分子遗传标记技术.ppt

水产生物常用分子标记 RFLP RAPD AFLPSSR ISSR SNP线粒体 叶绿体 核糖体DNA标记 1 RFLP 限制性片段长度多态性 restrictivefragmentlengthpolymorphism RFLP 1974年Grodzicker创立 是最早的DNA分子标记 1980年Bostein提出用RFLP作为标记构建遗传图谱 RFLP标记呈现孟德尔式遗传 标记数目多且稳定 但是技术步骤繁杂 所需DNA用量大 1 1RFLP标记技术的原理 不同个体DNA用已知的限制性核酸内切酶消化后 产生许多大小不等的片段 电泳分离 Southern印记转移到硝酸纤维素膜上 用放射性标记的探针与膜上变性的酶切DNA片段杂交 放射自显影 即可显示出不同材料的多态性图谱 可通过增加限制酶的数量获得相对全面的信息 RFLP探针主要来源 基因组DNA克隆和cDNA克隆等 其中cDNA探针保守性强 许多同科物种可通用 多用于研究物种起源演化 系统学研究主要探针为线粒体DNA 叶绿体DNA和rDNA 1 2RFLP标记技术的特点 RFLP标记广泛存在于生物体内 不受组织 环境和发育阶段影响 具有个体 种 属及品种层次的特异性 核基因组RFLP标记表现为孟德尔的共显性遗传 而细胞质RFLP标记表现为母性遗传 大多数RFLP标记表现为单位点上的双等位基因变异 可区分纯合子和杂合子 非等位基因的RFLP标记间不存在互作效应 互不干扰 标记源于基因组DNA自身变异 可覆盖整个基因组 结果稳定可靠 重复性好 优点 缺点 使用放射性同位素杂交 对样品DNA靶序列拷贝数要求较高 编码基因多具有高度保守性 RFLP标记多态性程度较低 多态信息较低 操作需要酶切 对DNA要求高 线粒体DNA进化速度快 影响种以上水平RFLP分析的准确性 包括基因组DNA的酶解和Southern转移 DNA纯度高 重复序列拷贝数高 防止DNA降解 确保彻底酶切 限制酶能产生0 5 2kb片段 对甲基化不明显 总酶量少于反应体系的10 探针与DNA杂交可用放射性自显影或荧光免疫或免疫过氧化物酶等技术进行观察 通过直接分析重复序列等寻找能作为探针的潜在重复DNA序列的策略 1 3RFLP标记技术的操作及要点 2RAPD 随机扩增多态DNA标记 randomamplifiedpolymorophicDNA 1990年Williams等研发的DNA指纹技术利用随机合成的寡聚核苷酸序列 10bp 作为引物 对所研究的基因组DNA进行PCR扩增 基因组DNA一系列不同的随机引物的结合位点上或位点之间发生碱基插入或缺失而产生的多态 2 1RAPD标记技术的原理 利用PCR技术从扩增的DNA片段上分析多态性 由于片段被引物选择性的扩增 产物经过电泳鉴别 即可通过同种引物扩增条带的多态性反映出模版的多态性 当引物较短时 很多染色体上相邻且方向相反的引物位点存在于基因组内 PCR技术扫描含有这些颠倒重复序列的基因片段并扩增长度不同的插入DNA片段 不同长度的扩增片段在琼脂糖凝胶中呈现出条带 显示出多态性 两处碱基发生改变 优点 无需专门设计RAPD扩增引物 随机设计的长度为9 10bp引物均可使用 无种属特异性 在初期反应周期中 退火温度为36 37 为保证退火反应双链稳定性 引物G C 40 共显性遗传 不受环境 发育 数量性状遗传影响 其产物经克隆分析后可转化成RFLP和原位杂交探针 转变为经典PCR技术的分子标记 2 2RAPD标记技术的特点 缺点 发生一次或几次突变时引物就不能和引物位点匹配的假设不成立 不匹配只发生在二次突变或多次突变 该技术应用于二倍体时 