四种核酸染料在琼脂糖凝胶电泳中染色特性的比较分析毕业论文.doc

四种核酸染料在琼脂糖凝胶电泳中染色特性的比较分析毕业论文 目录摘 要IABSTRACTII第一章 绪 论11 DNA的琼脂糖凝胶电泳11.1 琼脂糖凝胶电泳概况11.2 影响电泳因素11.3 电泳方法32选题背景42.1 立题依据及研究意义42.2 研究领域发展现状及展望53多种染料概况53.1 EB53.2 GelRed53.3 GenGreen63.4 SYBR Green6第二章 实验材料与方法81材料及仪器81.1实验试剂81.2实验仪器81.3实验用品92实验方法92.1 试剂准备与配制92.2 琼脂糖凝胶的制备102.3 点样与电泳122.4结果观察与记录13第三章 实验结果与分析141电泳分析141.1胶染法(TBE为缓冲液)141.2胶染法、以TAE为缓冲液时181.3泡染法、以TBE为缓冲液时221.4 泡染法、以TAE为缓冲液时262不同染料比较分析302.1视觉效果302.2毒性322.3 对DNA的迁移影响332.4 可重复利用率332.5稳定性332.6时间成本342.7价格343实验结果34第四章 讨论361实验注意事项362问题及讨论37第五章 结 论39致 谢40参考文献41附页43摘 要本实验采用琼脂糖凝胶电泳法，以不同浓度的DNA作为样品，选用新型核酸荧光染料Gelred、GenGreen、SYBR Green，以及传统染料EB，分别在TAE、TBE中，分别采用胶染法、泡染法进行染色，进行灵敏度、染色效果、染色时间等对比实验。首先将DNA母液稀释成多种浓度，通过预实验，确定了DNA的浓度梯度为0.1、0.3、0.5、0.8、1 、3、5ng/ul。然后将此浓度梯度的DNA溶液分别点样于TAE、TBE两种凝胶电泳体系中，进行电泳。另外采用胶染法和泡染法两种不同的染色方法。对染色效果、灵敏度、时间成本等进行对比分析。结果表明，新型染料GenGreen，不仅操作简便、条带清晰、定量灵敏、价格适中，而且无毒、低致突变性，能更好的保证操作人员的健康和周围环境的安全。在本实验体系中能完美替代EB。关键词：琼脂糖凝胶电泳；DNA；EB；GenGreen；GelRed；SYBR GreenABSTRACTIn this study, agarose gel electrophoresis will be taken.With different concentrations of DNA as calibration solution,and 3 kinds of novel nucleic acid fluorescent dye:Gelred、GenGreen、SYBR Green,In addition to the traditional dye EB.There will be two kinds of buffer solution:TAE and TBE.Precast gel staining and soak staining will be used.Sensitivity, dyeing effect, dyeing time and many other factors will be compared.First,the original liquor of DNA will be diluted to various concentrations. The concentration gradient of DNA is identified as 0.1,0.3,0.5,0.8,1, 3,5 ng / ul through the pre-experiments.Then the DNA solutions of different concentration will be spotted on two kinds of gel electrophoresis system of TAE and TBE.Using two different staining methods:precast gel staining and soak staining.After electrophoresis and staining,comparing and analyzing dyeing effect, sensitivity, time costs,and so on.The result of experiments show that