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基于质谱的蛋白质组学技术在微生物鉴定中的应用Application of Proteomics based on Mass Spectrum in the microorganism identification / classification文/马庆伟 程肖蕊 博扬生命科技有限公司电话：01082608397；E-mail：微生物这类非常微小而又种类繁多的生物与我们的生活息息相关，近20年来，新的传染病不断出现，如传染性非典型肺炎（SARS）、艾滋病（HIV）、军团菌病、莱姆病（Lyme）、埃博拉出血热（Ebola）、拉沙热（Lassa）、O139型霍乱、致病性大肠杆菌O157:H7引起的出血性肠炎、肠弯曲菌肠炎、汉坦病毒、B组轮状病毒腹泻、疯牛病（克-雅氏病）、禽流感等等，这些新传染病的出现严重威胁人类的身体健康，给人类社会带来了难以估量的后果。同时，随着经济贸易的全球化，国际旅游业的飞速发展也加速了一些传染病的全球化进程，加快了新发传染病的传播速度，也使一些过去得到控制的传染病如结核、多抗药性的链球菌属感染等重新蔓延。当然，除过病原菌以外，腐败菌、有益菌及环境微生物等与我们的健康和生活亦密切相关，这种微生物的多样性为全球制药产业、环境治理、食品工业以及生物技术的发展提供了丰富的资源储备，同时也对人类的健康构成极大的威胁，所以快速、准确鉴定微生物日益成为临床、环境和工业领域的迫切需要，各个国家从来都是不遗余力的在建立、健全菌种资源保存库的同时，积极研究开发快速、准确鉴定微生物身份的新技术和新方法，致力于建立健全微生物资源保存库和鉴定标准库，在临床上为传染病的快速筛查、检测、分离、鉴定、追踪、预警、治疗和预后具有重要意义。目前，尽管微生物鉴定系统实现了鉴定过程的规范化和程序化，将微生物对底物的生化类型与已建立数据库类型相比较来鉴定微生物，但其反应准确性受接种物浓度、孵育条件和试验解释等的影响。自20世纪8090年代以来，微生物鉴定系统不断发展，自动化程度不断提高，尤其是基于质谱技术的蛋白质组技术和代谢组技术在微生物研究领域的介入，使得微生物鉴定达到了快速、准确、大规模、高通量的水平。一、微生物鉴定系统方法的发展（一）微生物鉴定的传统方法微生物传统的鉴定方法是建立在微生物的形态学、生态学、细胞生理和生化以及基因的基础上的，主要包括以下几类：1.生化方法该法检测微生物实际上是测定微生物特异性酶。由于各种微生物所具有的酶系统不完全相同，对许多物质的分解能力亦不一致。因此可利用不同底物产生的不同代谢产物来间接检测该微生物内酶的有无，从而达到检测特定微生物的目的。2.免疫学技术免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应，观察和研究组织细胞、特定抗原(抗体)的定性和定量技术。各种形式的免疫分析方法如放射免疫分析(RIA)、酶联免疫分析(EIA)、间接酶联免疫吸附(ELISA)、荧光免疫分析(FIA)、生物发光免疫分析(BIA)、化学发光免疫分析(CIA)等，直接检测微生物或通过间接检测微生物的成份及微生物代谢产物(如毒素)检出微生物。各大文献数据库提供的数据显示，几乎建立了所有病原体的血清学检测方法，表明该方法也成为了一种实验室常用的成熟的检测技术。3.分子生物学及分子遗传学方法分子生物学及分子遗传学学科的发展，使人们对微生物的认识逐渐从外部结构特征转向内部基因结构特征，微生物的检测也相应的从生化、免疫方法转向基因水平的检测。主要有核酸的碱基组成如DNA中G+C mol%含量测定等，核酸的分子杂交如DNA-DNA/rRNA杂交分析、核酸分子探针杂交等，限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP），电泳核型（EK）分析，随机扩增多态性DNA（RAPD）分析，rDNA序列分析，多位点酶电泳（mutilocus enzyme electrophoresis, MEE），16srDNA 、18SrDNA、26SrDNA D1/D2测序鉴定分析等，分子生物学与免疫学相结合的方法则有免疫PCR和PCR-ELISA等。4.生物传感器生物传感器是将新兴的传感器技术和分子诊断技术相结合而成的一种新技术。由于生物传感器检测准确、操作简便等特点，近年来已经在许多领域取得了很大的进展，在生物分子相互作用、药物筛选、临床诊断、食物检测等领域获得了广泛的应用。其中临床中用于病原体检测的以DNA生物传感器最为常见。5.色谱技术色谱技术是以化学分析手段为基础的研究微生物的方法，主要用于细菌的的化学分类。（二）微生物鉴定自动化仪器的应用目前，用于微生物鉴定系统的自动化仪器一般可以分为两大类，一类是根据表型（主要指新陈代谢途径）来鉴定，另一大类是根据基因来鉴定（现在比较流行的是根据16sRNA的基因来分类鉴定）。根据表型鉴定原理来提供微生物鉴定系统的公司主要有比较著名的法国梅里埃，美国Biolog、Sherlock等，根据基因鉴定原理提供产品的公司有美国的杜邦公司和美国应用生物系统公司（ABI），比较成功的例子见表1。