难以区别和统计分析纯合子和杂合子 结果可靠性低 重复性取决于实验条件和操作 使用效果因生物种类而定 在单倍体无性繁殖的细菌中非常有效 2 3RAPD标记技术的操作 94 300s 94 60s 36 60s 72 90s 45循环 72 300s 实验中可能发生的问题及解决方法 无扩增扩增结果差高分子量产物 4kb 呈弥散状分布谱带不可重复影响图谱重复性 2 4RAPD技术在水产动物中的研究和应用 1 亲缘关系分析宋林生 2000 等用RAPD技术对6种不同科以及不同属的海产虾类进行了基因组DAN多态性的研究 结果显示6种虾的亲缘关系与传统的分类结果基本一致 说明RAPD在海洋动物的遗传学研究中是一种具有重要价值的遗传标记 2 群体遗传结构以及遗传变异刘必谦 1998 利用RAPD技术对四个不同地区的大连湾牡蛎进行了研究 结果表明相邻种群的遗传变异不明显 地理位置相距越远 遗传变异越明显 3 杂交分析和遗传育种董在洁等 1999 对兴国红鲤 德国境鲤和苏联境鲤进行了RAPD分析 结果表明兴国红鲤与苏联境鲤的遗传距离最大 由此推断这两个品种间的杂种优势较强 并与育种实践一致 4 基因定位和基因连锁图构建孙效文等 2000 利用RAPD和SSLP遗传标记建立了鲤鱼的遗传连锁图 Postlethwait等以单倍体遗传法主要用RAPD绘制了斑马鱼的第一张连锁图 图谱促进了斑马鱼突变基因定点克隆 染色体重排和脊椎动物基因组进化的研究 基于RAPD的SCAR标记 序列特征扩增区 sequencecharacterizedamplifiedregion SCAR 先做RAPD分析 然后将目标RAPD片段克隆测序 根据原RAPD片段的末端序列涉及特定引物 24bp 进行特异PCR扩增 把与原RAPD片段对应的单一位点鉴定出来 SCAR标记的优点 用较长的引物和较高的退火温度 可靠性高 重复性好 信息量大 可构建高密度遗传图谱 类似于STS 可作为物理图谱和遗传图谱间的锚定点 能进行比较图谱研究或种间同源性研究 3AFLP 扩增片段长度多态性 amplifiedfragmentlengthpolymorphismAFLP 1993年Zebeau和Vos建立的一种分子标记 最初被称为Selctiverestrictionfragmentamplification SRFA 将基因组DNA用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头连接起来 通过5 端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA片段 从而形成指纹图谱的分子标记技术 3 3 1AFLP标记技术原理 内切酶 低频剪切酶 识别六碱基酶切位点 如EcoR Hind Pst Sac Apa 高频剪切酶 识别四碱基酶切位点 如Mse 常用于富含A的真核生物 以产生更小的限制片段 Taq 引物是一种人工合成的单链寡聚核苷酸 一般长度是18 20个核苷酸 主要由3个部分组成 核心序列 该序列与人工接头的核心序列互补 限制性内切酶识别特异序列 选择性延伸序列 即引物3 端的选择碱基 接头一般长度是14 18个核苷酸 由两部分组成 核心序列和酶识别位点特异序列 其作为引物的结合位点 是严格按照PCR引物设计原则合成的 AFLP标记技术流程 优点 可覆盖整个基因组 选择中性 多态性高 可靠性好 重复性和分别率高 对DNA模版质量要求高 但用量少 对浓度要求不高 检测效率高 方便快捷 具有通用性 2 2AFLP标记技术的特点 缺点 过程复杂 操作程序复杂 成本较高 对操作人员技术水平要求较高 