重组蛋白的表达.doc

重组蛋白的概述1. 概述分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点表达策略优点缺点分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成降低蛋白酶对表达蛋白的降解可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化不需要细胞破碎表达水平低多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成可获得确定的N末端显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解胞内包涵体表达包涵体易于分离保护蛋白质不被降解蛋白质不具有活性对宿主细胞生长没有大的影响，通常可获得高的表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的初期，要采用快速的方法除去影响目标蛋白稳定性的杂质，还要严格控制涉及蛋白质变性的各种因素，来避免蛋白质失去活性。蛋白质的构象稳定性可以通过测定蛋白质变性反应时折叠（f）和去折叠（u）间自由能的变化（Gfu）来衡量，Gfu越大蛋白质就越稳定。根据报导蛋白质的Gfu在520kcal/mol范围之间，单个氢键可造成0.52kcal/mol自由能的变化，一个离子对可造成0.41.0kcal/mol自由能的变化，因此Gfu相对比较小，这样天然状态仅仅比去折叠状态稳定一点，所以必须克服蛋白质内在的不稳定性，保留蛋白的活性。这一点在分离纯化和蛋白质储存中都很重要，影响蛋白质稳定性的因素有温度、pH、离子强度、某些添加剂、表面吸附、震摇、剪切力、冻融、蛋白浓度、压力等，这些因素对折叠的影响有的是可逆的，有的是不可逆的，而且相互之间也有影响，在实际处理中应选择合适的条件，尽量避免不利因素的影响（2），并利用活性跟踪的方法对处理进行评价，指导分离纯化。在进行任何纯化工作时，第一步必须针对目标蛋白建立特异性的分析方法。这些特异性的分析方法都是基于目标蛋白的一些特性，如酶的活性，免疫学活性，物理特性（如分子量、等电点、光谱学特征等），生物学活性。在理想的情况下，我们希望所选择的分析方法具有特异、快速、灵敏和可定量的特点。特异性要求分析方法反映目标蛋白的独特性，以排除假阳性。快速则要求能很快的给出定性和定量结果，以便更好的与分离纯化的工作相衔接。灵敏的分析方法仅需要少量的样品，这就给操作带来了极大的方便。在分离纯化的每一步，都需要对蛋白和活性进行定量，这就要求分析方法有准确可定量的特点，以对分离纯化的效果进行评价。如通过SDS-PAGE电泳测定蛋白质分子量来鉴定蛋白质，由于电泳的分辨率限制，常常不能确定收集部位中是否含有目标蛋白或目标蛋白是否得到了富集，这时就需要运用更特异的分析方法，如Western blotting就可以从复杂的混合物中描述蛋白的分子量，并对蛋白进行定量。另外当一些蛋白没有方便可用的生物学活性测定方法，或者由于干扰物质的存在不能测活，可应用一些免疫学的方法进行检测。在纯化的过程中，需要监测以下几个参数：总的样品体积，样品中总的蛋白，目标蛋白的活性单位，通过这些基本的信息，就可以跟踪每步纯化的效率，计算出目标蛋白的回收率，目标蛋白的比活性，以及纯化的倍数，从而对纯化的每一步，乃至整个流程进行定量评价。Richard等在纯化重组大肠杆菌RNA聚合酶32亚基的工作中给出了很好的范例，在定量测定项中，包括了蛋白质的定量测定、定量SDS-PAGE、定量蛋白质斑点印迹和酶活测定，使用这些方法对操作的每一个阶段取样进行纯化效果的评价，从而确保每一步纯化的有效性（1）。正是由于分析方法在分离纯化中的指导性作用，所以有效的分析方法是分离纯化是否能够成功的前提。重组蛋白表达纯化的基本策略的具体步骤最终取决于样品的性质。但也有共同可参考的阶段 捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。 中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。 精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。分离方法的选择 根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC） 每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。 分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。 处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。 