2004年美国药典分析微生物学专家委员会Scott V.W.Sutton等人对各种微生物鉴定技术做了比较和评论见表2。从表2可以看出，由曼彻斯特都市大学和NTTC共同开发MALDI TOF MS plus MicrobeLynx系统建立的数据库规模包括有大约3500个光谱条目，覆盖100余个属400余种，该结果表明，MALDI -TOF MS介入微生物鉴定系统的优势和所取得的卓越成果已初露端倪。表1 微生物鉴定系统及其反应原理系统反应分析阳性结果显示系统例子pH基础反应（多为1524hr）碳源利用pH指示剂颜色变化；碳源产酸、氮源产碱API;Crystal;VITEK;Micro Scan酶谱（多为24hr）微生物已有的酶无色复合物被适当酶水解时，色源/荧光源释放引起颜色变化Micro Scan;IDS(Remel)碳源利用有机产物因转移电子至无色四氮唑标记碳源使染料变为紫色Biolog挥发或非挥发酸检测细胞脂肪酸以检测代谢产物为基础的层析技术，与数据库中的资料相比较MIDI生长可见检测不同底物微生物利用某一底物产生浊度酵母样菌鉴定表2 微生物鉴定系统数据库规模和表型/基因型分类系统分类数据库规模评论Vitek表型800+种细菌和酵母以临床微生物见长Microlog表型1900种好氧和厌氧细菌、酵母和真菌以环境微生物见长Sherlock MIDI表型2000个条目，包括好氧和厌氧细菌、酵母广泛适用MALDI TOF MS plus MicrobeLynx表型大约3500个光谱条目，覆盖100余个属、400余种由曼彻斯特都市大学和NTTC共同开发RiboPrinter基因型6000个基因指纹模式，归属197个属、1400余种典型微生物和提交的分离物MicroSeq 16S rRNA基因测序细菌鉴定基因型细菌全基因和500bp库，1400个条目广泛覆盖G-非发酵菌、杆菌、棒状杆菌、分枝杆菌和葡萄状球菌MicroSeq D2 LSU rDNA真菌鉴定基因型900个酵母和丝状真菌条目在临床和环境真菌方面不强（三）微生物鉴定的新阶段-MALDI BioTyper从以上微生物鉴定的传统技术以及基于传统的生理生化和基因基础上的自动化仪器技术来看，它们均需要经过培养繁殖、分离纯化等步骤，然后再根据表型和基因型来进行鉴定，但是由于微生物群落及其生存环境的复杂性，目前自然界中只有极少部分微生物能够得到培养，这严重阻碍了对微生物验明身份即鉴定的研究，也严重阻碍了对微生物生命活动规律的研究和微生物资源的开发。而且就这些方法的本质来看，都是建立在已知的生理生化指标上的，其鉴定能力很有限。虽然随着越来越多的致病微生物和模式微生物基因组全序列测定的完成，基于基因组学的技术也应用于微生物的鉴定系统，但要想通过基因序列，按传统的方法彻底研究海量数据的微生物基因的产物仍非易事，从已经完成测序的一些微生物来看，有许多开放读码框架（ORF）无法确定其功能，人们意识到有必要重新回到蛋白质的水平上来研究微生物，这就需要有一种高灵敏度高通量的大规模蛋白质研究手段，于是微生物“蛋白质组（proteomics）”研究应运而生。作为“蛋白质组”支柱技术的MALDI-TOF-MS得到了极大的发展，尤其是为微生物鉴定研发的CLINPROTTM中的MALDI BioTyper系统以经推出，就受到微生物鉴定和分类领域热烈的迎取，在这方面表现突出的当属德国微生物菌种保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ）。DSMZ是德国生物材料资源中心，现今储藏并维持着大约14000培养物，代表着不同种类微生物6900种，包括古菌、细菌、酵母和真菌。CLINPROT BioTyper除了被DSMZ用于微生物鉴定和分类的研究外，还被用于微生物种质的质控以及不同微生物系统发生的研究。下面将这种崭新的快速、方便并经济的鉴定微生物菌株的新一代技术作一概述。二、基于质谱的蛋白质组学技术在微生物鉴定中的应用1. 基于质谱的蛋白质组学技术MALDI BioTyper - 微生物鉴定和分类系统概述对于基于质谱的蛋白质组学技术MALDI BioTyper系统在微生物鉴定和分类中，可完成三个方面的工作：对于一系列已知微生物，可获得MALDI-TOF MS数据库，即建立已知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库；对于未知微生物，则制备未鉴定微生物样品，利用MALDI-TOF MS获得质谱数据，再采用提供的软件包，将获得的质谱数据与已知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库进行比较，以鉴定具有相同或相似质谱数据的已知微生物，再建立未知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库；采用提供的软件包工具，可以利用已建立的已知和未知微生物标准蛋白质组指纹质谱数据库用于临床、环境、工业未知样品的鉴定。这方面的工作是在质谱采集谱图后，由BioTyper软件进行微生物如细菌、酵母、真菌等的鉴定、分类和去冗余（dereplication）。