 最大荧光产量 Maximalfluorescence 是PS 反应中心完全关闭时的荧光产量 此时光化学和非光化学荧光猝灭均为0 qP 0 qNP 0 Fm可反映通过PS 的电子传递最大潜力 通常叶片经暗适应至少20min后照以饱和脉冲光后测得 Fs 稳态荧光产量 即在光照下 光 暗反应达到动态平衡时的荧光产量 Fm 光适应下最大荧光产量 是在光照条件下照以饱和脉冲光后测得 此时存在非光化学猝灭 即qNP 0 PS 反应中心又全部关闭qP 0 Fo 光适应下的最小荧光产量 在测定前照射弱远红光 7mmolm 2s 1 l 700nm 测得 目的是激活PSI 加速由PSII向PSI的电子传递 产生 基础荧光猝灭 qo Fv 暗适应下最大可变荧光 Fv Fm Fo Fv 光适应下最大可变荧光 Fv Fm Fo 2 荧光猝灭参数 qP Fm Fs Fm Fo 可变荧光的光化学猝灭系数 它反映了PS 反应中心的开放程度 qNP Fm Fm Fm Fo 可变荧光的非光化学猝灭系数 它反映了PS 反应中心关闭的程度 NPQ Fm Fm Fm Fm Fm 1 非光化学猝灭 3 反映PSII光化学效率的荧光参数 Fv Fm 是重要的荧光参数之一 名称很多 有 最大原初光化学产量 PSII最大潜在量子产量 开放的PSII反应中心量子效率等 我们习惯上称其为 PSII最大光化学效率 其值恒小于1 Fv Fm是暗适应下PS 反应中心完全开放时的最大光化学效率 反映PS 反应中心最大光能转换效率 Fv Fo 是Fv Fm的另一种表达形式 但从度量上 该指标变化范围大 比Fv Fm更易区别不同处理间的差别 两个指标的意义基本相同 一般没有必要同时用Fv Fm和Fv Fo来表示PSII最大光化学效率 在非胁迫条件下 Fv Fm的值很稳定 据BjorkmanandDemmig对大量植物的测定 其平均值为0 832 0 004 但在逆境条件下 Fv Fm显著降低 正因为如此 所以Fv Fm的降低常作为发生光抑制或PSII遭受其他伤害的指标 在一些研究论文中 CO2同化的表观量子效率的降低也常常作为光抑制的指标 但其意义是不同的 Fv Fm 光适应下PS 最大光化学效率 它反映有热耗散存在时 开放的PS 反应中心的光化学效率 PS Fm Fs Fm PS 实际光化学效率 它反映在照光下PS 反应中心部分关闭的情况下的实际光化学效率 ETR 或Prate PS PFDa 0 5 表观光合电子传递速率 PFDa为实际吸收的光量子 一般设定为入射PFD的0 84 0 5为假设光能在两个光系统中各分配50 四 荧光动力学技术在逆境生理研究中的应用叶绿素荧光动力学特性包含着丰富的信息 在理论上 可以用来研究光合作用过程能量吸收 传递与转换的机理 但对于植物生理生态学研究者而言 主要兴趣集中在光合作用的能量利用效率 过剩光能导致的光合作用光抑制 光破坏 以及光破坏防御机制等方面 Fig 1ResponsesofFv Fmtochillingtreatmentandsubsequentrecovery Subsequentrecoverywasconductedunder25 Cand100 molm 2s 1PFD chillingtreatmentunderlowirradiance chillingtreatmentinthedark Eachpointrepresentsthemean SDof5measurementsonseparateleaves Fig 2Effectofchillingtreatment 4 C underanirradianceof100 molm 2s 1ontheoxidizableP700insweetpepperleaves chillingtreatmentunderirradiance chillingtreatmentinthedark Leavesweredarkadaptedfor15minpriortomeasurement Eachpointrepresentsthemean SDof3measurementsonseparateleaves Fig 3Responsesoftherelationshipbetween PSIIand CO2andPn PFDcurvestochillingtreatmentunderirradianceandsubsequentrecovery Bothchlorophyllaandnetphotosyntheticrateweremeasuredunder25 C