速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。 回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。 在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。样品浓缩HIC分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩GF高分辨率（使用Supedex）样品体积（总柱体积的5%）和流速范围有限制缓冲液更换（如果需要）样品稀释RPC高分辨率需要有机溶剂在有机溶剂中，有损失生物活性的风险1、 通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。2、 硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。3、 GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。4、 在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或和处理量的方法5、 如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。6、 只要目标蛋白耐受的情况下，可以考虑采用RPC方法用于精制阶段。注：应该指出，三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。1. 分离纯化的方法策略及其应用下游的分离纯化步骤不仅要在可替换的分离技术间进行选择，如细胞的破碎可选择高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎或酶溶法，分离细胞、细胞碎片、包涵体和沉淀物，可选择离心或过滤，需要进行浓缩的时候，可选择沉淀或超滤；另一方面，设计的纯化工艺包括特定的层析步骤，及层析的先后顺序，以期得到最大的得率。吸附层析，如离子交换层析，疏水层析和亲和层析，可基于特定的选择性达到对目标蛋白的纯化，适用于大量样品的处理。凝胶过滤层析用于后续的精制步骤，如去除少量的杂蛋白或聚合体，在纯化过程中用于脱盐和缓冲液交换。在分离纯化中对每个步骤的选择，可以遵循以下原则：1 应尽可能的利用蛋白质的不同物理特性选择所用的分离纯化技术，而不是利用相同的技术进行多次纯化；2不同的蛋白质在性质上有很大的不同，这是能从复杂的混合物中纯化出目标蛋白的依据，每一步纯化步骤应当充分利用目标蛋白和杂质成分物理性质的差异。所以在分离纯化的开始阶段，要尽可能的了解目标蛋白的特性，不仅如此还要了解所存在杂质成分的性质，如大肠杆菌的蛋白大多是一些低分子量的蛋白（50000Da），而且酸性蛋白较多；3 在纯化的早期阶段要尽量减少处理的体积，方便后续的纯化；4 在纯化的后期阶段，再使用造价高的纯化方法，这是因为处理的量和杂质的量都已减少，有利于昂贵纯化材料的重复使用，减少再生的复杂性（84）。在下游的纯化工艺中为了提高蛋白的得率和处理的效率，应当使用最少的纯化步骤，经典的纯化过程如图1 所示。在初始的纯化阶段，除了使目标蛋白和细胞内的DNA、RNA、多糖以及性质差别较大的蛋白质成分分离，采用的分离方法要能除去影响目标蛋白稳定性的杂质，保护目标蛋白不被蛋白酶降解，进行目标蛋白的捕获和浓缩。在这一阶段的纯化中，盐析沉淀仍然应用，但共沉淀的杂质常常很多，离子交换层析和疏水层析具有操作上的优点，可以再生使用，成为这一步通常选用的层析方法；中间阶段纯化是最为关键的阶段，这时要能达到和大量的杂蛋白分离，利用蛋白质不同的性质选择不同的纯化方法，每一步的方法要有足够的选择性，提高目标蛋白质的纯度；最后进行精制纯化，常用凝胶层析，使目标蛋白的纯度进一步提高达到要求。对于包涵体蛋白质，由于涉及包涵体蛋白质的变复性，其纯化步骤和方法与可溶性蛋白不同，需要对每一种包涵体蛋白质建立相应的复性方法，将在后面作介绍。图1 经典的蛋白质纯化流程图在工业上，为了尽可能提高过程的通量和减少生产的成本，发展的方法与传统的方法不同。双水相萃取和扩张床吸附技术，可以处理全细胞培养液，通过整合技术的使用，能达到萃取、浓缩和初步纯化的目的。另外这两种技术和亲和相互作用结合可进一步提高处理的选择性。相似的，亲和相互作用还可以整合进其它的高通量处理，如亲和膜过滤和亲和沉淀（2）。生产上使用的非线性色谱，如置换色谱，一次层析的载量很大，得到的蛋白纯度很高，近年来也有很大的发展和应用（85,36）。2.1 包涵体蛋白质的折叠复性在过去几十年的发展过程中，重组DNA技术为大规模生产目标蛋白提供了新的途径，尽管有不同的宿主系统可供选择，如果翻译后修饰不是蛋白质功能所必需的话，大肠杆菌和其它的原核宿主系统仍然是生产重组蛋白的首选(17)。细菌如大肠杆菌可以在短时间里得到高水平表达的蛋白质，但同时表达的蛋白质常常形成非活性的包涵体。