GenGreen, is easy to operate , more sensitive and affordable,has clear bands.Whats more,it has non-toxic and low mutagenicity.It can ensure operators health and the environment.It can replace EB perfectly in this experimental system.Key words：Agarose gel electrophoresis；DNA；EB；GenGreen；Gelred；SYBR GreenII第一章 绪 论1 DNA的琼脂糖凝胶电泳1.1 琼脂糖凝胶电泳概况琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定核酸的重要方法1。是核酸研究工作中不可缺少的重要分析手段，广泛应用于基础理论研究、农业科学、医学卫生、工业生产、国防科研、法医学和商检等许多领域，在生物化学和分子生物学的教学和科研中具有重要作用25。琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段的基本原理是基于DNA为多元酸，是两性解离分子,在高于其等电点的电泳缓冲液中,其碱基不解离,而磷酸基团全部解离6。核酸分子因而带负电荷，在中性或弱碱性缓冲液中向阳极泳动。而琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰,为一种聚合链线性分子2,使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质,发挥分子筛功能,使得大小和构象不同的核酸分子在从负极到阳极移动过程中的迁移率出现较大差异,从而达到分离的目的。1.2 影响电泳因素1.DNA分子大小及构型 DNA片段在琼脂糖凝胶中的迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物（marker）移动的距离与未知DNA片段的移动距离时行比较，便可测出未知DNA片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，很难通过琼脂糖分子之间的空隙，就很难在琼脂糖凝胶中迁徙，普通琼脂糖凝胶很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。不同构型的DNA：共价超螺旋闭环DNA（）、直线DNA（）、开环的双链环状DNA（）在琼脂糖凝胶中的移动速度不同。在较低琼脂糖浓度中型比型迁移地更快，因为型可以扭曲蠕行快速通过较大的凝胶孔径。而在高浓度的凝胶中，顺序可能颠倒，由于超螺旋DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率较低，而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进7。可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。 2.琼脂糖的浓度不同大小的DNA片段需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。对DNA片段的分离范围与琼脂糖浓度有关8。分离小于0.4kb的DNA片段时凝胶浓度通常为1.21.5%，分离大于8kb的DNA分子所需胶浓度为0.30.7%，DNA片段大小位于两者之间则所需胶浓度为0.81%。具体琼脂糖浓度与DNA分离范围的关系如下表9所示：琼脂糖浓度/%0.30.60.70.91.21.52.0线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1表1 琼脂糖浓度与DNA分离范围3. 电压在电场强度增加时，不同分子量的DNA段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小10,11。一般采用恒压电源,电压选择为5 V/cm左右(长度以两个电极之间的距离计算)。电压增高，电泳时间缩短，核酸条带相对来说不够整齐、清晰，过高时会出现弯月形条带；相反，电压降低，电泳时间较长，核酸条带相对整齐、清晰。4. 缓冲液常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）。