Subsequentrecoverywasconductedat25 Cunder100 molm 2s 1PFD A Therelationshipbetween PSIIand CO2determinedinNA B Pn PFDcurvesdeterminedinNA C Therelationshipbetween PSIIand CO2determinedinLOA D Pn PFDcurvesdeterminedinLOA CK post treatment recoveryfor8hours recoveryfor32hours recoveryfor49hours Fig 4Responsesoftherelationshipbetween PSIIand CO2andPn PFDcurvestochillingtreatmentinthedarkandsubsequentrecovery Bothchlorophyllfluorescenceandthephotosynthesisrateweremeasuredat25 C Subsequentrecoverywasconductedat25 Cand100 molm 2s 1PFD A Therelationshipbetween PSIIand CO2determinedinNA B Pn FPDcurvesdeterminedinNA C Therelationshipbetween PSIIand CO2determinedinLOA D Pn PFDcurvesdeterminedinLOA CK post treatment recoveryfor8hours Fig 1EffectsofchillingstressonthemaximumphotochemicalefficiencyofPSII Fv Fm oftobacco Leafdiscswereexposedto100 molm 2s 1PFDat4 C Wildtype ndhB and100 molm 2s 1PFDat25 C Wildtype ndhB respectively Chlfluorescencewasmeasuredafter5mindarkadaptation Eachpointrepresentsthemean SDof5measurementsonseparateleaves Fig 3TimecourseofthechangesintheinvivoPSII drivenelectrontransportrate ETR uponexposureto100 molm 2s 1PFDat4 C Wildtype ndhB and100 molm 2s 1PFDat25 C Wildtype ndhB respectively Eachpointrepresentsthemean SDof5measurementsonseparateleaves Fig 4Timecourseofthedevelopmentof A non photochemicalquenching NPQ and B itsfastrelaxingcomponent qf intobaccoleavesuponexposureto100 molm 2s 1PFDat4 C Wildtype ndhB and100 molm 2s 1PFDat25 C Wildtype ndhB respectively Eachpointrepresentsthemean SDof5measurementsonseparateleaves Fig 5Effectsofchillingstressontheformationofzeaxanthinandantheraxanthinat4 Cunder100 molm 2s 1PFD Controlsweretreatedat25 Cunder100 molm 2s 1PFD Whitebarrepresentswildtypeandshadowbarrepresents ndhB Eachbarrepresentsthemean SDof5measurementsonseparateleaves Fig 6EffectsofchillingstressunderlowirradianceontobaccoP700 Controlsweretreatedat25 Cunder100 molm 2s 1PFD Methylviologen MV 2mM