包涵体的形成是一个由许多蛋白质参与的极端复杂的动力学过程，依赖于蛋白质的折叠速率和聚集速率，并且与蛋白质的合成和降解程度相关（35）。强的表达系统，高的诱导剂浓度，相对较高的培养温度常常造成包涵体的形成。除了外界因素，包涵体的形成依赖于蛋白质特异的折叠行为，而不是蛋白的通常特性，如大小，融合标签，相对的疏水性。尽管如此，限制折叠速率的结构特性，如二硫键的形成常常是含有二硫键蛋白质正确折叠的限速步骤（并不绝对，因为有些蛋白质二硫键的破坏并不影响其功能），富含二硫键的蛋白质具有更为复杂的结构，当高水平表达时，由于大肠杆菌细胞质是一个偏还原性的环境，蛋白质容易形成错配的二硫键，这常常是包涵体形成的主要原因。膜蛋白具有暴露的疏水区，表达时易于聚集形成包涵体，也有可能由于降解或对细胞的毒性作用使得表达水平极低（45）。蛋白质的糖基化可以影响到蛋白质的折叠行为和溶解性，当它们在原核系统进行表达时，也容易聚集（4）。蛋白质进行可溶性表达和表达形成包涵体各有利弊，对许多蛋白，再折叠很困难，或者不可能，进行可溶性的表达就是首选。现在发展了许多方法减少包涵体的形成，如使用中等强度或弱的启动子，低温培养，有限的诱导，优化培养基条件，进行融合表达(49)，与伴侣分子和折叠酶共表达(3,5)，表达定位于不同的空间(7,58)，选择突变的菌株（6,43）或其他的原核表达系统(34)。由于影响蛋白质细胞合成和折叠的因素太多，优化结果不可预测，如对于抗体Fab片段，尽管只有可变区序列不同，也不能预测新的Fab片段在体内是否可以正确折叠（4），所以即使采用了促进可溶性表达的方法，也不能保证不形成包涵体。从另一方面来讲形成的包涵体易于和细胞的其它成分分离，而且过量表达的目标蛋白在包涵体中得到了富集，提高了纯度，降低了分离纯化的难度。所以如果包涵体蛋白可以进行体外的正确折叠，那么形成包涵体就可以接受，对易受细菌蛋白酶降解的蛋白质或对细菌有毒性的蛋白质来说，表达产生包涵体是绝对必要的。内皮抑素（endostatin）可以特异性的抑制内皮细胞的增殖，具有抑制新生血管生成和抑制肿瘤生长的作用，已进入临床研究阶段。采用酵母表达系统，可直接产生具有活性的蛋白质，但是表达的水平和蛋白质的回收率较低，采用大肠杆菌表达则形成包涵体，包涵体蛋白质的折叠复性非常困难，改善蛋白质的折叠复性具有实际的应用意义。通过对内皮抑素折叠机制的研究表明，紧密折叠的内皮抑素对酸耐受，在酸性条件下有可能得到大量的正确折叠的蛋白质（15）。所以如果对于包涵体蛋白质，通过机制的研究，能够解决折叠复性的问题，那么利用包涵体的高水平表达，就可以得到大量的蛋白质，降低生产的成本。在包涵体蛋白质的变复性中，不管是采用什么方法进行折叠，都要用变性剂溶解包涵体，最终又都要去除变性剂，理解变性剂对蛋白质的影响可以指导我们设计复性过程。 图2：在各种变性剂浓度条件下蛋白质的溶解性和构象。如图2所示，随着变性剂浓度的变化，不仅具有天然构象状态蛋白质的比率在改变，而且蛋白质的溶解性也在改变。在高的变性剂浓度条件下，蛋白质的极性和非极性侧链都是可溶的，但是蛋白质却是去折叠的，如图2中d所标的区段。在低的变性剂浓度条件下，如图2中a区段所示，天然构象的蛋白质是稳定的，但也会稳定部分折叠的中间体，这些部分折叠的中间体易于自我缔合形成沉淀。所以选择b区段所在的变性剂浓度来进行蛋白质的折叠更为有效，这一区段即可以稳定蛋白质的天然构象，而且可以增加天然构象蛋白质的溶解性，对于部分折叠的中间体却没有稳定作用。避免选择c区段所在的条件进行折叠，因为这一区段天然和变性的蛋白质都只有有限的溶解性，折叠速度也很慢（13）。这一图示所展示的规律对所有蛋白并不是统一的，但它向我们描述了一个大概的情况，在这一过程，不仅仅要考虑变性剂对天然构象和折叠中间体的稳定作用，还要考虑对蛋白溶解性的影响。在高的变性剂浓度，蛋白质是去折叠的，充分溶剂化的，柔性的，在折叠缓冲溶液中，蛋白质是折叠的，具有刚性的，将蛋白质从高变性剂浓度条件变为折叠缓冲溶液，就会使蛋白质坍塌形成紧凑的结构，但蛋白的这一过程不总能有效进行，常常存在错误折叠和聚集，所以在包涵体的变复性过程中，除了要控制上面所讲的参数，还有两方面的参数需要控制，一是应用添加剂，来促进折叠、减少聚集，二是控制溶液的氧化还原状态促进二硫键的正确配对。通常从包涵体中回收活性蛋白质包括三个步骤：包涵体的分离和洗涤，包涵体蛋白质的溶解和溶解蛋白质的再折叠。前两个步骤效率较高，但是再折叠的效率率常常不能令人满意，折叠的方法和折叠的条件需要通过实验来进行筛选。2.1.1 蛋白质折叠的过程和机理对蛋白质折叠机理的研究，对保留蛋白质活性，维持蛋白质稳定性和包涵体蛋白质折叠复性都具有重要的意义(21)。早在上世纪30年代，我国生化界先驱吴宪教授就对蛋白质的变性作用进行了阐释（8），30年后，Anfinsen通过对核糖核酸酶A的经典研究表明去折叠的蛋白质在体外可以自发的进行再折叠，仅仅是序列本身已经包括了蛋白质正确折叠的所有信息（9,10），并提出蛋白质折叠的热力学假说，为此Anfinsen获得1972年诺贝尔化学奖。