肝素钠提取与其乳膏制备

我们毕业啦其实是答辩的标题地方 肝素钠的提取及其乳膏制备 组员 指导老师 研究背景 肝素钠的提取 分析总结 CONTANTS 肝素钠效价的测定 肝素钠乳膏的制备 肝素钠 HeparinSodium 从动物结缔组织的肥大细胞提取的钠盐 属粘多糖类物质 天然抗凝血物质 被广泛用于治疗血栓塞 暴发性流脑 败血症等疾病 从生物学角度来讲 肝素钠是一种含硫酸脂的氨基葡萄糖 艾杜糖醛酸和葡萄糖酸的生物活性物质 在机体内它与蛋白质结合成复合物存在于肥大细胞中 可被蛋白酶解离出来 它在溶液中呈强电荷的聚阴离子状态 与强碱性D208阴离子树脂有较强的亲和力 易被吸附而分离 研究背景 肝素钠结构式 临床上肝素钠的常见剂型包括注射剂和乳膏剂 乳膏剂是外用法给药的剂型之一 通过皮肤 孔窍 经络及病变局部等部位治疗疾病 避免了胃肠道的破坏与肝首过效应 减少血药浓度峰谷变化 已成为克服药物副作用的有效用药途径之一 肝素钠乳膏剂 HeparinsodiumCream 常用于早期冻疮 皲裂 溃疡 湿疹及浅表性静脉炎和软组织损伤 工艺现状 以猪小肠粘膜提取肝素钠为主 生产得率较低 且混有大量有害物质 不利于临床应用 需大量进口 价格昂贵 研究背景 实验方法 1 原料采集及酶解吸附2 离子交换吸附2 1D208树脂预处理2 2吸附与洗脱静态吸附 将上述树脂加入到已处理好的酶解液中 混匀 调节pH至8 5 置于混合器上搅拌过夜吸附 线性洗脱 装填静态吸附后的树脂 按下表配置洗脱液 静态洗脱 取动态洗脱的树脂于烧杯 加入4mol LNacl溶液 搅拌吸附30min 取上清液 留样 3 肝素钠的精制 肝素钠的提取 实验结果 1 离子交换吸附 肝素钠洗脱曲线图 在肝素钠动态洗脱曲线图中有一峰谷 代表洗脱出来的是杂质峰 在此之前和之后分别有一个持续平衡的吸光度范围 其吸光值为0 509 0 513 由此可判断A 0 513为仪器在220nm处可显示的最大吸光度 第二个下降区吸光度由0 513下降至0 086 表示树脂上的物质逐渐洗脱完全 肝素钠的提取 在第二个稳定吸光度区 A 0 513 0 509 收集洗脱液与加入乙醇后对比 呈现明显的浑浊 见图3 其原因可能是由于肝素钠是一种多糖 加入乙醇后通过降低水溶液的介电常数脱水 从而产生沉淀分离 在反应过程中发现 加热会使浑浊溶液澄清 而冷冻会增加沉淀析出量 所以反应受到温度的影响 当然反应过程中乙醇浓度增大时 沉淀析出量也会增加 A 0 509 0 513处洗脱液加入乙醇前 左 和加入乙醇后 右 对比图 2 肝素钠的精制 白色略黄肝素钠粉末 共0 0131g 肝素钠成品 肝素钠的提取 实验方法 1 效价测定按下表处理标准品 样品及成品 先加入血浆 置37 0 5 恒温水浴保温5min 取出后加入肝素钠溶液 然后迅速加入1 Cacl2溶液 37 0 5 恒温水浴保温3min 肝素钠的效价测定 2 紫外吸收测定用纯水将紫外检测仪校零 220nm 280nm 按下表配置溶液测定 肝素钠的效价测定 实验结果 1 肝素钠的效价测定标准品效价测定中 0 969U mL标准品管血清出现半凝固状态 以此管为参照 样品1号 2号管血浆均出现半凝固状态 样品效价 0 969U mL 10 9 69U mL 成品效价 0 969U