双链线状DNA片段在TAE中的迁移速率比在TBE中快，但这些系统的分辨能力几乎相同，只是超螺旋DNA在TAE中的分辨率要比在TBE中更好。缓冲液浓度要适中，若浓度过低，溶液中缺少离子，电流太小，DNA迁移慢；反之，高离子强度的缓冲液由于电流太大会产生大量热量12，严重时，会造成DNA的变性和凝胶熔化。电泳缓冲液一般可重复使用多次,但若出现浑浊情况就应及时更换，否则影响电泳分辨率9。5. 染料预制凝胶染色法即胶染法，由于在制备凝胶时直接将染料加在凝胶中，电泳时有些染料会嵌入DNA13，可能会影响DNA的迁移率。如当核酸和EB泳动到凝胶的适当位置时，EB染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，负电荷减少，使线状DNA迁移率降低15%7。1.3 电泳方法1.电泳类型琼脂糖凝胶电泳共有两种类型：垂直型及水平型（平板型）。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。本实验选用的电泳方法是水平型，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，从而节约凝胶和染料。2.缓冲液系统为了便于保存，电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。如：TAE配制成50的存储液，使用时稀释成1的工作液；TBE溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5溶液，使用时稀释成0.5的工作液。3.凝胶的制备以稀释好的缓冲工作液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入胶槽，插入梳子，自然冷却。胶染法染色时，要在稍冷却（60左右14）的琼脂糖溶液中滴入适量染料。泡染法则不用加染料。4.样品配制与加样DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25溴酚蓝或其他指示染料，含有10-15蔗糖或510甘油，以增加其比重，使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带，可改用2.5Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。5.电泳在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。随着电场强度的增加，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此，在低浓度、低电压下，分离DNA片段效果较好。随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的迁移并没有显著的影响。因此，通常在室温下进行电泳即可，只有当凝胶浓度低于0.5时，为增加凝胶硬度，可在4进行电泳15。6.染色和拍照胶染法电泳后直接在凝胶成像系统下观察DNA条带，拍照，输出照片，并进行有关的数据分析。泡染法要在电泳结束后，要将凝胶放置在配制好的染液中避光染色0.51小时左右。再取出进行观察拍照。2选题背景2.1 立题依据及研究意义近年来分子生物学得到了迅速发展，聚合酶链式反应（PCR）是公认的一种简便、准确的核酸定量检测技术。核酸电泳作为分离、纯化、鉴别核酸的重要方法，是分子生物学的核心技术之一。然而，它所能检测的极限及精确度依赖于显示DNA的染色方法。核酸电泳常用溴化乙锭（EB）作染料。EB能使凝胶中的DNA合RNA很好得着色，但EB具有成本高、毒性强、强致突变性、环境污染严重等缺点。本实验旨在通过将3种新型染料分别用于电泳染色，与传统染料EB对比，找出既染色效果好，又毒性小，不具致突变性的核酸染料，以期能替代EB成为实验用的普通染料。2.2 研究领域发展现状及展望现在研究者正在不断研究推出既染色效果好，又不具有致突变性的核酸染料，以期能替代EB成为实验用的普通染料，从而减少由EB染色带来的环境污染。新型染料更是层出不穷，如：GoldView、GelRed、GelGreen、GenGreen、GeneFinder、SYBR Green、SYBR Green等。其中不乏染色效果堪比EB甚至超越EB的染料，然而有些在稳定性、对DNA的迁移影响、灵敏度个、毒性等方面还存在一些问题。