wasvacuuminfiltratedafterchillingstressimmediatelyandP700 wasmeasuredsoonafterinfiltration Whitebarrepresentswildtypeandshadowbarrepresents ndhB Eachbarrepresentsthemean SDof3measurementsonseparateleaves 五 误用举例1 测定条件选择不当普遍的问题是暗适应时间不够 特别是存在着持续性的非光化学猝灭 甚至有PSII反应中心破坏的情况下 均使Fm测定值偏低 因为Fm是PSII反应中心全部开放状态下 照射饱和脉冲光后所产生的最大荧光 因此 在照射饱和脉冲光之前 必须使PSII反应中心处于完全的氧化态 并且不存在任何非光化学猝灭 跨类囊体膜的质子动力势应当为0 类囊体膜处于完全的驰豫 放松 状态 relaxation 在环境条件适宜的条件下 将叶片暗适应20分钟左右 基本可以达到上述状态 但在胁迫条件下 20分钟显然是不够的 为了得到可靠的Fm 较妥当的办法是在黎明前测定一次Fm 以后的测定和计算均以此值为标准 但是 当存在着持续性的非光化学猝灭时 即使经过一夜的恢复 Fm也不能达到应有的最大值 这种情况多发生在严重胁迫的条件下 如严重干旱 常绿植物越冬期间等等 此时 由于碳同化及消耗同化力的其它代谢活动受到严重抑制 使同化力大量积累 而且还常伴有PSII反应中心的破坏 由于在这种情况下不能正确地测出Fm 因此 利用Fm进行计算的荧光参数 特别是NPQ NPQ Fm Fm Fm 会显著偏低 Idealizeddiurnalresponsesofthelevelofzeaxanthin antheraxanthin Z A thermalenergydissipationestimatedfromNPQ andthelevelofPSIIefficiencypredawnandpostdusk Fv Fm andduringexposuretolight Fv Fm forleavesofasclerophyticperennialspeciesinafullsunlight exposedhabitatonasummerdaywithnoadditionalenvironmentalstressandonadaywithstressthatpreventsphotosyntheticutilizationofabsorbedlightorhasresultedindownregulationofthecapacityforphotosynthesistosuchanextentthatlittleabsorbedlightisutilizedforphotosynthesis IdealizedtracesofChlfluorescenceobtainedusingapulseamplitudemodulated PAM fluorometer 例1 某作者研究干旱胁迫对刺槐叶绿素荧光动力学的影响6月30日将各处理浇水至田间最大持水量 此后停止一切水分供应 到7月6日部分苗木因干旱而死亡时 结束实验 测定过程中叶片应在叶夹中充分暗适应5min 然后用饱和脉冲方法进行测定 作者认为 NPQ由上升转为下降反映了刺槐的光合机构开始遭到破坏 保水剂对干旱胁迫下刺槐叶绿素a荧光动力学参数的影响 西北植物学报 2002 22 5 1144 1149 例2 昼夜连续测定 需要谨慎 下图是某作者研究小麦幼苗用PEG进行干旱处理不同时间测得的qP和qNP变化动态 连续测定42小时 将受到光合作用昼夜周期的强烈影响 qP和qNP同步下降又同步升高的结果不可信 例3 测定光强由强到弱的变化过程中荧光参数的变化 应当谨慎 如某作者研究桑树在PFD由1400到50mmolm 2s 1的变化过程中 PSII qP和NPQ的变化 结果是 PSII及qP的增加和NPQ的减少都比PFD由弱变强时变化速度缓慢 并认为 通过热耗散作用耗散过剩激发能的能力比上午弱 实际上 本试验的设计本身就存在问题 因为NPQ的三个组分的暗驰豫时间只有qE最短 半恢复时间在1min左右 而qI的暗驰豫1 2时间可达40分钟以上 如果由强光到弱光 饱和脉冲光的间隔时间仍设计为4min 就连qT的恢复时间都不够 当然测出的恢复就十分微弱 因此这种试验设计的实际意义不大 用荧光动力学曲线区分过剩光能耗散的不同方式可将非光化学猝灭qNP区分为三部分 qNP qE qT qIqE 高能态荧光猝灭qT 与状态转换有关的荧光猝灭qI 