这一理论有两个关键点：1蛋白质的状态处于去折叠和天然构象的平衡中；2 天然构象的蛋白质处于热力学最低的能量状态。尽管蛋白质的氨基酸序列在蛋白质的正确折叠中起着核心的作用，各种各样的因素，包括信号序列，辅助因子，分子伴侣，环境条件，均会影响蛋白质的折叠，新生蛋白质折叠并组装成有功能的蛋白质，并非都是自发的，在多数情况下是需要其它蛋白质的帮助，已经鉴定了许多参与蛋白质折叠的折叠酶和分子伴侣（3,16,86），蛋白质“自发折叠”的经典概念发生了转变和更新，但这并不与折叠的热力学假说相矛盾，而是在动力学上完善了热力学观点。在蛋白质的折叠过程中，有许多作用力参与，包括一些构象的空间阻碍，范德华力，氢键的相互作用，疏水效应，离子相互作用，多肽和周围溶剂相互作用产生的熵驱动的折叠（12,52），但对于蛋白质获得天然结构这一复杂过程的特异性，我们还知之甚少，许多实验和理论的工作都在加深我们对折叠的认识，但是问题仍然没有解决。在折叠的机制研究上早期的理论认为，折叠是从变性状态通过中间状态到天然状态的一个逐步的过程，并对折叠中间体进行了深入研究，认为折叠是在热力学驱动下按单一的途径进行的。后来的研究表明折叠过程存在实验可测的多种中间体，折叠通过有限的路径进行。新的理论强调在折叠的初始阶段存在多样性，蛋白质通过许多的途径进入折叠漏斗（folding funnel），从而折叠在整体上被描述成一个漏斗样的图像，折叠的动力学过程被认为是部分折叠的蛋白质整体上的进行性装配，并且伴随有自由能和熵的变化，蛋白质最终寻找到自己的正确的折叠结构，这一理论称为能量图景（energy landscape），如图3所示，漏斗下方的凹凸反映蛋白质构象瞬间进入局部自由能最小区域(13,14)。图 3：能量图景（The energy landscape）的示意图，高度代表能量尺度，宽度代表构象尺度，在漏斗（funnel）的下方存在别的低能量状态，共存的不同能量状态的蛋白质种类也降到最小(14)。这一理论认为结构同源的蛋白质可以通过不同的折叠途径形成相似的天然构象，人酸性成纤维生长因子（hFGF-1）和蝾螈酸性成纤维生长因子（nFGF-1）氨基酸序列具有约80%同源性，并且具有结构同源性（12个折叠反向平行排列形成折叠桶），在盐酸胍诱导去折叠的过程中，hFGF-1可以监测到具有熔球体样的折叠中间体，而nFGF-1经由两态（天然状态到变性状态）去折叠，没有检测到中间体的存在，折叠的动力学研究也表明两种蛋白采用不同的折叠机制（38）。对于同一蛋白质，采用的渗透压调节剂（osmolytes）不同，蛋白质折叠的途径也不相同，说明不同的渗透压调节剂对蛋白质的稳定效应不同（11）。这两个例子都说明折叠机制的复杂性，也与上面所介绍的理论相吻合。 2.1.2 包涵体的分离和溶解分离包涵体的第一步是对细菌进行最大限度的溶解，将几种细胞破碎技术相结合，如联合使用溶菌酶处理，高压匀浆细胞破碎和含表面活性剂的高盐溶液处理，可以使膜碎片和细胞壁碎片最大限度的分解。细胞破碎后，通过离心的方法可以很方便的回收包涵体，再用洗涤液（通常含有低浓度的变性剂，表面活性剂，还原剂，EDTA）对包涵体进行清洗，就可以得到较纯的包涵体（4，74）。通常要选用强的变性剂使蛋白质完全变性溶解，如6 M的盐酸胍和8 M 的尿素，蛋白质浓度多采用1-10mg/ml（22）。由于盐酸胍溶解包涵体蛋白质能力比尿素强，而且尿素中的异氰酸酯可以使自由氨基氨甲酰化（这种作用在碱性条件下表现的更强），所以常常首选盐酸胍作为解离剂。对含有分子间二硫键或非天然二硫键的包涵体蛋白质，在溶解过程中需要加入还原剂，如二硫苏糖醇，-巯基乙醇，还原型谷胱甘肽，加入螯和剂，如EDTA，可以防止金属催化的半胱氨酸氧化。除此之外，改变pH和使用表面活性剂也被用于溶解包涵体蛋白质（22），相对而言，这两种方法的应用较少，而且只有具有正确二硫键的包涵体蛋白质才可以用表面活性剂进行溶解，否则可同时形成正确的和非正确的二硫键，表明用尿素、盐酸胍变性和用表面活性剂变性对蛋白质的结构和动力学有不同的影响，Tsumoto在这方面做了详细的论述（25）。Panda等在高pH 条件下使用低浓度的尿素溶解包涵体蛋白质，用于重组牛生长激素、重组人生长激素和猕猴透明带糖蛋白的变复性，认为在变性时蛋白质所保留的天然二级结构有助于蛋白的折叠，减少蛋白质的聚集。但采用的高pH条件可以使氨基酸残基发生化学修饰，还需要更多的验证（73）。以上变性的方法属于化学变性，使用高的静力压提供了蛋白质变性的另外一种物理变性方法，静力压促进蛋白质变性解离，是因为蛋白质在变性条件下，系统整体趋向于更小的体积。联合使用高压和低浓度的变性剂已用于包涵体蛋白质和蛋白质聚集体的变性，是一种有前景的变性方法（31,83)。2.1.3 溶解后包涵体蛋白质的折叠复性蛋白质分子变性后，通过改变折叠的条件使蛋白质恢复其天然构象的过程，称为复性。