该领域可能的发展方向是：EB将被逐渐替代，甚至淘汰。将有经济实用、操作简便、条带清晰、定量灵敏、相关性好、样品用量少、时间成本低、而且更好地保障工作人员的健康和周围环境安全的染料，并形成标准化操作方案。3多种染料概况3.1 EB溴化乙锭(EB)是核酸电泳最常用的染料。它能使凝胶中的DNA和RNA很好的着色，从而显示凝胶中核酸的相应位置。但EB具有灵敏度差、毒性强、难以降解转化、净化处理繁琐、环境污染严重等缺点。大量文献报道，包括果蝇、小鼠等的实验均证实小剂量的EB亦存在致突变、抑制细胞生长等问题，长期使用极有可能对操作人员造成危害。废液处理也存在生物安全隐患，污染环境1618。因此实验结束后，应对含EB的溶液及其污染物进行净化处理再行弃置，以避免污染环境。3.2 GelRedGelRed 是一种无毒性的新型核酸染料。GelRed 独特的油性和大分子量特点使其不能穿透细胞膜进入细胞内，艾姆斯氏试验结果也表明，该染料的诱变性远远小于 EB。GelRed 灵敏度高，适用于各种大小片段的电泳染色，对核酸迁移的影响小于 SYBR Green I。 GelRed稳定性高，适用于使用微波或其它加热方法制备琼脂糖凝胶；室温下在酸或碱缓冲液中极其稳定，耐光性强。此外，它操作简单，EB 一样，与在预制胶和电泳过程中染料不降解；而电泳泡染色过程也只需30分钟且无需脱色或冲洗，即可直接用紫外凝胶透射仪观察。GelRed适用范围广，可选择电泳胶染色（胶染法）或电泳泡染色（泡染法） ；适用于琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳；可用于 dsDNA、ssDNA 或 RNA 染色。 3.3 GenGreenGenGreen稳定性极好，适用于使用微波或其他方法加热，可以在室温下保存。其独特的油性和大分子量特点使其不能穿透细胞膜进入细胞内，艾姆斯氏试验结果表明，该染料的诱变性远小于EB。适应性广泛，适用于预制凝胶和凝胶电泳泡染色，适用于琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳，可用于 dsDNA、ssDNA或 RNA染色。染色过程简单，与 EB 一样，在预制胶和电泳过程中不必担心染料降解；而电泳泡染色过程也只需 30 分钟且无需脱色或冲洗，即可直接用可见光凝胶透射仪观察。3.4 SYBR GreenSYBR Green是一种新推出的核酸荧光染料，灵敏度非常高，至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25100倍19。适用于各种电泳分析，操作简单，无须脱色或冲洗。在凝胶核酸染色中的使用方法跟EB完全相同，但不具有EB的强致突变性、强致癌性。用SYBR Green I染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低，可适用于多种电泳分析。可用于对凝胶中的核酸染色，也可用于对细胞中的核酸染色，是相对比较安全的染料。第二章 实验材料与方法1材料及仪器1.1实验试剂1）0.5ug/ulDNA （北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）2） GelRed（10,000 水溶液）3） GelRed3 染色液4） GenGreen 10,000（鼎国）5） GenGreen3 染色液6） SYBR Green 10,000 ,DMSO( DH392-2,Invitrogen分装)7） SYBR Green3 染色液8） EB(NEP028,鼎国)9） NaOH10） EDTA11） Tris碱12） 硼酸13） 冰乙酸14） 琼脂糖（Agarose)15） 6 loading buffer以上实验药品和试剂均为分析纯。915的试剂和药品均购自国药集团化学试剂有限公司。1.2实验仪器1） 高温高压灭菌锅 TOMY SX-5002） 电热恒温干燥箱 恒宇 JB/T5520-913） 电子天平 METTLER TOLEDO AL1044） 基础型电泳电源 CAVOY5） 水平电泳槽 上海天能科技有限公司6） 微波炉 美的7） 恒温水浴锅 精宏实验设备有限公司8） 凝胶成像系统（312nm激发） BIO-RAD 9） PH计 Mettler Toledo10） 0.22ul移液枪 Thermo11） 220ul移液枪 Thermo12） 20200ul移液枪 Thermo13） 1001000ul移液枪 Thermo 14） 计算机 Lenovo1.3实验用品1）250ml三角烧瓶 2）1000ml广口瓶 3）100ml量筒 4） 聚丙烯塑料盒 5） 铝箔 6） 药勺 7） PE手套 8） 橡胶手套 9） EP管 10） 枪头 11） 报纸 12） 梳子 13） 胶槽 14） 保鲜膜15） 报纸 2实验方法2.1 试剂准备与配制1.DNA浓度梯度稀释1） EP管、枪头连盒放入高压灭菌锅中灭菌20min，再放入烘箱中8h烘干。