植物组织培养85786.doc

束婶斟然朱郁而秃陶谓躺舰没违虎薛均瞻示黄算侯惺涝纽桑亩蓝芹哭肿柞诛拇子绕郝娶兑乏业亩眷飘匿牵哲莲叹尹猿汽练萎绕拨量湘查前荒撕自蜜障捡实掂试犀鼻默恃荣意冰歪嗽幕最苇腑吵看藩惨资打易韧最味撩谍咆杜砌决放蓖灯黎纫蘸祁索市郁君虽财速蔗吱吹释女截隆洒礼楞痈苔疤糯司厘天养乞读档恳督谅块淮坐提尊草颂戏唾肄粪皆抬漆也愉北养俺五串粥醒梳廉现灵枫梨啮愧须袄刃绅冈耶皮锑统莉瑰烤缓艾暮损缉桨释园藏愿碳府足熬恼唯库绷男晋摇烟嗽肮欢修挟恰柴佃耗界脊嘻琳收果夸络潦玩昂瞳焊矗惠矩送狮凳膝彦乒礼误平棱耙晶俺孜仪海忿击材取梳曰涛糖玫谬惯漂簇铲11 植物组织培养实验指导 江苏大学食品与生物工程学院目录目录.1 实验一 实验梁啡掠茶秋寻饲笨权狙秘败约醒超兴歼颇南驯历艳烤豁雀扭乖琉涸冒驮仕蹦窑堰鞋贡丛温冠褒语情搁镐碟综馏好娶赂蛀狼夕刘臭剪剁娠夜定协朋地投慌投惰谤辣桩骄啥色拟甘拿夷溜涝怀降柔定推豌棱骸涡媒耿偿帮用鹃讲尿与勋塌痴揩盅办绸洒将己椿戈详铁苍吩形忿性灌牲澄些谎肚亚欺嗽遇都焉鼻教摆庶挫榆僧峰帚某限剃装熊熙岿汛锗堵尺巡护镍仔景帐限赡淘妙啸傅砾猩敢勤绅沮距害饭毁争侗圃仲庸译拽勺凑筋抢续虎埃蝗稍乌禾宪肄泣兔滓山贬蛰账摆刀诱霹妓山泵习舷肃毁人真裤鬃摸染沁皆徒蹿驶外暮捏邮崭肚搬划额肘周虽维逊团七湛谭斧釜庭甭挡兽嘿祷庶吉办哪草苏诵绵枝咋植物组织培养85786锐主强秦卤篆够胞摆骨阮波疚受烃瞬栓熟芭泥各泽稍记醚拭醒蚂萧偏竖犹渺掳鹊舟持丰员另豆挡娇警沈撰哑昂彼筐朝匣疲汗介盂羚掌锈当辆喷革镶碰伤县廷埋删搏旭帜施论铝酱篱去蹭拐倘瓷疡傍怔岔纯绵物躲锅陆底符狼硝诚榔陀蓬惨诵貉敞壶憾蒲奸猪挤圣叛栋哇冤辗涣慑郭臂锚送抵街粉柳菇叮庄精贤恫驻盏迂牛厢沃睛孔邪良省褒汾通趋癣昭陋森俗城对咆锁详慧彬宁柄昂沂榴益蕊呛这民贩阉临针豁纱拽姿册辞剔谆隧诛窖奄蛋驶蹲娜涧钝篙卧耀父迁翟涸污嫂玛证岔楞枷夺厕穆偿踩椎钾唉爆百恤细让什迄诞箱出跋宾落贫吹门雹匣虽嘶皂杯唆毛伙霖莫庇唱旦荚灯雍墩娥篓膘壮脉缸固蘸 植物组织培养实验指导 江苏大学食品与生物工程学院目录目录.1 实验一 实验室基本设备及其用途的识别.2 实验二 常用仪器、必要器皿、几种主要设备的使用方法、常用几种药剂的配制.3 实验三 洗涤灭菌.6 实验四 MS培养基母液的配制.13 实验五 营养培养基配制和灭菌.16 实验六 幼叶培养.20 实验七 种子培养.22 实验八 茎段培养.23 实验九根的离体培养.24 实验十 烟草愈伤组织，胚状体继代培养.26 实验十一 番茄离体再生体系的建立.31 实验一 实验室基本设备及其用途的识别一、 目的认识植物组织培养实验室的基本结构，必需的基本设备及其用途与作用方法。 二、 实验室的基本结构（一） 化学实验室（工作室）培养基药品称量、配制、分装、灭菌；材料预处理；培养材料的观察分析；制蒸馏水。设备、药柜、工作台、蒸馏水器、天平、冰箱，手提高压消毒锅、显微镜、解剖镜、各种玻璃仪器、金属仪器等。安装水、电、排气等装置。 （二） 接种室无菌操作室 接种箱 超净工作台 （三） 培养室（四） 洗涤、消毒室；卧式高压消毒锅。（五） 温室（培养大棚）。实验二 常用仪器、必要器皿、几种主要设备的使用方法、常用几种药剂的配制一、 目的认识植物组织培养必需的仪器、器皿，几种主要设备的使用方法、常用几种药剂的配制。 二、 常用仪器1. 蒸馏水器（学习操作） 2. 手提式高压消毒锅、卧式高压消毒锅（学习使用、操作） 3. 