已经发展了很多的方法用于包涵体的折叠复性，但是这些方法的结果并不可预测，每一种方法都需要对各种实验条件，如变性剂浓度、pH、温度、蛋白质浓度、离子强度、添加剂的浓度，进行优化选择。通常包涵体在变性溶解后具有高的纯度，可以直接进行复性。但由于包涵体还含有其它的细胞成分，如膜蛋白、磷脂、核酸，可能影响蛋白质的复性（53,54），为了进一步提高纯度，有些研究工作在包涵体变性后先进行蛋白的纯化，如亲和层析（47,55,57,60,63,64,65, 68）、离子交换层析（47,56）、凝胶过滤层析、反相层析（62），再进行变性蛋白质的复性，层析在变性条件下应用为这一策略提供了技术支持。为了控制折叠、错误折叠和聚集的速率，一种方法是降低变性剂的浓度，降低的速度和操作的时间都决定折叠的效率。另一种方法就是加入添加剂来减少聚集，促进折叠，如L-精氨酸，盐，有机溶剂，一些表面活性剂，渗透压调节剂（osmolytes），硫代甜菜碱类物质（NDSBs），这些物质或稳定蛋白质的天然构象，或使部分折叠的中间体不稳定，表2 列出了这些化合物和它们可能的作用机制，它们在蛋白质的折叠中起着重要的作用，已得到广泛的应用（13,25,32,4,74），但对于其中的好些化合物参与折叠的作用机制我们还了解不多。表 2 增加蛋白质折叠的添加剂添加剂可能的作用机制甘油对蛋白质具有优先的水合作用/增加黏度L-精氨酸两亲分子/渗压剂甘氨酰甜菜碱/山梨糖醇对蛋白质具有优先的水合作用阿拉伯聚糖增加黏度木糖醇增加黏度乙醇调节极性DMSO调节极性两性离子表面活性剂（Zwitterionic detergents）保护非极性表面Triton X-100保护非极性表面硫代甜菜碱类物质（NDSBs）保护非极性表面蔗糖/海藻糖对蛋白质具有优先的水合作用/增加黏度N-氧化三甲胺（TMAO）对蛋白质具有优先的水合作用/渗压剂三氟乙醇（TFE）促进二级结构的形成低浓度盐酸胍使部分折叠的中间体不稳定/增加天然构象蛋白质的溶解性低浓度尿素使部分折叠的中间体不稳定/增加天然构象蛋白质的溶解性配体稳定天然结构状态聚乙二醇保护熔球体（molten globule）/增加黏度在折叠过程中另一个关键的问题是正确二硫键的形成，一旦形成了错误的二硫键，就不能再折叠形成正确的结构，所以在折叠时不仅要氧化促进二硫键的形成，还要加入还原剂促进二硫键改组（disulfide-bond reshuffling），使蛋白质最终折叠成正确的结构。常用的方法有：1 使用金属催化的空气氧化，并添加还原剂促进二硫键改组，由于氧在蛋白质溶液中溶解性低，这种方法的效率较低，改用搅拌促进氧的质量传输，又会造成蛋白质的聚集；2 使用小分子还原型和氧化型的巯基试剂对，包括还原型和氧化型的谷胱甘肽（GSH/GSSG）、半胱氨酸和胱氨酸（cysteine/cystine）、半胱胺和胱胺（cysteamine/cystamine）、二硫苏糖醇和氧化型谷胱甘肽（DTT/GSSG），二流赤藓糖醇和氧化型谷胱甘肽（DTE/GSSG），这一方法是目前常用的方法，通常使用的巯基试剂总浓度为5-15mM，还原剂和氧化剂的比为5:11:1（4,74）。3 在复性前将巯基保护起来，有两种方法可以选择，一是通过谷胱甘肽和蛋白的半胱氨酸残基形成二硫键来保护巯基，二是进行半胱氨酸磺酸化，从而减少复性过程中不正确的二硫键的形成，复性后再加入还原剂使形成正确二硫键。人组织纤溶酶原激活剂（t-PA）含有35个半胱氨酸残基，可形成17对二硫键，即使在天然状态下也只具有低的溶解性，进行原核表达时这两种巯基保护方法都被用于该蛋白质的折叠复性，由于在蛋白质的巯基上引入了带电荷的残基，增加了变性蛋白和部分折叠中间体的溶解性，减少了复性过程中蛋白质的聚集，可获得较高的复性效率（25,32,33）。人绒毛膜促性腺激素亚基（hCG）含有12个半胱氨酸残基，如果不进行巯基保护，在折叠复性中会形成寡聚体和大量沉淀，变性蛋白质磺酸化后再折叠复性可形成几乎100%单体蛋白，同时提高了得率和纯度（37）。此外，在前胰岛素的折叠复性中也应用了磺酸化保护（44,47,48），所以这一方法在进行复杂蛋白的变复性时可以采用。2.1.3.1 稀释复性和透析复性用折叠缓冲液快速稀释溶解的包涵体蛋白质溶液，达到降低变性剂浓度的目的，使去折叠的蛋白质进行再折叠，就是稀释复性。为了很快避开低溶解性变性剂区（如图2中c区段所示），减少蛋白的聚集，在进行稀释时一定要快速。折叠进行时的蛋白质浓度是体外折叠成功的关键，理想的情况是希望折叠在高浓度的条件下进行，但是在高浓度的条件下变性剂的稀释常常造成去折叠和部分折叠蛋白质的聚集。对于折叠，是一个一级的反应过程，而聚集是一个高级的反应过程，依赖蛋白质的浓度，所以需要小心的选择蛋白质的浓度，一般的蛋白质的终浓度保持在20-50g/mL。透析的方法不显著的改变溶液的体积，但时间较长，而且易形成蛋白质沉淀，所以透析起始的蛋白质浓度非常关键，而且仅对一些蛋白质有效。