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小五号宋体福建林业职业技术学院建筑工程技术专业毕业论文小二号黑体，居中排列 松萎蔫病病原的研究四号宋体，1.5倍行距学生姓名： 专业班级： 座 号： 指导教师： 完稿日期： 松萎蔫病病原的研究小二号黑体，居中四号宋体，1.5倍行距写作提纲一、绪论自从20世纪初松萎蔫病被发现以来，该病已经从北美洲扩散到日本，后来又传入中国、韩国等亚洲国家和欧洲的葡萄牙。该病的致病机理尚未研究清楚，松材线虫却长期以来被认为是PWN的唯一病原。然而，有研究报道松材线虫相关的细菌能产生毒素。有实验表明，无菌的松材线虫虽然能侵入松树木质部，但在不携带细菌的情况下对松树没有致病力。这些林间试验的数据说明只有当松材线虫又感染细菌情况下，才能使被接种的黑松患病死亡，但这些试验结果并不能有力地证明复合侵染假说，虽然试验结果中仍有试树死亡，其死亡的原因可能是接种后无菌线虫从接种处或因机械或昆虫取食、产卵造成的伤口处获得了细菌。用实验证明此假说的主要困难是创造一个在实验室或野外接种成年松树的无菌环境条件，且幼苗较成年松树(3年或以上)的生理和病理有很大差别，因此应选用成年的松树进行接种试验。笔者从研究松材线虫的行为与环境关系的预实验中发现，松材线虫的运动与环境温度有密切关系。在7的环境中，松材线虫就完全失去了运动能力。同时，据研究报道健康黑松体内没有细菌，据此设计了一种称之为“冷闸”的接种试验装置，使用该装置将松材线虫与其携带的细菌隔离在灭菌的接种枝内，对大树接种时，可以不用对整株树灭菌，仅对接种枝灭菌就能保证试验的进行，以此来确定松萎蔫病的病因。二、本论（一）材料与方法1、供试染菌和无菌松材线虫的获得2、黑松愈伤组织的诱导和继代培养3、松材线虫携带细菌菌株的获得与鉴定4、接种无菌线虫、细菌的再分离及鉴定（二）结果与分析1、不同接种处理后松树的病状2、不同接种处理后的再分离、鉴定结果三、讨论实验结果进一步验证了松材线虫携带的致病细菌能产生毒素，并且是这些毒素导致了松树的萎蔫和死亡。笔者的这些实验结果证明松材线虫与其携带的互惠共生致病细菌复合体诱导了松萎蔫病。因此，松萎蔫病是用实验验证的首例由线虫一细菌共生复合体诱导的植物病害。起首空二格，四号楷体加粗小二号黑体，居中排列松萎蔫病病原的研究小四号宋体，居中排列赵博光小四号楷体，1.5倍行距，词间空一格起首空二格，四号楷体加粗小四号楷体，1.5倍行距【内容摘要】为了探讨松萎蔫病与松材线虫的关系，笔者研制了一种简单试验装置“冷闸”，使接种的线虫被隔离在松树接种枝内而不能迁移。用该装置进行接种试验的结果表明:在松材线虫被局限于接种枝内而不能移动到寄生其他部位的情况下，接种无菌松材线虫与致病荧光假单胞菌,以及该致病细菌体外培养的无细胞滤液，同样能诱发该病。该致病细菌又从接种无菌线虫和致病细菌后病死寄主中分离到并被鉴定，证明符合柯赫法则。致病荧光假单胞菌体外培养的无细胞滤液接种试验结果说明，该致病菌株培养物中的内吸性毒紊导致了寄主的萎蔫和死亡。由此，松萎蔫病经实验证实为首例由细菌和线虫互惠共生复合体引起的植物病害。【关键词】松萎蔫病 松材线虫 线虫-细菌复合体 荧光假单胞细菌 小四号宋体，1.5倍行距自从20世纪初松萎蔫病(Pine Wilt Disease，简称PWN)被发现以来，该病已经从北美洲扩散到日本，后来又传入中国、韩国等亚洲国家和欧洲的葡萄牙。该病的致病机理尚未研究清楚，松材线虫却长期以来被认为是PWN的唯一病原。