硕士研究生毕业论文答辩

,LOGO,南昌大学医学院硕士研究生毕业论文答辩会,,LOGO,欢迎各位专家光临指导 研 究 生 严青春 导 师 熊小亮 副教授 专 业 病理学与病理生理学 研究方向 肿瘤病理,NF-B抑制剂PDTC对TRAIL诱导人Burkitt淋巴瘤细胞株Raji细胞凋亡的影响,Effect of NF-B inhibitor PDTC in TRAIL induced Burkitts lymphoma Raji cells apoptosis,,LOGO,目录,材料,方法,结果,讨论,结论,引言,,LOGO,引言,,LOGO,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 tumors necrosis factor (TNF)-related apotosis inducing ligand, TRAIL ，是新发现的肿瘤坏死因子TNF家族成员，它能够选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡，但不影响正常体细胞的生长分化，故而应用重组TRAIL进行肿瘤治疗已引起人们极大的兴趣。,,LOGO,重组TRAIL能诱导多种白血病、肺癌、胃癌等细胞株凋亡，并且呈时间和剂量依赖性。但是后来的研究发现，部分肿瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡作用并不敏感，且TRAIL重复作用会导致某些敏感细胞对TRAIL产生获得性抗性，这与TRAIL介导的复杂的生物学功能有关。,,LOGO,TRAIL蛋白,广泛表达于人体组织,TRAIL的受体结合区与Fas同源性高达23. 2,有五个受体：TRAILR1（DR4）、TRAILR2（DR5）、TRA IL-R3（DcR1） 、TRA IL-R4（DcR2）、OPG。,包括胞外区、跨膜区及胞内区三个部分,由281个氨基酸残基组成的分子量约为32.5kD的型跨膜糖蛋白,TRAIL,,LOGO,TRAIL胞内信号传导,,LOGO,核转录因子B (nuclear factor-kappa B）,与Rel家族有较强的同源性，所以又称为Rel/NF-B家族,有多个成员如：Rel(p65）、RelB、C-Rel、NF-B1(p50)、NF-B2(p52)等,静息状态通常与其抑制物IB结合成三聚体存在于胞浆中。在刺激因子作用下，NF-B二聚体释放并发生核易位。,除与机体的免疫应答、炎症反应密切相关外，还可调控细胞增殖和凋亡相关基因参与肿瘤的生长调控。,NF- B,,LOGO,NF-B在TRAIL凋亡信号传导过程中的作用,,LOGO,本课题研究内容,预实验,MTT,TUNEL,Western,预实验确定TRAIL及PDTC使用浓度,MTT检测不同浓度TRAIL、PDTC单独及联用时对Raji细胞的生长抑制率,TUNEL检测TRAI、PDTC单独及联用时Raji细胞凋亡情况,观察不同浓度TRAIL、PDTC单独及联用时DR4、DR5、及核内NF-B的表达,吡咯二硫代氨基甲酸盐（PDTC ）为NF-特异性抑制剂,,LOGO,材料,,LOGO,,LOGO,TUNEL试剂盒,核蛋白抽提试剂盒、PMSF、EDTA,DMEM粉剂、FBS、PMSG HCG,western blotting相关试剂、硝酸纤维素膜、超敏发光液,主要试剂,人重组TRAIL蛋白吡咯二硫代氨基甲酸盐（PDTC）,,LOGO,细胞株,EBV阳性的人Burkitt淋巴瘤细胞株Raji细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。,,LOGO,方法,,LOGO,Raji细胞，用含l0 灭活小牛血清的RPMI-1640培养液，在常规5CO2，37饱和湿度下培养，3d 传代1 次。取对数生长期细胞用于实验。,一、细胞培养,,LOGO,二、实验分组,1.细胞对照组2.TRAIL（100ng/ml）组 3.TRAIL（10ng/ml）组 4.TRAIL（1ng/ml）组 5.TRAIL（1ng/ml）及PDTC（100mol/ml）组 6.TRAIL（10ng/ml）及PDTC（100mol/ml）组 7.TRAIL（100ng/ml）及PDTC（100mol/ml）组8.PDTC（100mol/ml）组,,LOGO,对数生长期细胞,1105,种板三块，每孔90 l。再加入不同浓度药物补足100 l实验分组如上。,培养箱中分别培养12h、24h、48h,培养箱中孵育4h后每孔加入100 l三联液,全自动酶标仪测570nm处吸收值。,计算细胞生存率及抑制率并采用Weeb系数 判定联合用药的相互作用,三、四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测不同时间不同处理因素作用下Raji细胞的生长情况,离心3min后弃上清，每孔各加入180 l1640液及20 lMTT液,混匀,培养箱中放置24h,,LOGO,PBS，5min 2,0.2%Triton X-100中处理5min,PBS,5min2,加100L TdT酶,加100L 2SSC室温15min,0.3%的H2O23min,四、 TUNEL方法检测不同处理组细胞凋亡,收集细胞并涂片自然干燥后4多聚甲醛中固定25min,滴加100L Equilibration Buffer室温平衡5min,吸去多余液体,37 60min,PBS,5min3,PBS,5min3,100LStreptavidin-HRP5min,PBS5min3,DAB显色,复染、透明、封片,显微镜下观察并拍照、计算凋亡指数,,LOGO,阳性结果判定： TUNEL标记后， 凋亡Raji细胞核呈棕黄色。 