变性剂浓度的降低也可以分阶段的进行，或先经过稀释，再透析去除剩余的变性剂，由于变性剂的浓度在开始时先降到一定的水平，增加了部分折叠中间体的溶解性，常常可以提高折叠的效率，但是必须通过实验选择在不同阶段使用的变性剂浓度，避开图2 所示的c区段。除了要考虑降低变性剂的浓度，还要考虑每一阶段的氧化还原状态，以及温度、添加剂等因素。在胰凝乳蛋白酶原的折叠复性中，如果盐酸胍稀释的浓度低于0.5 M或高于3 M都会造成大量的沉淀，在2.5 M浓度时有一半的蛋白质没有正确折叠，而在1 M时则完全折叠，说明折叠时的变性剂并不是越低越好，而是存在一个最佳浓度（13）。Tsumoto等通过分阶段透析进行了单链抗体Fv段包涵体的折叠复性，在1M盐酸胍透析时加入氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸可以使正确折叠蛋白的得率达到95% 以上（40），进一步研究表明在1M盐酸胍条件下蛋白质所具有的结构使得自由巯基容易形成正确的二硫键，加入氧化型谷胱甘肽的作用是加速了蛋白质的正确折叠、抑制蛋白质的聚集，而L-精氨酸起的作用是稳定部分折叠的中间体使其不发生聚集，所以同时加入氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸可以将蛋白质的聚集降到最低的程度（41）。这个研究小组用相同的方法进行白介素-12包涵体的折叠复性，仅加入氧化型谷胱甘肽而没有还原型谷胱甘肽只有约57%的折叠效率，当两者同时加入后则可达到90%（42），这些结果表明前一种蛋白比较容易形成正确的二硫键，而白介素-12折叠复性需要加入还原型的谷胱甘肽促进二硫键重组，使蛋白质最终选择天然的二硫键，并促进折叠。另一种策略是将变性蛋白分成几份按一定的时间间隔逐步加入折叠缓冲液中，可以减少处理的体积、改善折叠的效率（35）。Arora等将这一方法用于人干扰素的复性，当添加0.5M的L-精氨酸可以使产率提高十倍，产品的得率和比活比文献报道的都要高（72）。在已经发展的复性方法中，稀释复性仍然是应用最多的方法，但在放大时会因为处理体积太大造成成本太高。溶解复性获得的蛋白质，需要通过离心和过滤的方法去除不溶性的物质，再按可溶性蛋白质的处理方法进行下游的分离纯化。扩张床吸附技术可以处理大量的样品，而且分离的效能不受聚集蛋白质的影响，Ferre等将蛋白质的稀释折叠和扩张床吸附捕获技术相偶联，使用STREAMLINETM DEAE阴离子交换介质，用于包涵体蛋白质HAT-h2m的分离纯化，可以得到48%回收率和94%纯度的复性蛋白（23）。 2.1.3.2 色谱复性色谱方法不仅在蛋白质的纯化中得到广泛应用，也成为包涵体蛋白质复性的主要手段之一。色谱复性的方法的优点是可以显著的减少处理的时间，减少变复性过程中分子的聚集，使复性的同时也达到了纯化的效果。第一类型的色谱复性就是凝胶过滤色谱复性，这一方法的原理在于通过分子筛效应可将蛋白质和小分子的变性剂分离，实现溶液交换和蛋白质的折叠。复性折叠中存在的一个问题就是蛋白质的聚集，为了减少导致蛋白质聚集的分子间相互作用，可将蛋白质结合在分离介质上，达到溶液中变性剂浓度的稀释和蛋白质的折叠，这一类型的复性为吸附型色谱复性，包括亲和色谱复性，疏水相互作用色谱复性，离子交换色谱复性。对于一些稀释法难于折叠的蛋白质，这一方法具有更好的效果，如一些膜蛋白（24,50,71）。在折叠中，吸附的位点会影响到折叠，所以要优化折叠的条件，才能得到好的折叠效果。另一种方法是在介质上固定化伴侣分子或折叠酶，使层析柱成为一个折叠反应器，固定化的优点是能够回收使用，不会引入新的杂蛋白。A. 凝胶过滤色谱复性凝胶过滤复性时，变性蛋白质加样于折叠缓冲液平衡好的凝胶过滤柱上，然后用折叠缓冲液进行洗脱，凝胶过滤层析有不同的分子量分级范围，有助于聚集蛋白质和正确折叠蛋白质的分离。血小板衍生的生长因子（PDGF）由两个亚基组成，Mller等用双顺反子表达载体同时表达等摩尔的A链和B链，但以包涵体的形式存在，为了得到活性的异源二聚体PDGF-AB，包涵体用盐酸胍变性后，先在变性条件下用凝胶过滤层析进行纯化，使用稀释复性，蛋白质严重聚集，即使在10g/ml蛋白质浓度条件下，也只能得到45%可溶性蛋白，而用凝胶过滤复性，同时洗脱的A亚基和B亚基可以缓慢二聚化产生异源二聚体，蛋白质以2.5mg/ml浓度上样,最终异源二聚体得率可达75%（26）。在凝胶过滤复性中，发展了一种梯度复性的方法，这一方法的原理基于复性过程中，变性条件的快速改变加速了部分折叠蛋白质的聚集，导致沉淀形成和非特异性的吸附，通过梯度洗脱逐步降低变性剂的浓度，使蛋白质处于一个梯度改变的变性剂条件下，控制蛋白质的折叠和聚集速度，使蛋白质在离开层析柱时，处于折叠缓冲液中，从而改善活性蛋白的回收率。通常选择线性的梯度用于折叠复性，对于不同的蛋白质还有其它的模式，如一些蛋白在特定的变性剂浓度范围里不稳定，在此变性剂浓度范围里就需要快速降低变性剂浓度。