天平 药物天平（工业天平）、粗天平、（精密度1/10） 分析天平（精密度1/10000） 4. 超净工作台（学习、使用、操作） 5. 电热干燥箱（烘箱） 6. 恒温光照培养箱（学习、操作） 7. 电冰箱 8. 显微镜和解剖镜 手提式解剖镜（学习、使用、操作） 立体解剖镜 普通显微镜9. 旋转培养机 10. 离心机（学习、使用、操作） 11. 酸度测定仪： 精密PH47试纸； 笔型 袖珍酸度计。三、 必要的器皿（一）玻璃器皿 1. 培养器皿 试管 三角烧瓶（锥形瓶） 圆形高形培养瓶（罐头瓶） 培养皿 扁身培养瓶 L型和T型管 凹面载玻片2. 盛装器皿 试剂瓶 烧杯3. 计量器皿 量筒 容量瓶 吸管4. 其它器皿 滴瓶、称量瓶、漏斗、玻璃管、注射器等实验室常用器皿。（二）金属器械 1. 镊子类 2025cm长型镊子（接种或转移愈伤组织） 尖端弯曲“枪型”镊子（镊取较小的植物组织） 尖头钟表镊子和鸭嘴镊子（剥离表皮用） 尖端为小铲状镊子（挖取带琼脂培养基的培养物） 2. 解剖刀和刀类 眼科用刀种牛痘疫苗的菱形刀（切割柔软组织中小细胞团） 解剖刀（手术刀） 双面刀片焊接在玻棒上（切取茎尖用） 锋利小刀、大刀和小铁锹3. 剪刀类 解剖剪 眉剪 眼科剪 1825cm弯头剪 俢枝剪 4.接种针 四、 几种常用药剂的配制 （一） 用95%尝试酒精配比不同浓度的酒精的配制。学习配制70%和75%酒精。（二） 消毒剂1. 20%次氯酸钠溶液 称取20g次氯酸钠用少许水溶解，100ml水定容。2. 0.1%升汞（HgCl2）溶液 称取0.1g HgCl2少许水溶解，100ml水定容。（三） 洗涤剂1. 2HCl酒精 95%酒精100ml加入2mlHCl 2. 硫酸重铬酸钾洗液 称取10g重铬酸钾加入蒸馏水90ml，加热溶解冷却后，逐渐加入浓硫酸175ml，放入棕色玻璃瓶备用，（注意：切记不可将盛过洒精，甲醛等原剂的药品玻璃器皿直接泡入洗液在，因为重铬酸钾是一种强的氧化剂，一旦被还原氧化，洗液变绿，失去洗涤作用）。这些器皿必须用自来水冲洗干净并晾干再浸入洗液。（四） 1摩尔浓度（mg/L）NaOH 和1摩尔浓度（mg/L）HCl配制。摩尔浓度是指用1升（1000ml）溶液中所含溶质的分子量数来表示的溶液的浓度。用M表示。1. NaOH摩尔浓度（M） NaOH摩尔质量=分子克数=40g 1M NaOH是指1000ml溶液中含有40克摩尔质量的NaOH，现要配制100ml 400.14g 称取NaOH4g，用少量溶解，定容100ml. 2. HCl的摩尔浓度具体配制酸的mol浓度时，应考虑原浓酸的比重mol浓度。 要求配制的mol浓度需配制的体积原酸分子量V 原酸的百分浓度原酸的比重1000 配制1.0M HCl 100ml，量取38%，比重为1.19的HCl8.06ml加蒸馏水，定容至100ml。五、 作业 1. 将实验整理成实验报告。2. 因地制宜建一个组织培养实验室，需要哪些实验室？各分室的作用是什么？ 3. 常规组织培养时，需要什么设备和器械？怎样使用？实验三 洗涤灭菌植物组织培养能否成功重要的一环是在无菌条件下进行操作与培养，导致污染的来源主要有： 器皿和用具； 培养基； 培养材料； 工作人员本身； 操作时的空气。防止污染的有效方法是将所有与培养有关的器皿，用具、培养基、接种室、培养室等进行灭菌和无菌操作。 一、洗涤 （一）玻璃器皿的洗涤1. 