BioTyper分析软件整合了质谱操作功能和鉴定以及分类的功能，用户可以自定义滤波（Smoothing）处理参数、数据衰减或基线校正，所以所得结果是专业的峰列表。用于鉴定未知微生物的模式匹配是通过比较所产生的峰的列表同含有种和亚种特征谱图信息的谱图库比较而获得。软件自动产生峰列表并提取代表一个种群的一定数量谱图的典型峰。未知微生物的鉴定是通过将它们独特的峰列表和数据库比较而完成的，由质谱测得的质量和强度相关性产生匹配分值，并用匹配分值来给结果定级（见图1）。MALDI BioTyper能够通过一个复杂的校正运算对谱峰质量偏差进行校正，从而增加数据库搜索的可信度。在获得峰后，软件可以设定一个公认的起始误差窗口和一个期望的调整结果，在调节范围内将一个新的峰列表校正为一个已知的峰列表，对偏离了5000ppm的质谱图都能够成功鉴定。对于系统树的去冗余、聚类和产生，MALDI BioTyper通过模式匹配计算库中所有主要谱图的相似性，这些谱图各自具有独特的谱峰，采用这个相似分值可以构建系统树；根据主成分分析，可以对一套谱图进行自动多变量分析（见图2）；可获得基于主成分计算基础之上的多种多样的聚类计算和可视化系统树（见图3）。 图1微生物鉴定的典型结果*绿色表示最好的匹配峰，黄色表示与寄生者匹配的峰，红色表示不能与参考或对照峰匹配，表格表示评价分级结果的输出格式。Image 1: Typical identification result. Green marks the perfect matching peaks, yellow marks the peaks matching in broader boarders, red peaks did not match within the reference spectrum. The table gives an impression of the output of the evaluated ranked results图3 基于鉴定分值的系统树图Image 3: Dendrogram based on identification score values图2 6种假单胞菌的第一个3主成分分值3D分散图Image 2: 3D scatter plot of the first three principle component scores for six individual species of the genus Pseudomonas2. 基于质谱的蛋白质组学技术MALDI BioTyper的技术路线蛋白质组指纹图谱法建立微生物鉴定标准库，不是基于微生物的生理生化指标和基因，而是根据微生物的蛋白质组表达谱的比较来进行的，因此更为准确和直接。采用MALDI BioTyper对微生物鉴定和分类研究的一般工作流程是一个直线性路径(见图4)。它从一个单克隆或其它生物材料开始，样品可以在几分钟内被分析。每个样本的自动谱图获取可以在几秒钟内完成，并且可以实现数据向专门鉴定软件的无缝传输。图4 微生物鉴定/分类的一般流程Fig. 4: General workflow for microorganism identification / classification该操作流程包括以下步骤，即选择未知微生物、取微生物在MALDI点靶、产生MALDI-TOF特征峰、BioTyper数据解析、获得鉴定物种，见图5。 样品制备各种细菌（革兰氏阳性/革兰氏阴性）、酵母、真菌、孢子都可以作为样品，多数简单的样品分析从将少量生物材料直接放置到MALDI-TOF靶盘开始。初始材料可以是一个单克隆或者液体培养基离心的一个组分。一个标准的钢靶上需要大约105个细胞，103个孢子，微生物薄膜用基质(-氰基-4-羟基肉桂酸；HCCA)覆盖，并在空气干燥。 MALDI-TOF测定质谱谱图用MALDI-TOF质谱仪以线性正性模式用最大频率(20-200Hz，依赖于仪器)采集。谱图的测量质量范围是2000-20000Da。谱图自动获取可以用Brukers autoExecute软件用激光强度的模糊控制来进行。在microflex、autoflex 、或ultraflexMALDI-TOF质谱仪上皆夸我高度重复的快速测定。图5 微生物鉴定/分类的技术路线Fig. 5: protocol for microorganism identification / classification 谱图数据的软件分析对于MALDI-TOF MS采集的质谱图，需要用软件BioTyper或者用于FLEX系列的COMPASS 和 flexAnalysis进行分析，才能解读谱图所蕴含的生物学信息，从而进行微生物的鉴定和分类。基于质谱的蛋白质组技术MALDI BioTyper-微生物鉴定和分类系统与传统的的方法以及现在主要在用的自动化仪器相比，具有操作简单、快速；重复性强；灵敏度高；准确度好；自动化和高通量等特点。三、基于质谱的蛋白质组学技术在微生物鉴定中的应用进展MALDI-TOF MS 细菌鉴定为许多领域提供了对于传统方法来说更优越的选择，如环境研究、食品和水质控制、微生物储藏的质量控制、兽医和医学