这一复性过程中，梯度在上样前就在层析柱中已经形成，上样后使用变性缓冲液进行洗脱，由于蛋白质受到的分子排阻比变性剂大，蛋白质移动的速度比变性剂梯度移动的速度快，最终蛋白质通过整个变性剂区，离开层析柱时处于折叠缓冲液中。通过尿素线性梯度复性，变性溶菌酶以高蛋白浓度上样（17mg/ml）可以获得90%的活性回收率，与稀释复性和非梯度凝胶过滤复性相比较，显著的改善了活性回收率（27）。对单链Fv片段包涵体蛋白，使用梯度同时改变变性剂浓度和pH，比单改变变性剂浓度的梯度复性或不使用梯度的凝胶过滤复性具有更高的活性得率（28）。另外应用连续环形色谱，蛋白样品连续上样于旋转的色谱柱上，在提高折叠效率的同时，也提高了色谱复性处理的能力（29,30）。B. 吸附型色谱复性吸附型色谱复性是在变性条件下，利用变性蛋白质可瞬间结合在特定层析介质上的特性，进行缓冲液的交换，降低变性剂的浓度，可先改变变性剂浓度使吸附的蛋白质逐渐的折叠复性，在柱中的变性剂溶液完全被置换成折叠缓冲液后，再通过在折叠缓冲液中加入盐或其它添加剂进行原位纯化洗脱，为了获得好的折叠效率和纯化效率，常采用梯度洗脱或阶段洗脱的方法。由于蛋白质结合在固相介质上，减少了折叠过程中由于分子间相互作用所造成的聚集，所以这一方法可提高折叠的效率。在变性条件下，蛋白质能否进行离子交换色谱复性和疏水色谱复性，与蛋白质的理化性质密切相关，仅有有限的报道（36），而给蛋白质加上一个亲和标签，表达得到的包涵体再用亲和色谱复性对不同的蛋白质有一定的通用性，应用也更为广泛，尤其是金属螯合亲和色谱复性。多肽通过在N端或C端加上一个亲和标签，在包涵体的纯化上有两个方面的用途，其一是包涵体变性溶解后，利用亲和色谱直接进行包涵体溶液的纯化，再用稀释或透析的方法进行复性(55,57,60,64,65,68)，其二就是用于亲和色谱复性(61,66,67,69,70)。由于蛋白质或肽类标签在变性条件大多失去了与亲和介质结合的特性，目前这一技术用的最多的是组氨酸标签。Zahn等在镍亲和层析柱（Ni-NTA argrose）上通过盐酸胍/谷胱甘肽梯度进行带有组氨酸标签的人朊病毒蛋白多肽片段的氧化再折叠，抑制了蛋白质聚集和分子间二硫键的形成，再用咪唑缓冲液对目标蛋白进行洗脱，纯化的流程图如图4所示(20)。Stempfer等在-葡萄糖苷酶的N端或C端加上多聚精氨酸标签，研究了变性蛋白在肝素亲和介质上的折叠复性，通过优化实验条件，蛋白质可以在5mg/ml浓度条件下高效复性(59)。图4：利用金属螯合色谱复性纯化人朊病毒蛋白多肽片段的流程图除了以上的应用，更令人鼓舞的是这一技术已成功用于膜蛋白的复性（24,50,71）。酮戊二酸载体蛋白是线粒体内膜上的一种转运蛋白，Smith先采用E.coli C41（DE3）作为宿主菌使C端带有组氨酸标签的目标蛋白形成包涵体获得大量表达，再用镍柱亲和色谱进行复性和纯化，获得的融合蛋白具有和天然蛋白一样的转运活性，每升的细菌培养液可获得15mg的活性蛋白（50）。C. 由固定化伴侣分子和/或折叠酶介导的色谱复性分子伴侣和折叠酶在蛋白质的正确折叠中起着重要的作用，是近年来的一个研究热点，它们和蛋白质在体内共表达已经成为促进蛋白质可溶性表达的重要方法。分子伴侣和折叠酶在体外有两个方面的应用，其一是在溶液中加入伴侣分子和/或折叠酶促进包涵体蛋白质的折叠和装配（39），另一方面就是通过固定化的伴侣分子和/或折叠酶来介导蛋白质的折叠复性。Altamirano等通过固定化伴侣分子GroEL的活性小片段、脯胺酰异构酶和大肠杆菌氧化还原酶DsbA将蝎子毒素蛋白Cn5的折叠得率从5%提高到87%（18）。在单链抗体Fv段的透析复性中，加入固定化的氧化还原酶DsbA和DsbC可以显著提高折叠的效率，得到的单链抗体Fv段和天然抗体Fv段具有相同的功能（46）。2.1.3.3 其它的复性方法近年，还有一些其它的方法用于蛋白质的折叠复性，如双水相萃取复性（76,77,78,79），反向胶束复性（33,75,80），高静力压复性（31,81,82,83），这些方法对特定的蛋白质可获得高的复性效率，大多还停留在研究阶段，相信随着方法的成熟和普及，将会为包涵体蛋白质的折叠复性提供更多的选择手段。2.2可溶重组分子的分离纯化重组蛋白在大肠杆菌中得到表达以后，首先必须从细菌释放才能进行下游的分离纯化过程。蛋白质释放的方法依赖于蛋白质最终在细胞中的定位。大部分的可溶性重组蛋白在细胞质中表达，而一些膜蛋白常常表达于细胞内膜上，还有一些则分泌到细菌的周质间隙或细胞外。将重组蛋白分泌到周质间隙或细胞外可避免破碎细胞和处理细胞碎片，而且杂蛋白的种类和量都要少得多（在周质空间大约有100种不同蛋白质，而在胞浆内有大约4000种不同的蛋白）。对于分泌到周质间隙的蛋白质，使用渗透压冲击，冻融法，溶菌酶处理方法可以使目标蛋白释放。