2） 取10ul的0.5ug/ulDNA母液于EP管中，加入990ul的ddH2O，稀释成5ng/ul溶液。3）按照下表配制不同浓度（0.1、0.3、0.5、0.8、1ng/ul）的DNA溶液。然后放入4冰箱保存。管号1234567VDNA(5ng/ul)/ul2610162060100VddH20/ul9894908480400表2 DNA浓度梯度配制表2. 0.5mol/l EDTA溶液的配制1） 在电子天平上称取14.612gEDTA，置于100ml三角烧瓶中。2） 在三角烧瓶中加入约80ml的ddH2O，在水浴锅中60适当加热，在磁力搅拌器上充分搅拌。3） 边搅拌边用NaOH调解PH至8。（约用2gNaOH）4） 搅拌至固体完全溶解。5） 待溶液冷却后，再用NaOH调解PH至8。6） 在三角烧瓶中加ddH2O，定容到100ml。7） 高温高压灭菌后，室温保存。3. 5TBE的配制1）在电子天平上称取Tris碱27g、硼酸13.75g。置于1000ml广口瓶中。2）加入10ml的0.5mol/L EDTA。3）加水补足500ml。4）使用时稀释成0.5的工作液即可使用。4. 50TAE的配制1） 在电子天平上称取Tris碱60.5g。置于1000ml广口瓶中。2） 加入50ml的0.5mol/L EDTA。3） 加入14.275ml冰乙酸。4） 加水补足250ml。5） 使用时稀释成1的工作液即可使用。5. 染色液的配制 用H2O将GelRed 10,000储液（或GenGreen、SYBR Green储液）稀释约3,300倍到0.1M NaCl中，制成 3 染色液。（例如将15L GelRed 10,000储液和5mL 1M NaCl加到 45mL H2O 中）。 2.2 琼脂糖凝胶的制备2.2.1胶染法（胶染法）琼脂糖凝胶的制备1.以TBE为电泳缓冲液1）称量 在电子天平上准确称取琼脂糖干粉0.350g，倒入150ml三角烧瓶中。2）熔胶 在锥形瓶中加入35ml的0.5TBE缓冲液，与琼脂糖干粉混合，配成1%的琼脂糖浓度。在微波炉内反复加热23次至琼脂粉溶解并无气泡。取出待冷却。3）倒胶 琼脂糖浆正在冷却时，在干净的胶槽内摆好合适的梳子，形成加样孔。 待熔化的凝胶稍冷却后，在三角烧瓶中滴加2L核酸染料。轻轻地摇动以便充分混匀。 冷却至不烫手（60C），浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。4）拔梳 待胶完全凝结后，轻轻拔掉梳子。2.以TAE为电泳缓冲液1）称量 在电子天平上准确称取琼脂糖干粉0.350g，倒入150ml三角烧瓶中。2）熔胶 在锥形瓶中加入35ml的1TAE缓冲液，与琼脂糖干粉混合，配成1%的琼脂糖浓度。在微波炉内反复加热23次至琼脂粉溶解并无气泡。取出待冷却。3）倒胶 琼脂糖浆正在冷却时，在干净的胶槽内摆好合适的梳子，形成加样孔。 待熔化的凝胶稍冷却后，在三角烧瓶中滴加2L核酸染料。轻轻地摇动以便充分混匀。 冷却至不烫手（60C），浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。4）拔梳 待胶完全凝结后，轻轻拔掉梳子。2.2.2 泡染法（泡染法）琼脂糖凝胶的制备1.以TBE为电泳缓冲液1）称量 在电子天平上准确称取琼脂糖干粉0.350g，倒入150ml三角烧瓶中。2）熔胶 在锥形瓶中加入35ml的1TBE缓冲液，与琼脂糖干粉混合，配成1%的琼脂糖浓度。在微波炉内反复加热23次至琼脂粉溶解并无气泡。取出待冷却。3）倒胶 琼脂糖浆正在冷却时，在干净的胶槽内摆好合适的梳子，形成加样孔。 冷却至不烫手（60C），浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。4）拔梳 待胶完全凝结后，轻轻拔掉梳子。2.以TAE为电泳缓冲液1）称量 在电子天平上准确称取琼脂糖干粉0.350g，倒入150ml三角烧瓶中。