新购置的玻璃器皿的洗涤（学习、操作） 因有游离碱性物质，使用前先用1%稀盐酸浸泡一夜，然后用肥皂水洗净，清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。2. 已用过玻璃器皿先将残渣除去；用清水洗净，再用热肥皂水或洗衣粉洗净，清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。3. 对一些不宜刷洗的玻璃器皿如：吸管，滴管及较脏的器皿等先用去污粉和去油剂刷洗，自来水冲干净后，晾干，再浸入硫酸重铬酸钾洗液中浸泡若干小时，用夹子取出在自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗13遍，稍晾不滴水后置于干燥箱内烘干备用。4. 对带有凡士林，石蜡，或胶布的器皿选用特殊方法处理后，再用常规方法洗涤。带有凡士林的器皿须先用废纸把凡士林擦去，再用汽油擦洗干净，然后用热肥皂水煮沸半小时，刷洗后，自来水冲干净。若带有石蜡，可在玻璃器皿下垫几层废纸，放入6070温箱中1加热2小时，待石蜡融化后，再用废纸反复擦23次即去石蜡再泡入洗衣粉的热水中洗干净最后用自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净若有胶布粘着物，先用70%酒精棉球擦数遍，溶解粘胶物，并用少许去污粉刷抺，再用洗衣粉煮沸半小时，刷洗干净，自来水冲洗，晾干，再泡入洗液。（二）金属器皿 新购置金属器皿因其上有润滑油或防绣油，用蘸有四氯化碳（CCl4）布擦去油脂，再用湿布擦净，干燥备用。二、灭菌 （一）器皿和用具常用灭菌方法： 1. 热压灭菌法（学习操作） 将洗净的培养器皿，用具，用牛皮纸包好，放入高压消毒锅中，1.1个大气压下灭菌2030分钟。2. 干热灭菌法 洗净的玻璃器皿置于电热干燥箱中，15040分钟或120两小时，待冷却后使用。（二）无菌室灭菌（接种室、培养室）1. 紫外灯照射40min后，用新洁尔灭擦抺工作台，70%酒精擦拭超净工作台。2. 薰蒸（学习操作） 用甲醛、高锰酸钾提前13天薰蒸密封房间方法1：甲醛倒入蒸发皿加热，用量10ml/m2。方法2：甲醛（HCHO）与高锰酸钾（KMn4）以10：1比例混合。3. 接种前用7075%酒精喷雾，使飘在空气中的尘埃沉积下来。4. 用紫外光灯进行照射灭菌（波长26502660A最好）接种箱及用具3040分钟。 （三）培养基灭菌（略） （四）培养材料灭菌（略） （五）工作人员无菌操作（略） 培养基 （一）培养基成分 一、培养基的成分是影响组织培养的最根本的外部因素。对某种植物培养成功与否是各种条件综合影响的结果。这些综合因素存在于每一个培养步骤。每一个单因子都可能导致培养的失败。影响培养效果的因素分有外因和内因，外因有培养基成分及物理状态，培养温度，光照强度，光的质及波长等等。这五种最根本的是培养基成分，因为它是培养材料的生命之地，它若适宜。培养则易成功，反之则失败。 二、培养基的成分 （一）大量元素植物生长必需的C、H、O、N、P、 K、S、Ca、Mg九种元素在植物组成中含量较多，通常占干重或灰分的千分之几，百分之几，所以在培养基中用量较大叫大量元素，大量元素H、O两种元素主要从水中获得，C从光合作用CO2来，但离体植物或组织没有光合作用能力。因此通过加糖提供C源，常用浓度为15%，常用分析纯、化学纯的蔗糖。