阴性对照： 不添加TdT酶，其余与实验组步骤完全相同。 HE染色、光镜观察： 凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞 表面有“出芽”现象。 计算凋亡指数(Apoptotic index, AI) ： 数4个高倍视野，分别计算凋亡细胞和总细胞数， AI（%）=凋亡细胞数/总细胞数100%,质量控制,,LOGO,五、 免疫蛋白印迹,离心收集 不同处理24 h 后各组细胞,每管加3ml， 4PBS 并吹打成悬液,离心，去上清3次,每管细胞加400 l含PMSF的裂解液，冰上充分裂解（30min）,4 12000rpm离心5min,收集上清并分装保存 于20 冰箱中同时测蛋白含量,总蛋白提取示意图,,LOGO,核蛋白提取试剂盒操作示意图,收集不同处理24h后各组细胞,每管加400L预冷的BufferA,剧烈振荡15s 后置于冰上15min,加入11L冷BufferB剧烈振荡5s后于冰上1min,剧烈振荡5s后4离心，16000g，5min,收集上清（浆蛋白）后往沉淀物中加入100L冷BufferC,每10min振荡15s,剧烈振荡15s置于冰上40min,每管加3ml， 4PBS 并吹打成悬液,离心，去上清3次,4 16000g离心10min,收集上清并分装保存 于20 冰箱中同时测蛋白含量,,LOGO,western blotting检测膜蛋白DR4、DR5及核内NF-B蛋白的表达,从20 冰箱中取出蛋白样,沸水中煮5min,,LOGO,,LOGO,统计处理,计数量资料采用s表示, 进行方差分析，组间比较用LSD法Western Blotting图片用Imagetool软件进行灰度值分析,行单因素的方差分析用SPSS13.0软件对数据进行处理以P0.05有统计学意义, P0.01有显著统计学意义,结果,,LOGO,培养12 h后细胞单个呈圆形，透亮，悬浮在细胞培养液中：24 h后，细胞圆形，透亮，悬浮在培养液中，三两个细胞开始出现抱团现像，48 h后，细胞抱团现象普遍。,Raji:12h 1025,Raji:24h 1025,Raji:48h 1025,3.1体外培养Raji细胞形态学观,,LOGO,3.2单用TRAIL、PDTC、TRAIL联合PDTC对Raji细胞的生长抑制作用及两药联用时的协同作用分析,表3.1各组不同时间点Raji细胞抑制率的比较（s，）Tab3. 1 Inhibitory rate of Raji cells in every group at different time points（s，）,*P0.01，联合用药组与相同浓度TRAIL单用及PDTC组比较； P0.05，与同组12h、24h比较。,,LOGO,表3.2 各联合给药的相互作用分析（%）Tab 3.2 The interaction analysis of every TRAIL co-treated with PDTC group,采用Weeb系数 来判定联合应用PDTC的相互作用，预估效应CAB，其中A、B分别指两药单用时的细胞生存率。当实际生存率70 预估效应时，联合处理即表现出协同作用。,,LOGO,3.3单用TRAIL及TRAIL联合PDTC对Raji细胞 的诱导凋亡作用,HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。,附图3.28 TRAIL（10ng/ml+PDTC100mol/ml）作用24h后HE染色(400),附图3.28 TRAIL（100ng/ml+PDTC100mol/ml）作用24h后HE染色(400),,LOGO,附图3. 22 阴性对照(250),附图3.17TRAIL（10ng/ml）作用48h后 TUNEL检测(250),经TUNEL法染色和苏木素复染后，非凋亡细胞核呈蓝色，而凋亡细胞核内可见染成棕黄色颗粒状的凋亡小体。,,LOGO,附图3.20TRAIL（10ng/ml+PDTC100umol/ml）作用48h后TUNEL检测(250),附图3.21TRAIL（100ng/ml+PDTC100umol/ml）作用48h后TUNEL检测(250),,LOGO,3.3 各组不同时间点Raji细胞凋亡指数的比较（s，）Tab 3.3 The apoptosis index of Raji cells in every group at different time points（s，）,*P0.01，联合用药组与相同浓度TRAIL单用及PDTC组比较； P0.05，与同组12h.24h比较；P0.05，与细胞对照组比较。,,LOGO,1 2 3 4 5 6 7 8,-actin (42KD),DR5(60KD),1.