细胞器的分离与观察.doc

一、实验方案设计实验序号4实验名称细胞器的分离与观察实验时间2010年12月17日实验室生科院综合生物实验室21.实验目的1.1了解细胞器分离的原理；1.2掌握差数离心、密度梯度离心的技术原理和离心方法；1.3掌握细胞核、线粒体等细胞器的染色方法；1.4了解甲基绿-派洛宁、中性红-詹姆斯绿的染色原理和着色现象。2.实验原理、试验流程或装置示意图2.1新鲜取出的小鼠肝脏为组织块，为了得到细胞核和线粒体，首先需要进行匀浆，将细胞从组织块中分离出来，然后再经过进一步匀浆，使细胞膜破碎，细胞解体，各种细胞器被分离出来；同时，0.25mol/L蔗糖溶液，使肝脏细胞在匀浆的过程中处于低渗条件下，使得细胞更容易破碎，匀浆彻底；2.2细胞中，各种细胞器的结构、大小、比重及在同一介质中的沉降系数都是不同的。因此，细胞器的分离，通常使用的方法是最匀浆液进行离心，根据细胞器不同的大小、比重及沉降系数，选择合适的离心方法组合，就可以将不同的细胞器进行分离，得到富集的某种细胞器。常用的细胞器离心分离技术有差速离心和密度梯度离心：2.21密度梯度离心（density gradient centrifugation）用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。 在实验中，我们使用的介质为蔗糖，称为蔗糖密度梯度离心法。原理是：采用不同浓度的蔗糖溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分，就会出现许多层。这种情况采用适当的编排号码，取出样品池内的溶液，然后进行研究。2.22差速离心（differential centrifugation）差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。2.23离心力和转速的换算公式RCF = 1.118 10-5 N2 RRCF表示相对离心力，单位为gN表示转速，单位为rpm转/分R表示离心半径，单位为cm2.3染色方法2.31甲基绿-派洛宁染色甲基绿、派洛宁为两种碱性染料，与带负电和的磷酸根形成盐键。甲基绿分子有两个正电荷，易与双链DNA分子结合，使DNA显示绿色，派洛宁分子有一个正电荷，易与单链RNA分子结合，使RNA显示红色。也有人认为染色原理与核酸分子的空间构型有关。细胞核中，核仁的主要成分是RNA，而核仁外围为DNA与RNA的混合物，在细胞的不同活性状态下，外围的DNA和RNA的比例是不一样的，因此着色后的混合色也不一样，但一般情况下DNA的含量占优势，因此染色后，细胞核可以清晰地区分出被染成红色的核仁和显示混合蓝绿色的外围物质。2.32中性红-詹纳斯绿染色中性红是一种弱碱性 pH 指示剂，变色范围 pH6.48.0之间（由红变黄）。在中性或微碱性环境中，中性红的阳离子，与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。詹纳斯绿 ，常用作线粒体专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态.3.实验材料及设备3.1实验工具设备：高速冷冻离心机、显微镜、玻璃匀浆器、解剖剪、天平、滴管、移液枪、移液管、洗耳球、镊子、离心管、小烧杯、载玻片、盖玻片、试管、吸水纸、注射器、牙签等；3.2实验材料试剂：新鲜小鼠肝脏、生理盐水、0.25mol/L蔗糖溶液、0.34mol/L蔗糖溶液、0.88mol/L蔗糖溶液、PBS溶液、95%乙醇、丙酮、甲基绿派洛宁、中性红詹纳斯绿、蒸馏水、冰块。4.