对于表达于细胞内膜和胞内的蛋白质要经过细胞破碎，常用的方法有高压匀浆法、超声破碎法、珠磨法、化学渗透法和酶溶解法，每种方法有自己的特点，现在的研究常常将几种方法结合，并紧密结合下游固液分离过程（87）。对于表达于细胞膜的蛋白质，先要破碎细胞后分离细胞膜，再抽提溶液进行膜蛋白的提取，由于膜蛋白具有疏水区域，在抽提溶液中需要加入表面活性剂，一方面破坏细胞膜，溶解膜结构，另一方面促进膜蛋白的溶解和稳定，常用Triton X-100、 脱氧胆酸钠、Brij等弱的表面活性剂来保留蛋白质的天然构象。表面活性剂Triton X-114的临界溶液浓度（critical solution temperature）为23，在此温度以下，形成均一的溶液，在此温度以上，则形成富含表面活性剂的相和低浓度表面活性剂的相，通过温度诱导的相分离可以使膜蛋白进入富含表面活性剂的相，实现表达膜蛋白的浓缩，是一种应用广泛的表面活性剂。在膜蛋白的整个分离纯化过程中，都要使用表面活性剂来模拟脂质的功能，但胶束与蛋白质的相互作用常常降低层析的分辨率，而且聚集的情况更容易发生，所以在特定的纯化阶段选择哪一种表面活性剂，以及使用多大的浓度，对分离纯化的影响最为关键（88）。释放出目标蛋白后，再进行液相和固相细胞碎片的分离，得到澄清的蛋白质溶液就可以进行下游的分离纯化了，涉及膜分离技术、沉淀分离技术、萃取技术、层析技术、电泳分离技术，以及一些整合技术，如扩张床吸附，双水相萃取。膜分离技术和沉淀分离技术是两种传统的技术，不管在实验室研究，还是在工业的生产上都有应用，近年来功能性膜的应用和膜色谱的发展大大扩展了膜分离的应用领域，而亲和技术和沉淀分离相结合产生了亲和沉淀技术，提高了分离的特异性。扩张床吸附和双水相萃取整合了细胞碎片处理过程和初步浓缩纯化过程，在大规模纯化重组蛋白时具有很强的优势。重组蛋白和多肽的分离纯化（3）网络 2.2.1 层析技术在分离纯化中的应用层析技术应用于蛋白质的分离纯化开始于60年代，现在已成为蛋白质分离纯化的高分辨的方法。在层析技术的发展过程中，首先是基质填料的发展。由于蛋白质大分子具有高的亲水性，要求分离介质具有亲水的界面，为活性大分子提供适宜的微环境，早期的离子交换介质不具有亲水的特性和大的孔结构，仅用于小分子的分离纯化，Peterson 和 Sober 等在离子交换介质的研究上进行了开拓性的工作，选择特定的纤维素作为离子交换基团的基质，合成的离子交换纤维素介质具有高的结合容量和低的不可逆性吸附，并得到实际应用（89,90）。在过去的几十年里各种层析用基质得到发展，如Sephacryl、Sepharose FF、 Sepharose HP、Superose、Superdex、SOURCE、Mono Beads、Toyopearl，这些基质都有其的物理和化学特点，在蛋白质的分离纯化中发挥着重要的作用。层析技术的另一个发展方向是功能基团的发展，适应不同的选择性要求，如各种不同亲和层析介质的合成，使一步纯化就能达到很高的纯度。层析技术的第三个发展方向是操作模式的多样化，已发展的操作模式有扩张床吸附、模拟移动床层析、置换层析、灌流层析和径向层析，这几种方法能够具有处理大体积样品的能力，适合于大规模生产应用。在重组蛋白的分离纯化中，各种分离模式都得到应用。凝胶过滤层析是基于液相的分离方法，凝胶包裹的内环境形成固定相，凝胶的外环境形成流动相，蛋白质分子越大越不容易渗透进入固定相，所以又称为分子筛层析，层析的分辨率与介质的排阻极限和上样的体积有关，是一种易于操作的层析方法，另外凝胶过滤层析常用于缓冲液交换，此时可使用较大的载量。离子交换层析基于蛋白质与离子交换介质电荷间的相互作用，高于蛋白质等电点，蛋白质带负电荷，低于蛋白质等电点蛋白质带正电荷，不同的蛋白质在一定的pH条件下与介质上的离子之间相互作用不同，而产生不同的选择性，根据带电基团的类型和强度可分为四种类型：强阴离子交换层析、弱阴离子交换层析、强阳离子交换层析、弱阳离子交换层析，通常采用一定的平衡条件使目标蛋白选择性的吸附在介质上，也可以使杂蛋白吸附，而目标蛋白选择性的穿过。疏水层析基于蛋白质表面的疏水区和介质疏水配体间的相互作用，在高盐浓度条件下，蛋白质的疏水区表面上有序排列的水分子通过盐离子的破坏作用释放，裸露的疏水区与疏水配体相互作用而被吸附，随着盐浓度的降低，疏水性相互作用也降低，蛋白质的水化层又形成，蛋白质最终解吸附，其它物质，如乙二醇、甘油、非离子表面活性剂也可以降低疏水相互作用，而且疏水相互作用也受pH、温度和添加剂的影响。疏水层析的选择性依赖于疏水配体的结构，有烷基配体和芳香基配体，烷基的链越长，蛋白质的保留就越强。羟基磷灰石层析常用于抗体的分离纯化，对其分离的机制还了解的不清楚，但涉及介质上钙离子和磷酸根与蛋白上带电残基的相互作用。传统的片状羟基磷灰石物理和化学稳定性比较差，仅能在低流速条件下使用，新的球形羟基磷灰石克服了以上缺点，对于其它方法不易分离的蛋白质，可以用羟基磷灰石层析进行分离纯化。等点聚焦层析是基于蛋白质等电点不同的分离模式，以阴离子交换剂为固定