细胞对照组 2.TRAIL100ng/ml组 3. TRAIL(10ng/ml)组 4. TRAIL(1ng/ml)组 5. TRAIL(1ng/ml)+PDTC(100mol/ml组6. TRAIL(10ng/ml)+PDTC(100mol/ml)组7. TRAIL(100ng/ml)+PDTC(100mol/ml)组 8. PDTC100mol/ml组* P0.01 ：与对照组比较，P0.05：与对照组比较，,不同处理组DR5蛋白水平,3. 4 western blot检测结果,*,*,*,*,,LOGO,-actin (42KD),1 2 3 4 5 6 7 8,DR4(57KD),不同处理组DR4蛋白水平,1.细胞对照组 2.TRAIL100ng/ml组 3. TRAIL(10ng/ml)组 4. TRAIL(1ng/ml)组 5. TRAIL(1ng/ml)+PDTC(100mol/ml组6. TRAIL(10ng/ml)+PDTC(100mol/ml)组7. TRAIL(100ng/ml)+PDTC(100mol/ml)组 8. PDTC100mol/ml组* P0.01 ：与对照组比较，P0.05：与对照组比较，,*,*,*,*,,LOGO,-actin (42KD),NF-B(65KD),1 2 3 4 5 6 7 8,不同处理组NF-B蛋白水平,1.细胞对照组 2.TRAIL100ng/ml组 3. TRAIL(10ng/ml)组 4. TRAIL(1ng/ml)组 5. TRAIL(1ng/ml)+PDTC(100mol/ml组6. TRAIL(10ng/ml)+PDTC(100mol/ml)组7. TRAIL(100ng/ml)+PDTC(100mol/ml)组 8. PDTC100mol/ml组* P0.01 ：与对照组比较，P0.05：联合用药组与相同浓度TRAIL单用药组比较,*,*,*,*,*,*,,LOGO,讨 论,,LOGO,1. TRAIL对肿瘤细胞的作用研究,,LOGO,本实验结果显示,小剂量（1、10ng/ml）的TRAIL促进Raji细胞增殖； 100ng/mlTRAIL抑制Raji细胞生长，但作用不明显； TRAIL联合100mol/mlPDTC后， Raji细胞的增殖活抑制率动明显较TRAIL及PDTC单独作用时高； Weeb分析的结果表明10ng/ml、100ng/mlTRAIL联合PDTC对Raji细胞的增殖的抑制作用均具有协同效应。由此看出：PDTC能增强TRAIL对Raji细胞的杀伤作用。NF-B在TRAIL诱导凋亡信号传导过程中是起负向凋节作用的。,,LOGO,2. PDTC是通过增强TRAIL的诱导凋亡作用来增加Raji细胞的抑制率,在肿瘤治疗中，选择性增加肿瘤细胞促凋亡基因的活性和或抑制抗凋亡基因的表达，不仅可以加强化疗药或放疗的疗效，还可以减少其毒副作用。因此选择性地诱导肿瘤细胞凋亡同时减少健康组织的凋亡，已成为目前肿瘤治疗学研究的一个热点并有望成为未来治疗肿瘤的新方法。,,LOGO,100ng/ml，TRAIL能诱导Raji细胞凋亡，但是效果不佳；TRAIL联合PDTC作用后，细胞凋亡指数明显较TRAIL及 PDTC单独用药组高： 与MTT的结果具有一致性。 由此说明：PDTC是通过增强TRAIL的诱导凋亡作用来增加Raji细胞的抑制率。,本实验结果显示,,LOGO,研究表明：TRAIL通过与死亡受体结合诱导细胞凋亡。在37时，TRAIL与DR5的结合力最高。TRAIL的信号传导中可激活NF-B.,3. NF-B在TRAIL诱导Raji细胞凋亡中起负凋节作用,,LOGO,随着TRAIL浓度的增加，DR4、DR5逐渐增加，加入PDTC同时作用后，DR4、DR5表达量较TRAIL单独作用时无明显变化，死亡受体的表达不参与PDTC增强TRAIL对Raji细胞诱凋亡作用过程。相同TRAIL浓度作用下，DR5表达量明显较DR4高，这验证了Treneh 等的研究。,本实验结果显示,,LOGO,TRAIL作用前，核内NF-B亚单位蛋白p65为零表达，作用后，核内有NF-亚单位蛋白p65蛋白表达，并且随着TRAIL剂量增加，表达量也增加（p0.05）。TRAIL联合PDTC作用后时，核内NF-B的量亚单位蛋白p65相对TRAIL单独作用时表达量却逐渐减少单独作用时表达量却明显减少（p0.05）。,,LOGO,结 论,,LOGO,1.TRAIL对Raji细胞的生长具有抑制作用 ，但作用不敏感。NF-B抑制剂PDTC能显著增强TRAIL对Raji细胞的抑制作用。2. TUNEL试剂盒检测结果显示PDTC能显著提高TRAIL对淋巴瘤细胞的杀伤作用，此协同作用主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现。 3. TRAIL通过与死亡受体结合来启动凋亡信号通路,TRAIL在诱导凋亡的信号传导途径中激活了NF-B,而NF-B在TRAIL诱导Raji细胞凋亡中起负凋节作用，此正是Raji细胞对TRAIL作用不敏感的机制之一。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithioearbamate，PDTC）通过抑制NF-B