QC SOP027-色谱柱的使用、维护和保管.doc

上 海 津 力 化 工 有 限 公 司标 准 操 作 程 序部 门： 质量检验部编 码： S0P-QC-027-1题 目： 液相色谱柱的使用、维护和保管页 码： 共 5 页 / 第 8 页新 订：替 代：起草人：审核人：批准人：生效日期：审阅部门：1. 目的：加强液相色谱柱的使用、维护、清洁与保管的管理，保证检测结果的准确性及延长色谱柱的使用时间。2. 范围：所有高效液相色谱检测时所用的色谱柱。3. 责任人：QC主任、检验员对本SOP的实施负责。4. 程序：4.1 液相色谱柱是色谱分离系统的核心部分，装有不同类型填料的色谱柱与相对应的流动相与相对应的流动相形成了不同的分离机制，对绝大多数有机化合物进行分离分析。4.2 根据色谱柱内径的不同，液相色谱柱可分为微径柱、分析柱、快速柱、半制备柱、制备柱等，适用于不同的分离分析目的。常用的普通分析柱，内径通常为4.6mm,柱长1525cm，填料粒径510mm，用于常规的分离。4.3 QC常用色谱柱类型及用途： 4.3.1 普通ODS柱：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，对各种类型的样品均有较好的分离效果，使用范围比较广泛1.1.1 非极性键合相：非极性键合相主要包括不同链长的烷基（C1、C2、C4、C6、C8、C16、C18、C22等）和苯基。键合烷基的链长对键合相的样品负荷量、溶质的K值和选择性均有影响。当烷基键合相的表面浓度（umol/m2）相同时，烷基链长增加，碳载量成正比增加，溶质的保留值增大。短链烷基键合相（C6、C8等）因链长较短，与硅胶表面键合时比长链烷基有更高的覆盖率，且残余硅羟基更少，更适合极笥样品分离；而长链烷基键合相（C16、C18、C22等）因碳载量较高，疏水性较好，对各种类型的样品有更强硬态度的适应能力。其中十八烷基硅烷键合硅胶，又称ODS，最常用的非极性键合固定相。1.1.2 极性键合相：极性键合相常用的有氰基（CN）、二醇基（DIOL）和氨基（NH2）键合相等。1.1.2.1 氰基键合相的的分离特性与硅胶相似，但极性相对较弱，优点是梯度洗脱或流动相组成改变时平衡快，溶质间不可逆吸附或副反应减少，对双键异构体或含不等量双键数目的环状化合物有很好的分离能力。1.1.2.2 二醇基键合相一般是缩甘油氧丙基硅烷键合相的水解产物-Si-(CH2)2-O-CH2-CHOH-CH2OH,对有机酸和某些高聚物有较好的分离，也可用 球鞋要些蛋白质的水系体积排阻色谱。1.1.2.3 氨基键合相的分离特性与硅胶有很大差异，Si-OH基呈酸性，而-NH2基呈碱性，二者用于正相洗脱时，所表现的选择性不同。-NH2基的选择性首先表现为强的氢键结合能力；其次在酸性介质中为弱阴性离子交换作用，叔胺基和糖类分子的羟基有相互作用，采用乙腈-水系统可分离单糖、双糖、多糖等。1.1.3 离子交换键合相：离子交换键合相是指键合的有机硅烷分子中带有固定的阳离子或阴离子交换基团，可分为阳离子交换剂（含磺酸基或羧酸基）阴离子交换剂（含季铵基或氨基）两类。以硅胶为基质的离子交换键合相的主要特点是刚性和耐压性，克服了树脂的溶胀和收缩现象，因此，同一根色谱柱上可以按照分析对象的具体要求在一较宽范围内改变流动相的离子强度、PH值以及有机相的种类和含量等。1.1.4 手性固定相：手性固定性是特指利用一定的作用机制，能选择性分离对映体的填料，根据分离机理，可大致分为以下几类：类型化学组成分离机理刷型（Brush-type,Pirkle） 多种手性基团通过离子或共价作用力键合到硅胶表面 三点作用模型相互作用力：氢键，电荷转移（P-P作用），偶极堆叠，立体位阻效应螺旋型聚合物（Helical polymers） 天然纤维素及其衍生物 合成高聚物 相互作用力 插入型络合物立体空穴（Cavity）环糊精及基衍生物，能与大多数有机分了形成主-客体包容络合物分子中有多个立体中心，呈截锥形圆筒状构型配体交换（Ligand Exchange）氨基酸与过渡多属阳离子形成非对映的金属络合物非对映的金属络合物蛋白质（Protein）酸性糖蛋白（AGP） 牛血清白蛋白（BSA）/人血清白蛋白（HAS）静电与疏水效应极性作用力各色谱柱公司对手性固定相的研发，基本上自成体系。