然而，有研究报道松材线虫相关的细菌能产生毒素。有实验表明，无菌的松材线虫虽然能侵入松树木质部，但在不携带细菌的情况下对松树没有致病力。这些林间试验的数据说明只有当松材线虫又感染细菌情况下，才能使被接种的黑松患病死亡，但这些试验结果并不能有力地证明复合侵染假说，虽然试验结果中仍有试树死亡，其死亡的原因可能是接种后无菌线虫从接种处或因机械或昆虫取食、产卵造成的伤口处获得了细菌。用实验证明此假说的主要困难是创造一个在实验室或野外接种成年松树的无菌环境条件，且幼苗较成年松树(3年或以上)的生理和病理有很大差别，因此应选用成年的松树进行接种试验。笔者从研究松材线虫的行为与环境关系的预实验中发现，松材线虫的运动与环境温度有密切关系。在7的环境中，松材线虫就完全失去了运动能力。同时，据研究报道健康黑松体内没有细菌，据此设计了一种称之为“冷闸”的接种试验装置，使用该装置将松材线虫与其携带的细菌隔离在灭菌的接种枝内，对大树接种时，可以不用对整株树灭菌，仅对接种枝灭菌就能保证试验的进行，以此来确定松萎蔫病的病因。一级标题，四号黑体加粗，左对齐，独占行，末尾不加标点1 材料与方法二级标题，小四号黑体加粗，左对齐，独占行，末尾不加标点1. 1 供试染菌和无菌松材线虫的获得从采集于野外自然感病枯死的黑松木段上取样，分离方法参见文献。将分离并鉴定的染菌线虫培养在长满灰葡萄孢的PDA平板上培养，冰箱保存。取适量松材线虫，用两层纱布包好，置于贝曼漏斗中，加适量的水，在常温下分离6-24 h;鉴定后离心、去上清液，留下约2 mL移到琼脂培养基上，用脂膜封口，放入25的恒温箱中培养;12-18 h后，用水冲洗琼脂培养基，滴管吸取松材线虫水至离心管内，于离心机中离心5 min (1 500 r/min) ,吸去上清液，将松材线虫在约1. 5mL水中且无菌条件下移至另一离心管中，线虫水和30%双氧水按体积比1：1混合，将离心管于约15水中静置10 min;用无菌蒸馏水稀释线虫水35遍;分别用180目和200目的筛网过滤，于45倍昆虫解剖镜下挑取若干卵于NA培养基上，检查线虫卵是否带细菌;如果带菌，则放弃此次获得的线虫。将无菌松材线虫的卵置入事先放有黑松愈伤组织的培养皿中，在无菌条件下繁殖，得到无菌松材线虫。1. 2 黑松愈伤组织的诱导和继代培养将黑松种子流水冲洗2h，去壳，于75%乙醇溶液中表面消毒3次，每次40 s，用无菌水冲洗3次，置于0.1%升汞溶液中浸泡4 min，再用无菌水冲洗5次，在无菌操作台上剥去胚乳得到成熟胚，将其移入灭过菌的装有MS诱导培养基的锥形瓶中，封口，于28 C恒温箱中暗培养。两周后诱导出黑松愈伤组织，将生长良好(为乳白色)的愈伤组织移至继代培养基上。在无菌操作台上，把愈伤组织切成黄豆大小，移至装有1/2MS继代培养基的锥形瓶中，每个锥形瓶接入34块，于28C恒温箱中暗培养，每隔1个月左右继代1次。1. 3 松材线虫携带细菌菌株的获得与鉴定选择我国松材线虫病发生代表性的疫区，在2001年春秋两次采样。采集了感染松材线虫病的黑松、马尾松病木，采用木块组织分离法，分离松材线虫所携带的细菌株。利用传统的细菌鉴定方法和自动化细菌鉴定系统相结合的手段，对这些细菌进行了鉴定。选取荧光假单胞细菌M5-1A菌株，将该细菌菌株于NA培养基上斜面培养，冰箱低温保存备用。另于NB液体培养基中培养该菌株，条件为28C，摇床震动培养6d，并将培养液于高速离心机15 000 r/min离心30 min，再用0. 22 um滤膜抽滤，得到该菌株的无细胞滤液。