mL 0 000026g mL 37 27U mg 效价测定半凝固点图 从右至左依次为标准品0 969U mL 样品1号 样品2号 成品 肝素钠的效价测定 实验结果 2 肝素钠紫外吸收测定于220nm处测定肝素钠吸光度 280nm处测定残留蛋白吸光度 结果见下表 蛋白质由于含有色氨酸残基和酪氨酸残基 其分子内部存在共轭双键 在280nm处有一特征吸收峰 但因肽键的存在 在220nm处也有一吸收峰 故对肝素钠的紫外测定存在干扰 肝素钠的效价测定 实验方法1 乳膏的制备处方 肝素钠7 9mg液体石蜡11mL硬脂酸1 5g蜂蜡2 4g石蜡2 6g硼砂0 1g纯水3 3mL按处方精密称取液体石蜡 石蜡 硬脂酸 蜂蜡在水浴上加热融化 并保持温度90 得油相备用 按处方量称取肝素钠 硼砂溶解于纯水中 并保持温度90 得水相备用 先将油相2 5缓慢加入水相中 边加边搅拌至初乳形成 将初乳缓慢滴加至油相中 室温下迅速搅拌 至温度下降至室温 既得肝素钠油包水型乳剂 肝素钠乳膏的制备 实验方法2 乳膏的显微观察取30 甘油一滴于载玻片上 用玻璃棒蘸取实验样品少量 取少量苏丹红颗粒染色 涂匀 40 0 65倍镜下观察 3 质量评价外观 感受 酸碱度 焰色反应 效价测定稳定性试验 将乳膏分装于3个塑料烧杯中 1号杯置于室温 2号杯置于55 培养箱中 3号杯置于 15 冰箱中 24小时后观察 肝素钠乳膏的制备 实验结果1 肝素钠乳膏显微观察肝素钠乳膏未经染色时呈现晶块状 染色后可明显观察到小颗粒状油球 表明乳膏出现了一定的均匀状态 其原理是苏丹红 在脂类物质中的溶解度大于在溶剂中的溶解度 当接触脂质类时 进入脂类内部呈色 肝素钠乳膏 未染色 显微观察 肝素钠乳膏 染色 显微观察 肝素钠乳膏的制备 实验结果2 肝素钠乳膏质量评价性状 乳白色肝素钠乳膏 十分粘稠 细腻无颗粒 酸碱度 pH 7 37焰色反应 火焰呈黄色 肝素钠乳膏 肝素钠乳膏焰色反应 肝素钠乳膏的制备 实验结果2 肝素钠乳膏质量评价效价测定 稀释0 1 10 20倍数后进行效价测定 每管都出现半凝固状态 以未稀释管计算效价 4 845U g 17 72595g 85 88U 稳定性实验 24小时后 分别观察耐热 常温 耐寒条件下肝素钠乳膏状态 可明显观察到耐热试验中肝素钠乳膏油水分层 肝素钠乳膏效价测定 从左至右依次为稀释0 1 10 20倍数 肝素钠稳定性实验 肝素钠乳膏的制备 1 工艺流程肠粘膜必须新鲜 由于粘膜污染有许多微生物 长时间保存会发酵产生肝素酶 分解肝素钠 酶解一方面使肝素释放 另一方面又要除去大量杂蛋白 以防大分子杂质堵塞树脂孔径而影响对肝素分子的吸附 pH略大一方面有利于增大肝素离子化程度 以便于最大程度吸附 另一方面不会对官能团离子化产生大的影响 吸附率下降可能与样品中杂质离子化增大后竞争吸附有关 乙醇沉淀时 必须在搅拌的同时逐渐加入乙醇 以避免局部乙醇浓度突然增高 而且最好是用预冷过的乙醇 否则就会使肝素钠的部分空间构象受到破坏 从而降低其活性 讨论与分析 2 肝素钠效价过低此次试验精制所得肝素钠效价过低 可能原因有一方面在提取过程中肝素钠的损失 还有一方面原因在于效价评定方法中兔血浆溶血的干扰 3 肝素钠乳膏质量不佳在乳膏制作过程中 人为难以避免的因素导致肝素钠生物活性