Dilma公司推出的Chiral-AGP系列是利用蛋白质酸性糖蛋白（acid glycoprotein Abb. AGP）作为手性中心来分离手性化合物；而CYCLOBOND系列属于环糊精手性固定相；CHIROBIOTIC系列则是以大环乙二醇多肽类如万古霉素（CHIROBIOTIC V）、Teicoplanin(CHIROBIOTIC T)Teicoplanin Aglycone (CHIROBIOTIC TAG)、利托菌素（CHIROBIOTIC R）等作为手性中心体制成系列的填料，能提供所有的手性分离机理，可用于正相或反相分离模式。 日本DAICEL公司推出的CHIRALCEL OJ-RH/OB-H/OA/OK等固定相种类属于酯类纤维素衍生物；CHIRALCEL OB-H/OC/OG/OF等则属于甲氨酸酯纤维素衍生物；CHIRLPAK WH/WM/WE/MA等属于离子交换配基类；CROWNPAK CR 属于冠醚类。1.2 高分子微球：高分子微球基体主要有苯乙烯-二乙烯苯共聚物（PS-DVB），也有聚乙烯醇、聚酯等类型。高分子微球填料的主要优级点是PH范围宽（PH1-14）、化学惰性好、热稳定性好等，但缺点是机械强度低、柱效较低、不同溶剂的收缩率差异、有机溶剂比例高时易溶胀等。目前商品供应的苯乙烯-二乙烯苯共聚物（PS-DVB）品牌较多，聚乙烯醇类型的有Asahipak系列（Dikma公司），将烷基链合到乙烯醇多孔聚合物颗粒上，选择性类似烷基键合硅胶，但PH范围拓宽（2-12），耐用性和抵搞力均比硅胶基质更好更强，Asahipak C4P键合的是丁基链，Asahipak C8P键合的是辛基链、Asahipak ODP键合的是十八烷基链、Asahipak NH2P键合的是氨基等。1.3 包覆聚合物（Polymer coated, Polymer filled, Polymer Immobilized 或者Polymerencapsulated） 根据硅胶和高分子微球的优缺点和应用范围，促进了包覆聚物柱填料的快速发展。包覆聚合物是在无机载体如硅胶、石墨化碳或氧化锆的表面开成固载化的有机聚合物薄层，聚合物薄层表面还可键合上C18 、C8、NH2 、CN等，色谱过程中仅聚合物层与流动相和组分接触，因而兼顾了无机载体的刚性和有机聚合物的化学稳定性。包覆的聚合物类型包括聚烃、聚醚、聚酰胺、多糖、多肽、聚硅氧烷、聚胺等。目前商品化的产品主要有日本SHISEIDO公司的CAPCELLPAK系列，在硅胶表面包覆了聚硅氧烷聚合物，键合上不同的基团如C18 、C8、NH2 、CN等，分离性能和适用范围类似常规的硅胶柱，但能最大程度地避免残留硅羟基效应，增加化学长稳定性，降低色谱柱的死吸附。1.4 微粒多孔碳填料：微粒我孔碳填料如石墨化碳（Graphitic carbon）的表面是完全非极性的均匀表面，是一种天然的“反相”填料，化学稳定性和热稳定性均很好，但机械强度较差，对强保留组分柱效较低，目前商品化的产品有ahyperCarb(thermo Hyperisl-Keystone公司)1.5 液相色谱柱的使用及保养1.5.1 液相色谱柱的使用说明1.5.1.1 使用前注意事项：色谱柱储存液若无特殊说明，均为有机溶剂，反相柱常用甲醇、乙腈或者高比例的甲醇-乙腈-水溶液，正相柱常用脱水处理后的纯正己烷。使用前，一定要注意色谱柱的储存液与待分析样品的流动相之间是否互溶。有些色谱柱（如氨基柱或氰基柱），既可用于正相体系，也可用于反相体系，如色谱柱中的贮存液为正相（环己烷）而使用条件为反相时，必须用异丙醇先置换掉色谱柱内的储存液，然后再用于反相条件，否则将会明显减少色谱柱的使用寿命。在反相色谱中，如果流动相中缓冲盐的浓度较高（00.1mmol/L，必须先用低浓度的甲醇/乙腈-水溶液（10%-20%）冲洗20min ,否则缓冲盐在高浓度的有机相中很容易析出，从而使色谱柱堵塞，无法恢复。1.5.1.1.1 万古霉素手性柱的使用：色谱柱保存在甲醇溶液中，PH使用范围为4-7。检测样品前用甲醇冲洗10倍柱体积，检测完完毕后，用甲醇冲洗2小时，流速1.0ml/min,再低速冲洗3.0小时,流速0.2ml/min. 1.5.1.1.2 环糊精手性柱的使用：色谱柱保存在乙腈/水（40/60）溶液或甲醇中，使用时特别注意使用可混合溶剂，如果柱子用不互溶的溶剂，需用四氢呋喃或异丙醇预先冲洗。