2）熔胶 在锥形瓶中加入35ml的1TAE缓冲液，与琼脂糖干粉混合，配成1%的琼脂糖浓度。在微波炉内反复加热23次至琼脂粉溶解并无气泡。取出待冷却。3）倒胶 琼脂糖浆正在冷却时，在干净的胶槽内摆好合适的梳子，形成加样孔。 冷却至不烫手（60C），浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具。4）拔梳 待胶完全凝结后，轻轻拔掉梳子。2.3 点样与电泳1）在水平电泳槽中加入电泳缓冲液。2）将凝胶安放在电泳槽内，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm。3）在EP管内或保鲜薄膜上混合10LDNA样品和2L的6上样缓冲液。每个浓度混合2个。4）用微量移液器将样品混合液缓慢加至浸没凝胶的加样孔内。每个浓度点2个孔。5）关上电泳槽盖，接好电极插头。DNA应向阳极侧移动。电压给于100V。6）待染料到适当距离时停止电泳。7）关上电源，拔出电极插头，打开电泳槽盖。2.4结果观察与记录2.4.1 泡染法（泡染法）电泳泡染色将凝胶小心地放入聚丙烯容器中。缓慢加入足量的3染色液浸没凝胶。室温避光染色30min左右，最佳染色时间根据凝胶厚度以及琼脂糖浓度不同而略有 不同。染色时间通常介于30min到1h。胶染法（胶染法）电泳后可直接观察结果，无需再染色。2.4.2 紫外光下观察拍照1） 在紫外凝胶成像仪上铺上保鲜膜。2） 取出凝胶，在紫外凝胶成像仪上成像拍照，输出照片，观察结果。 第3章 实验结果与分析1电泳分析 1.1胶染法(TBE为缓冲液) 1.1.1 EB染色电泳图图1.胶染法、以TBE为缓冲液、EB为染料电泳图分析：电泳时间20min灵敏度最少可见8ng背景荧光信号较强DNA条带的整齐度有无拖尾无有无扭曲无边缘是否清晰锐利是1.1.2 GelRed染色电泳图图2.胶染法、以TBE为缓冲液、GelRed为染料电泳图分析：电泳时间20min灵敏度最少可见3ng背景荧光信号弱DNA条带的整齐度有无拖尾无有无扭曲浓度高时轻微扭曲边缘是否清晰锐利是1.1.3 GenGreen染色电泳图图3.胶染法、以TBE为缓冲液、GenGreen为染料电泳图分析：电泳时间20min灵敏度最少可见3ng背景荧光信号弱DNA条带的整齐度有无拖尾无有无扭曲无边缘是否清晰锐利是1.1.4 SYBR Green染色电泳图图4.胶染法、以TBE为缓冲液、SYBR Green为染料电泳图分析：电泳时间20min灵敏度最少可见1ng背景荧光信号弱DNA条带的整齐度有无拖尾有，轻微拖尾现象有无扭曲浓度高时轻微扭曲边缘是否清晰锐利浓度高时否1.2胶染法(以TAE为缓冲液)1.2.1 EB染色电泳图图5.胶染法、以TAE为缓冲液、EB为染料电泳图分析：电泳时间20min灵敏度最少可见8ng背景荧光信号较强DNA条带的整齐度有无拖尾无有无扭曲无边缘是否清晰锐利是1.2.2 GelRed染色电泳图图6.胶染法、以TAE为缓冲液、GelRed为染料电泳图分析：电泳时间20min灵敏度最少可见3ng背景荧光信号弱DNA条带的整齐度有无拖尾无有无扭曲浓度高时轻微扭曲边缘是否清晰锐利是1.2.3 GenGreen染色电泳图图7.胶染法、以TAE为缓冲液、GenGreen为染料电泳图分析：电泳时间20min灵敏度最少可见3ng背景荧光信号弱DNA条带的整齐度有无拖尾无有无扭曲无边缘是否清晰锐利是1.2.4 SYBR Green染色电泳图图8.胶染法、以TAE为缓冲液、SYBR Green为染料电泳图分析：电泳时间20min灵敏度最少可见3ng背景荧光信号弱DNA条带的整齐度有无拖尾有，比用TBE为缓冲液时严重有无扭曲浓度大时轻微扭曲边缘是否清晰锐利浓度大时否1.3泡染法(以TBE为缓冲液)1.3.1 EB染色电泳图图9.泡染法、以TBE为缓冲液、EB为染料电泳图分析：电泳时间20min染色时间60min灵敏度最少可见58ng背景荧光信号较强DNA条带的整齐度有无拖尾无有无扭曲无边缘是否清晰锐利是1.3.2 GelRed染色电泳图图10.泡染法、以TBE为缓冲液、GelRed为染料电泳图分析：电泳时间20min染色时间60min灵敏度最少可见1ng背景荧光信号弱DNA条带的整齐度有无拖尾无有无扭曲无边缘是否清晰锐利是1.3.3 GenGreen染色电泳图图11.泡染法、以TBE为缓冲液、GenGreen为染料电泳图分析：电泳时间20min染色时间60min灵敏度最少可见5ng背景荧光信号弱DNA条带的整齐度有无拖尾无有无扭曲无边缘是否清晰锐利是1.3.4 SYBR Green染色电泳图图12.