AFLP扩增时有假阳性和假阴性结果出现 以及凝胶背景杂乱等 应用 AFLP技术和cDNA AFLP常用于从基因家族中分离高度同源性的基因而无需知道基因的序列 以及真核生物亚种间的不同基因和基因表达的时空性 AFLP工作原理 影响AFLP实验的因素 1模板DNA 2酶切效果 3引物设计 4PCR反应条件 25pg 250ng 高纯度 关键步骤 一定G和C 4n 2 预扩增 选择性扩增 1 遗传多样性及系统进化中的研究王志勇等对福建官井大黄鱼野生种群和2个养殖群体用5对选择性引物进行了AFLP分析 共检出503个不同扩增片断 50 450bp 发现养殖群体的多态片段比例和个体间的遗传差异度均低于野生种群 其遗传多样性水平较低 遗传变异贫乏 2 亲缘关系鉴定孙易等利用12对引物检测了15个种及品系的卤虫 聚类分析结果表明 来自西藏的两性生殖卤虫为不同于中国内陆两性生殖卤虫的新种 内陆和沿海的孤雌生殖卤虫可能为不同的种 AFLP技术在水产动物研究中的应用 3 构建遗传图谱Moore等利用AFLP多态位点构建了日本对虾的初步连锁图 129个标记分布于44个连锁群 覆盖整个基因组的57 左右 4 基因的定位及分离Cui等运用cDNA AFLP技术对红鳍东方鲀成熟和未成熟个体的逆转录DNA进行检测 发现了5个性别标记 TDF1 5 其中前4个 TDF1 4 来自性腺 第5个 TDF5 来自尾鳍 因此 TDF5就可以用于快速鉴定红鳍东方纯性别 不必对鱼进行解剖 4SSR 微卫星 microsatellite 又称简单序列重复 simplesequencerepeat SSR Moore Soolotterer1991年共同提出 指含少数几个 1 6个 碱基对的短串联重复DNA序列 其中最常见的是双核苷酸重复 每个微卫星DNA的核心序列结果相同 重复单位数10 60个 其高度多态性主要来源于串联数目的不同 4 1SSR标记技术原理 一般认为微卫星多态性产生的机制是DNA复制和修复过程中碱基滑动 错配或减数分裂中姐妹染色单体的不均等交换 根据微卫星序列两端互补序列设计引物 通过PCR反应扩增微卫星片段 根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率 微卫星主要以两个核苷酸为重复单元 如 GT n GA n CA n TG n AT n 也有一些重复单元为3核苷酸 少数为4个或更多 不同遗传材料重复次数的可变性导致了SSR长度的高度变异 微卫星的突变率在不同物种 同一物种不同位点和同一位点的不同等位基因之间存在很大差异 检测单一的多等位基因位点 位点具有专化性 微卫星呈共显性遗传 符合孟德尔遗传规律 可鉴别纯合子和杂合子 SSR所需DNA量少 DNA降解也可有效分析 SSR序列的两侧顺序常较保守 在同种而不同遗传型间多相同 多数SSR无功能作用 在品种间具广泛的位点变异 比RFLP和RAPD分子标记具多态性 4 2SSR标记技术的特点 由于创建新SSR标记需要知道重复序列两端的序列信息 不能直接从DNA数据库查询 需要先对其进行测序 研发初期困难 开始筛选重复序列和引物涉及过程较慢 费用较高 一旦引物确定 使用较方便结果也稳定 缺点 4 3SSR标记技术的操作 1 杂交优势预测中的应用微卫星多态性反映着物种的进化历史 现代杂交优势理论认为 杂交优势大小在一定程度上取决于亲本间遗传距离的大小 因此 可以对群体或个体间遗传距离较远的物种进行杂交育种2 群体的杂合度研究水产养殖人工繁育计划的一个重要内容是要知道繁育群体的遗传变异的大小 从而制定出科学的管理措施 防止人工繁殖过程中进行遗传背景相似品系交配所造成遗传多样性的丢失 非