实验方法步骤及注意事项4.1实验方法步骤：4.11称取0.5g小鼠肝脏置于小烧杯中，用解剖剪将其剪碎，然后用生理盐水清洗数次，最后用0.25mol/L的蔗糖溶液清洗一次；4.12将清洗好的小鼠肝脏置于玻璃匀浆器中加入1.5ml0.25mol/L的蔗糖溶液即可进行细胞匀浆，待其充分匀浆后备用；4.13取1.5ml匀浆置离心管中，600g（3000r/min）离心10min，上清液留作线粒体分离；4.14沉淀用1ml0.25mol/L蔗糖溶液洗涤离心2次，每次1000g（3900r/min）离心10min；4.15纯化：将沉淀用500L0.34mol/L蔗糖溶液悬浮，然后用注射器加入0.88mol/L蔗糖溶液400L，1500g（4800r/min）离心1520min；4.16用PBS溶液悬浮干燥95%乙醇固定（5min）甲基绿-派洛宁染色20-30min丙酮分离30S蒸馏水漂洗吸干镜检；4.17步骤3的上清液置离心管，10000g（12270r/min）离心10min，沉淀用预冷0.25mol/L蔗糖溶液悬浮，然后10000g（12270r/min）离心10min两次；4.18在载玻片上滴加1-2滴中性红詹纳斯绿，然后用牙签挑取沉淀均匀涂抹于玻片上，盖上盖玻片，染色5min即可镜检。4.2注意事项：4.21整个实验的操作都要在较低的温度下进行，一般需要在4度以下，以保证经过匀浆之后，细胞器能够在低活性状态下，保持比较完整的形状，所以实验的操作过程中都需要采取冰浴或者通过其他方式保持低温条件；4.22使用离心机时应注意离心管内液体的配平；离心开始前或者离心完成后，不能保持离心机盖长时间开放，以免使离心机温度升高，影响离心效果；4.23在对细胞核进行染色时，需要控制好甲基绿-派洛宁染色的时间，也要把握好用丙酮洗脱的时间，才能保证细胞核中的DNA能够显示甲基绿的染色效果。4.24在进行线粒体的分离观察时，需要保证所取的动物组织是新鲜的，才能观察到明显的线粒体的形态。5.参考文献1翟中和，王喜忠，丁明孝.细胞生物学.北京：高等教育出版社，2007.2 崔泳 王金生 张文海 周勇. 冷保存鼠肝脏细胞线粒体的分离J.中国医科大学学报.2000年8月.第29卷第4期.二、实验报告1.实验现象及结果分析1.1细胞核的观察1.11现象：在显微镜下，可看到富集分离的细胞核，细胞核呈圆球形，核中央可见到两个或多个被染成红色的核仁，外围的物质被染成蓝绿色，但仔细观察，发现细胞核中蓝绿色的着色部分中混有红色1.12结果分析：核仁中的主要成分是RNA，被派洛宁染成红色，外围物质中主要是DNA，被甲基绿染成蓝绿色，但是外围物质中同样分布有一定量的RNA，因此可看到蓝绿色中混有的红色。1.2线粒体的观察1.21现象：在显微镜下，可以看到呈淡黄色，透亮的块状物质，但是不能找到被染成蓝绿色的线粒体1.22结果分析：显微镜下看到的淡黄色物质，是细胞破碎之后剩下的细胞膜脂质成分，不能被中性红染色，故呈黄色透亮状态；由于小鼠肝脏经过长期冷冻，线粒体可以已经解体或被消化，所以在实验中很难找到线粒体的染色形态2.实验总结在本次实验中，我学习到了细胞器分离与观察的基本方法、差速离心与密度梯度离心的基本原理、甲基绿-派洛宁和中性红-詹姆斯绿的染色机理和方法，对于以后的学习和实验都是很有帮助的；从实验的结果上看，没有观察到着色的线粒体，究其原因，可参考文章冷保存鼠肝脏细胞线粒体的分离（崔泳 王金生 张文海 周勇2000年）中得到的实验结果：4下保存1 h 见线粒体肿胀, 但大部分结构基本完整,轮廓和内膜嵴尚清楚。2 h 时见线粒体肿胀部分结构完整, 轮廓尚清晰, 内膜嵴不清晰, 可见空泡形成。3 h 时见线粒体肿胀结构不完整, 轮廓大清晰, 内膜嵴断裂甚至消失, 可见大量空泡形成。4