泡染法、以TBE为缓冲液、SYBR Green为染料电泳图分析：电泳时间20min染色时间60min灵敏度最少可见13ng背景荧光信号弱DNA条带的整齐度有无拖尾无有无扭曲无边缘是否清晰锐利是1.4 泡染法(以TAE为缓冲液)1.4.1 EB染色电泳图图13.泡染法、以TAE为缓冲液、EB为染料电泳图分析：电泳时间20min染色时间60min灵敏度最少可见58ng背景荧光信号较强DNA条带的整齐度有无拖尾无有无扭曲无边缘是否清晰锐利是1.4.2 GelRed染色电泳图图14.泡染法、以TAE为缓冲液、GelRed为染料电泳图分析：电泳时间20min染色时间60min灵敏度最少可见1ng背景荧光信号弱DNA条带的整齐度有无拖尾无有无扭曲无边缘是否清晰锐利是1.4.3 GenGreen染色电泳图图15.泡染法、以TAE为缓冲液、GenGreen为染料电泳图分析：电泳时间20min染色时间60min灵敏度最少可见5ng背景荧光信号弱DNA条带的整齐度有无拖尾无有无扭曲无边缘是否清晰锐利是1.4.4 SYBR Green染色电泳图图16.泡染法、以TAE为缓冲液、SYBR Green为染料电泳图分析：电泳时间20min染色时间60min灵敏度最少可见13ng背景荧光信号弱DNA条带的整齐度有无拖尾无有无扭曲无边缘是否清晰锐利是2不同染料比较分析2.1视觉效果通过3中新型染料GelRed、GenGreen、SYBR Green与传统染料EB的染色视觉效果对比，发现：1） 在背景信号方面，不管是胶染法还是泡染法，以TAE或TBE为缓冲液，用EB为染料时，电泳后的凝胶在紫外光照射下，背景信号较高，条带不明显。而另外三种新型染料则都体现出了背景信号低、样品信号高的优势，利于观察条带。2） 在条带质量方面，使用EB和GenGreen为染料跑出的条带，条带都边缘清晰、无扭曲和拖尾现象。用胶染法和泡染法的效果相当，缓冲液不同对染色效果也无明显影响；使用GelRed为染料时，在泡染法时条带质量好。但用胶染法染色后的条带会出现轻微扭曲、边缘不平整的现象，且DNA浓度越高扭曲现象越严重（见图17、18）。缓冲液的不同对其无明显影响；使用SYBR Green为染料时，在胶染法时条带会出现拖尾和扭曲现象，且DNA浓度越高拖尾、扭曲越严重（见图19、20）。而泡染法则不会出现这些现象，条带清晰质量好。在缓冲液TAE中扭曲拖尾比在TBE中更为严重。3） 在灵敏度方面，不管何种染色方法、何种缓冲液，4中染料都能显出出8ng以上的DNA。且电泳结果显示3种新型染料的灵敏度都高于EB。在312nm紫外光照射下，GelRed与SYBR Green的灵敏度相当，GenGreen次之，EB灵敏度最低。缓冲液的不同对灵敏度的影响不大。综合比较背景信号、条带质量和灵敏度三个因素来考量各染料的视觉效果，得出以下结论：使用胶染法时，GenGreen的视觉效果优于EB；使用泡染法时，GenGreen、GelRed和SYBR Green的视觉都效果优于EB。图17.胶染法、以TAE为缓冲液、4种染料电泳对比图图18.胶染法、以TBE为缓冲液、4种染料电泳对比图图19.泡染法、以TAE为缓冲液、4种染料电泳对比图图20.泡染法、以TBE为缓冲液、4种染料电泳对比图染料缓冲液染色方法视觉效果灵敏度（ng）背景荧光信号有无拖尾有无扭曲边缘是否清晰EBTBE胶染较强无无是8泡染较强无无是58TAE胶染较强无无是8泡染较强无无是58GelRedTBE胶染弱无有是3泡染弱无无是1TAE胶染弱无有是3泡染弱无无是1GenGreenTBE胶染弱无无是3泡染弱无无是5TAE胶染弱无无是3泡染弱无无是5SYBR Green TBE胶染弱有有否1泡染弱无无是13TAE胶染弱有有否13泡染弱无无是13表3.四种染料染色效果比较表2.2毒性EB：具有强毒性、强致癌性和高诱变性。GelRed：由美国安全认定无毒，其水溶染色剂通过美国环保局安全认定，废弃物可直接倒入下水道，而不会造成任何环境污染。独立的测试服务公司（ Litron Laboratories, Inc. ）进行的标准艾姆斯氏测试结果表明， 在 18.5 g /mL （该浓度远高于推荐用于电泳后染色的 约 4 g/mL 的 3X 染色液 ）浓度下，仅在 S9 代谢活化时有微弱的诱变性20。诱变性远远低于EB。