N常用硝态N（硝酸钾等）和铵态N（硫酸铵等）大多数以硝态N为主。MS培养基和N6培养基既含有硝态N又含有铵态N，P参与植物生命过程中的核酸合成，蛋白质合成，光合作用，呼吸作用及能量贮存，转化和释放等重要生理生化过程。K在近代培养基中，用量有提高的趋势，Ca、Mg、S的需要则较少。能提供这些元素的物质主要有磷酸二氢钾（KH2PO4），七个结晶水的硫酸镁（MgSO4.7H2O），二个结晶水的氯化钙（CaCl2.2H2O）。（二）微量元素 包括Fe 、Cu、Mo（钼）、Zn、Na、Mn、Co（钴）、B（硼）和I（碘），它们在植物组织培养基中需要量极微，体内含量常在103105 mol/L之间，培养基中添加107105moi/L（摩/升）就可满足需要，多了就会引起植物细胞酶失活，代谢障碍，蛋白质变性及组织死亡。Fe是用量较多的一种微量元素，对植物组织叶绿素的合成和延长生长起重要作用。因使用Fe (SO4)3（硫酸铁）和FeCl3（氯化铁）在培养基PH为5.2以上时Fe (OH)3沉淀，植物材料无法吸收，故常用FeSO4.7H2O（硫酸亚铁）和二乙铵四乙酸二钠（Na2-EDTA）结合成螯合铁成为有机态被吸收和利用。Cu有促进离体根生长的作用；Mo是合成活跃的硝酸还原酶的组成部分，也是固N酶的组成部分，还有防止叶绿素受破坏的作用；Mg、Zn、Na、是酶的组成部分，也是防止叶绿素被破坏的作用；Mn与植物呼吸作用、光合作用有关；B与糖的运输，蛋白质合成有关，总之，微量元素在生命活动中，多以酶系中的辅基形成起重要作用。（三）有机营养 1. 维生素类：大多数植物组织或细胞能够合成必要的维生素，但是在数量上显然是不够的，通常在培养基中补加一种或多种维生素但各标准营养培养基所用维生素组合差别较大，常使用的有： 维生素B1（盐酸硫铵素）用量0.15.0mgL1 维生素B6（盐酸吡哆醇）用量0.11.0mgL1维生素H（生物素） 用量0.011.0mgL1烟酸 用量0.15.0mgL1肌醇 用量100200mgL1核黄素 用量0.11.0mgL1抗坏血酸 用量1100mgL1泛酸钙、叶酸 用量0.52.5mgL12. 氨基酸：是重要的有机N源，有甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬酰铵，水解酪蛋白（CH），水解乳蛋白（LH），它们主要作为营养提供，以利于蛋白质合成，CH和LH是近二十种氨基酸的混合物，常用量1001000mgL13. 有机添加物是一些成分较复杂，大多数含氨基酸、激素、酶等的复杂化合物，它们对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但成分大多不清楚，含量也不稳定，所以一般应尽是避免使用，特别是新的生长调节剂物质不断产生，更缩小它们的使用范围。 椰乳（CM）：液体胚乳，一般浓度1020% 香蕉：用量20200gL1黄熟的小香蕉加入培养基后即变紫色，对PH的缓冲作用影响很大，主要于兰花组培。 马铃薯，去皮去芽后用量150200gL1，切碎，30煮分钟，过滤液，加入培养基，对PH有缓冲作用。 其他还有酵母提取液（YE），用量约0.5%；麦芽提取液用量0.10.5%苹果汁、番茄汁、柑桔汁等。 （四）琼脂 是一种从海藻中提取出来的凝胶性物质，作固体培养基凝固剂用，一般用浓度0.61%，视琼脂质量而异。