与光抑制有关的荧光猝灭 2 数据不可信如 某作者用甲醇处理牡丹后 叶片光合速率提高了53 64 但是光合电子传递速率 ETR 反而下降了5 6 5 本文测定的光合速率光合电子传递速率 ETR 在1 14 1 45mmolm 2s 1之间 但光合速率却高达8 30mmolm 2s 1 按理论值计算同化1个CO2至少需要传递4个以上电子 而本文的结果却是每传递一个电子可同化7个以上的CO2 3 将荧光参数与作物的丰产性甚至产量直接挂钩 或者将荧光参数作为筛选作物高产品种的重要指标 要注意 不能将光能转化效率与碳同化速率等同起来 即便是用碳同化速率作为作物丰产性的指标 也是有条件的 并且有很大的局限性 因为 影响产量的因子很复杂 是由光合性能的五个方面共同决定的 决不仅仅决定于光合速率一个因子 而荧光参数更多地反映光能的转换效率 不能将其等同于光合速率 如 一天中随着上午光强度的提高 光合速率在不断提高 但Fv Fm却在不断降低 如 某作者研究干旱对春小麦叶片荧光动力学特征及产量间关系的影响 对水分胁迫下8个小麦品种产量与荧光参数Fv Fo Fv Fm做相关分析 结果发现二者关系不显著 这个结果本来应当是预料之中的事 但作者对前人报道的 不同水稻品种苗期Fv Fo Fv Fm值均与该品种的产量水平成正相关 的结论似乎深信不疑 反而怀疑自己的结果有什么问题 并且分析了可能的原因 包括 1 生长环境不同 2 作物不同 3 研究时期不同 并且提出 因本试验所得结论是建立在一年大田试验的基础上 所以还需在以后继续这方面的研究 拓宽研究内容 利用不同试验地 更多小麦品种 在不同生育时期研究叶绿素荧光特征与产量的关系 4 对荧光动力学特性和光抑制的基本理论理解有误例1 某作者研究 桑树叶片PSII对光强日变化的适应特性 时说 在光合有效辐射逐渐增强时 Fv Fm和FPSII降低 非光化学猝灭 NPQ 增加 说明引起桑树光抑制的原因除了NPQ之外 此处将NPQ的增加当作了引起光抑制的原因 下午随光强减弱 Fv Fm和FPSII回升 恢复到接近早晨水平 但是回升的速率比上午下降的速率慢 说明中午PSII活性的降低是PSII可逆失活变化的过程 进一步解释了 桑树光合日变化净光合速率中午下降的原因 例2 某作者用5 PEG处理溶液培养的水稻 模拟轻度干旱胁迫 结果是PEG处理下 Fo Fv Fo和Fv Fm除个别品种外 均显著下降 由此认为 干旱胁迫下水稻叶片PS 活性中心受损 干旱胁迫对不同基因型水稻光合特性的影响 干旱地区农业研究 2003 21 3 124 126 应当指出 1 轻度干旱胁迫一般不会导致PSII活性中心的损伤 2 Fo降低 表明不是PS 活性中心受损 而是热耗散的增强 5 颠倒因果关系 不分情况 将荧光特性所反映出来的光能利用效率的降低一律当作原因 而将光合速率的降低当作结果 然而 实际上 在绝大多数情况下 是光合碳同化速率的限制 不能及时将激发能利用 导致激发能过剩 而光合机构能够通过各种方式将过剩激发能耗散 从而导致了光能利用效率的降低 并最终反映在荧光参数的变化上 例1 某作者发现冷敏感植物辣椒在低温下qP降低而qN上升 于是在讨论中认为 qN 与光合电子传递和光合气体交换无直接关系 仅与ATP和NADPH的形成 累积及光合膜的状态有关 表明作者对非辐射能量耗散产生的基本原理尚不甚明了 qN反映了PS 反应中心关闭的程度 它与qP之间是互为消长的关系 当光合链上电子传递不畅时 PSII反应中心不能将激发态电子及时传递出去 将通过非光化学猝灭耗散过剩光能 因而使qN增加 qP降低 反之 如果电子传递十分通畅 则qN降低 qP增加 因此qP和qN的消长恰恰是光合链上电子传递通畅与否的反映 应当强调指出 碳同化 同化力的周转 光合链上的电子传递 PS 的氧化还原状态 叶绿素荧光猝灭方式是紧密联系的一个完整系统 不可分割开来理解 例2 某作者研究低温弱光对黄瓜光合与荧光特性的影响 认为 弱光亚适温胁迫导致电子传递速率的大幅度下降是引起光合速率降低的又一重要原因 此处又是将因果关系倒置了 弱光亚适温胁迫后 不论当天还是恢复7天后 Fv Fm均未发生明显差异 表明PSII的功能并未受到损伤 电子传递速率的下降是对激发态电子利用能力 主要是通过碳同化 的降低造成的 后者是因 前者是果 又说 CaCl2通过增强电子传递提高光合速率是其改善黄瓜光合功能的可能机理之一 CaCl2不是 通过 增强电子传递来提高光合速率 而是因为光合速率高 才能维持较高的电子传递速率 例3 某作者研究盆栽条件下水分胁迫对茶树叶绿素a荧光动力学的影响 结果是 停止浇水后Fv Fm和Fv