1. 4 接种无菌线虫、细菌的再分离及鉴定接种试验于2006年78月份进行。选择3年生黑松直径为23 mm的侧枝接种，接种前先用75%乙醇擦拭表面，剪去上部枝条，装上自制的冷闸装置，然后套上塑料离心管(3 mL)。离心管预先截去底部并经消毒，离心管与松枝间用封口腊膜包扎，在离心管中接入线虫2 000条，将离心管上端的盖子盖紧以防水分蒸发。接种处理共有野生松材线虫(编号为A)、无菌松材线虫(编号为B)、荧光假单胞细菌菌株(编号为C)、无菌松材线虫+荧光假单胞细菌GcM5-1A菌株(编号为D),荧光假单胞细菌GcM5-lA菌株培养液的无细胞滤液3 mL(编号为E)。每个处理为5棵试树，接种后立即在“冷闸”装置中循环5的冷水，将接种后的松材线虫和细菌阻隔在接种枝内。接种后试树保持在28和光照环境为L(光照):D(黑暗)为16:8的条件下，每天观察和记录试树的病状。试树的病状按照文献11的病状分级简化为5个阶段:第1阶段，接种枝上的针叶没有症状，仍表现为亮绿色；第2阶段，接种枝上的针叶失去了光泽；第3阶段，接种枝上的针叶变为黄绿色；第4阶段，接种枝，接种枝邻近的树枝和顶枝上的针叶变为灰黄色或棕色并开始萎蔫；第5阶段，整棵树的针叶均变为黄棕色，并萎蔫。接种试验结束时，中断冷水循环之前将接种枝的“冷闸”装置近树主干的一端取一段树枝，用于检查树枝内是否含有松材线虫和细菌。然后从接种枝上冷闸的另一端树枝取样检查(先将接种的离心管端除去1 cm树枝)，分离和鉴定线虫和细菌，其方法见文献。用木块组织分离法分离松材线虫所携带的菌株。利用传统细菌鉴定方法和自动化细菌鉴定系统相结合，对这些细菌进行鉴定。2 结果与分析2. 1 不同接种处理后松树的病状各个不同处理(各处理5株松树)接种的结果见表1。其中对照B(接种无菌松材线虫)和处理C(接种荧光假单胞细菌GcMS-1A菌株)的黑松没有表现出任何症状；而处理A(接种野生松材线虫)、处理D(接种无菌松材线虫+荧光假单胞细菌GcM5-1A菌株)、处理E(接种GcMS-1A菌株培养液的无细胞滤液)的黑松于接种后分别萎蔫并死亡，其中处理A,E的松树分别在接种后的32. 2 d和25. 4 d开始萎蔫，经t检验两者有显著差异(a0.05)。而处理D的松树平均在接种后48. 6 d开始萎蔫时间，经t检验与处理A,E的对应值有显著差异(a8 000)和小分子的毒素(分子量8 000)。最近，从荧光假单胞细菌GcMS-1A菌株的培养液中分离鉴定了细菌鞭毛蛋白毒素两个环二肽毒素，生测表明这3种毒素均对黑松幼苗有很强的毒性，能引起黑松幼苗的萎蔫和死亡。试验还表明用毒蛋白处理黑松悬浮细胞导致细胞膜通透性增加，胞内可溶性糖和游离氨基酸等内含物大量外渗。这就为解释松萎蔫病表现的萎蔫症状的病因提供了分子病理学证据。用Western blot和HPLC等方法，从接种野生松材线虫的松树枝条中检测到了这3种毒素，而健康松树中没有检测到它们。这些结果进一步验证了松材线虫携带的致病细菌能产生毒素，并且是这些毒素导致了松树的萎蔫和死亡。笔者的这些实验结果证明松材线虫与其携带的互惠共生致病细菌复合体诱导了松萎蔫病。因此，松萎蔫病是用实验验证的首例由线虫一细菌共生复合体诱导的植物病害。已有报道首例由共生线虫细菌复合体诱导的病害，其病原为线虫和细菌复合体:斯氏线虫属一嗜线虫致病杆菌属和异小杆线虫属发光杆菌属形成互惠共生的复合体。虽然近年来在它们之间的互惠共生机理及致病机理方面通过应用遗传和分子生物学工具已经取得了实质性的进展