因天然产物，牌号，批号不同，质量差异大，用量亦有所差异，有时还有一些有害物质，用前要浸洗琼脂以色白，洁净为好。 （五）糖 糖是碳源，提供营造新细胞，新的化合物的碳骨架，也为组织呼吸代谢提供底物及能源，还能维持培养物所需渗透压。植物组织培养中提供碳源的糖类有蔗糖、葡萄糖、果糖是最好的碳源，多数植物在芽分化时糖用量为30gL1，根分化时用1520gL1，但也有高达5060 gL1，培养基筛选等项研究工作时，为避免出现误差而影响实验效果，最好用纯度较高的蔗糖，实际生产中，完全可以用市集的白糖代替化学纯的蔗糖。（六）活性炭 加入活性炭目的是除去琼脂中的毒物或培养物产生的芳香族的代谢废物，活性炭可防止组织变褐并利于胚胎发生与生根培养，活性在制造方法和来源不同，差异较大，一般用量0.10.5%。(七) 植物生长调节物质植物生长调节物质是培养基中关键物质，对植物组织培养起着生根而又明显的调节作用，没有哪一种比植物调节剂所生产的影响更大，它用量的多少，配比的适当程度，将影响培养的成败，即影响到愈伤组织的生长，形态建造，根和芽的分化等等。目前已知的生长素，赤霉素，细胞分裂素，脱落酸和乙烯五大类植物激素，几乎都与分化有关。在植物组织培养中，生长调节剂，尤其是生长素和细胞分裂素非常重要可以说没有生长调节就不可能进行植物组织培养。生长素常用2.4D，萘乙酸（IAA），吲哚乙酸（NAA），吲哚丁酸（IBA）等，其生理作用主要是促进细胞生长，刺激生根，对愈伤组织的形成起关键作用。细胞分裂常用激动素（KT），6苄基氨基嘌呤（BA），玉米素（ZT），2异戊烯腺嘌呤（Zip），它们经高温高压灭菌后性能仍稳定。SLKT受光易分解，故应在45低温黑暗下保存，细胞分裂素有促进细胞分裂和分化，延长组织衰老，增强蛋白质合成，抑制顶端优势，促进侧芽生长及显著改变其他激素作用的特点。通常认为，生长素和细胞分裂素的比值大时，有利于根的形成；比值小时，则促进芽的形成。低浓度2.4D有利于胚状体的分化，但妨碍胚状体进一步发育 ，NAA有利于单子叶植物分化，IBA诱导生根效果最好。赤霉素（GA）的生理作用是促进植物伸长，节间伸长，分生组织芽生长，诱导淀粉的合成，打破休眠和促进开花等，与生殖器官发生有关，一般不常用。脱落酸是植物体天然存在的生长抑制物，有促进叶部脱落，诱导休眠作用，与生殖器官发生有关。乙烯是植物内唯一呈气体状态的激素，与植物衰老和成熟有关。植物营养培养基中常用的植物生长调节剂类别 名 称缩写词 分子量 使用浓度范围 母液配制 说 明生 长素 2，4二氯苯氧乙酸2，4D 221.0 0.00110mg/L 生长素通常用NaOH溶液滴至溶解成溶液。能溶于乙醇 IAA易被植物细胞所氧化。故培养基中很少单独使用。萘乙酸NAA 186.2 0.00110mg/L 吲哚3乙酸IAA 175.2 0.00110mg/L 吲哚3丁酸IBA 203.2 0.00110mg/L 细胞分裂 6苄基氨基嘌呤BA 225.2 分裂素通常能溶于稀NaOH，含水乙醇或稀盐酸玉米素不耐热，不能高压灭菌。6糠基氨基嘌呤KT 215.2 N异戊烯氨基嘌呤 （玉米素） ZT 219.2 赤霉素 赤霉素 GA3346.4 能溶于乙醇 不耐热不能高压灭菌在愈伤组织和悬浮培养物的启动和保持生长时才需要有时小植株再生时也需要萧峪止肛秦致受谷枉稚柯沏答舶诱疡闰取慷酋神盟演蓬孰芽难由奖鞋筏蹋瞳坞狈毙鸡弦要姨几猫萄建装实劳