流动相：有机溶剂可以使用缓冲盐，推荐盐浓度小于0.5mol/L，反相条件可以水-可混合溶剂，如乙腈、甲醇和乙醇可以使用，正相应用，几乎所有溶剂例如正己烷，二氯甲烷，四氢呋喃和乙醇可能以使用。推荐PH范围2.0-7.0，但过高或过低的PH及在高温下可以缩短柱寿命。 建议使用最大压力25MPa以下，最高柱温50,通常使用20-40。1.5.1.2 色谱柱使用方向：装色谱柱应使流动相流路的方向与色谱柱标签上箭头所示方向一致。除另有规定外，不宜反向使用，否则会导致色谱柱校效明显降低，无法恢复。1.5.1.3 流动相：流动相中所使用的各种有机溶剂应尽可能使用色谱纯，水最好为超纯水或重蒸馏水，如果流动相含盐，还应将配制好的流动相经0.22um的滤膜过滤。另外，装流动相的容器和色谱系统的在线过滤器等装置应清洁，否则将影响色谱柱寿命。以硅胶为基质的各种键合相对酸和碱都很敏感，一般PH使用范围为2.5-7.5，应参阅色谱柱使用说明书，配制好流动相后，必要时测定PH值，防止PH过酸过碱，以免色谱柱填料不可逆性损坏。1.5.1.4 样品溶液应经0.45um或0.22um的滤膜过滤,或用固相萃取小柱(SPE)对样品溶液进行预处理;如样品成分复杂,部分组分有可能吸附在色谱柱上,必须使用前置保护柱.在用正相色谱分析样品时,如无特殊要求,所用的溶剂和样品应严格脱水.1.5.2 色谱柱的保养1.5.2.1 反相色谱用后的保存：如使用缓冲液或含盐溶液作为流动相，每天实验结束后，应用10倍柱体积（对150mm柱长，约15ml）的低浓度的甲醇/乙腈-水溶液（10-20%）冲洗，使色谱柱内的盐完全溶解洗脱出，再用较浓度的甲醇/乙腈-水溶液（50%）冲洗，最后用高浓度的甲醇/乙腈-水溶液（80-100%）冲洗，使色谱柱中的强吸附物质冲洗出来。常用色谱柱的柱内死体积（ml）如下表所示：所估计的柱内死体积内径（mm）柱长150mm柱长250mm2.10.3ml0.5ml4.61.8ml2.2ml10.06.5ml9.3ml22.535.0ml49.3ml1.5.2.2 色谱柱的长期保存：反相柱，可以储存于甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于经脱水处理后的正己烷中，离子交换柱可以贮存于含5%甲醇或含0.05%叠氮化钠的水中，并将色谱柱两端的堵头堵上，以免干枯，室温保存。1.5.3 色谱柱的维修：反相柱使用一段时间后，会发生柱压上升、柱效降低的现象。这主要是柱床上端或过滤片处积累了污染物，可通过再生予以消除。如果色谱柱性能突然变坏，可采取不正当手段以下方法处理：（1） 如果柱压突然增大，可将色谱柱出、入口端颠倒过来，用10-20倍柱体积的流动相冲洗。如果柱压仍然很高，可能是柱入口处的过滤片堵塞，需要更换新滤片；（2） 如果峰形变坏（如出现肩峰或双峰），表明柱入口柱床可能有塌陷，可用同型号填料和流动相配成匀浆，将埸陷处填平。1.5.4 色谱柱的再生1.5.4.1 正相柱按极性增大的顺序，依次用20-30倍柱体积的正己烷、二氯甲烷和异丙醇冲洗色谱柱，然后，按反顺序冲洗，最后用干燥的正己烷平衡。1.5.4.2 反相柱首先用蒸馏水冲洗，再分别用20-30倍柱体积的甲醇和二氯甲烷冲洗，然后按相反顺序冲洗，最后用流动相平衡。1.5.4.3 离子交换柱在低离子强度的缓冲液中长期使用会导致色谱柱失活，用稀酸缓冲液可使阳离子交换柱再生，再用稀碱缓冲液冲洗可使阴离子柱再生。1.5.4.4 氨基柱，分析糖类的氨基柱可用 0.02mmol/L的磺酸溶液冲洗，然后用水平衡。1.5.4.5 万古霉素手性柱的再生：每次使用后柱效记录在仪器使用记录的备柱栏中，发现柱效降低时，务必及时进行再生程序，再生程序如下，第一步：纯甲醇冲3.0小时，流速0.2ml/min,第二步：0.1%冰醋酸甲醇溶液冲洗3.0小时，流速0.2ml/min，第三步：纯甲醇冲洗3.0小时，流速0.2ml/min.第四步：0.1%三乙胺甲醇溶液冲洗12小时，流速0.2ml/min，纯甲醇冲洗6小时，流速0.2ml/min。（以上所用溶液均按流动相的要求严格过滤和脱气）。色谱柱的