GenGreen：独特的油性和大分子量特点使其不能穿透细胞膜进入细胞内，艾姆斯氏试验结果表明，艾姆斯氏测试结果表明，GenGreen在凝胶染色浓度下完全没有诱变性，因此完全没有致癌毒性。21。SYBR Green I：属花箐染料，能透过细胞膜进入活体细胞内，但容易生物降解，不会在体内残留，低毒。诱变性低于EB22。2.3 对DNA的迁移影响EB：对核酸迁移的影响小于 SYBR Green I23。GelRed：对核酸迁移的影响小于 SYBR Green I20。GenGreen：对核酸迁移的影响小于 SYBR Green I21。SYBR Green I：对核酸迁移有一定影响，会造成大片段的滞后22。2.4 可重复利用率EB：可重复利用率高，稳定不易分解，泡染的染色液可多次重复使用。GelRed：可重复利用率低，通过实验发现，60ml的3 染色液一般只能泡染一块胶。染第二块条带颜色暗，第三块基本看不到条带。GenGreen：可重复利用率低，通过实验发现，60ml的3 染色液一般只能泡染一块胶。染第二块条带颜色暗，第三块基本看不到条带。SYBR Green I：可重复利用率低，易分解， 3 染色液不可长期保存使用。60ml的3 染色液一般只能泡染一块胶。染第二块条带颜色暗，第三块基本看不到条带。2.5稳定性EB：稳定，可在室温下保存。GelRed：非常稳定，可长期在室温下保存。GenGreen：室温下在酸或碱缓冲液中极其稳定，耐光性强。适用于使用微波或其它加热方法制备琼脂糖凝胶；SYBR Green I：在常用的微碱性电泳缓冲溶液或预制凝胶中会快速降解，稳定性差24。因此实验时配胶和点样的速度要快。2.6时间成本EB：对于1kb的DNA，电压100V时，电泳时间为20min，泡染时间为60min。GelRed：时间同EB。条带迁移率与EB相当。GenGreen：时间同EB。条带迁移率与EB相当。SYBR Green I：时间同EB。条带迁移率与EB相当。2.7价格EB：50元/1mlGelRed：980元/500ul GenGreen：400元/500ul SYBR Green I 10000 x,DMSO：450元/50ul（以上价格均查自鼎国网上价格表）染料毒性对DNA的迁移影响可重复利用率稳定性泡染时间价格EB强小高高60min低GelRed无小低高60min中GenGreen低小低高60min中SYBR Green 低较大低差60min高表4.四种染料综合因素比较表3实验结果从多个方面比较三种新型染料GelRed、GenGreen、SYBR Green与传统染料EB，通过一系列实验得出以下结果：1） 在视觉效果方面，虽然GelRed、GenGreen、SYBR Green的灵敏度都高于EB，但在胶染法时，用SYBR Green预制的凝胶上的条带会出现拖带和扭曲现象，GelRed预制的凝胶上的条带会发生扭曲现象。而只有GenGreen不管用何种染色方法，都能保证条带的清晰度，不扭曲、不拖带,虽然GenGreen的灵敏度不及SYBR Green和GelRed，但其视觉效果最好最稳定。2） 在毒性方面，3中新型染料的毒性和致突变性都低于EB。其中GelRed和GenGreen无毒，SYBR Green低毒。3） 在对DNA的迁移影响方面，SYBR Green对DNA的迁移影响最大，GelRed、GenGreen和EB对DNA的迁移影响都较小。4） 在可重复利用率方面，EB的可重复利用率高，而GelRed、GenGreen和SYBR Green的可重复利用率都比较低。5） 在染料本身的稳定性方面，SYBR Green的稳定性最差，GelRed、GenGreen的稳定性都与EB相当。6） 在时间成本方面，用何种染料对电泳的速率基本没有影响。7） 在价格方面，染料价格从低到高依次为：EB、GenGreen、GelRed、SYBR Green。EB不但价格最低，加上其可重复利用率高，更加节省了成本。GenGreen和GelRed价格适中，一般实验室用途可以接受。而SYBR Green价格昂贵，在使用泡染法时虽然染色效果好但是要用去大量染料，花费昂贵。第4章 讨论1实验注意事项1） 实验前确认好所有所需溶液需要的量然后一次配置，以保证试验中的平行试验间的可对比性，试验结果的讨论都是建立在单一变量的基础上。2） 电泳的电压要恒定，在本实验中电压均为100V。3） 取冻存的DNA稀释时，在取样前要将DNA弹匀或适当离心，避免DNA浓度不均而取出的样品浓度不准确。同理，在每次点样前都要将EP管中的DNA弹匀或适当离心。4） 制胶模具要保持清洁无污染。首先要将制胶模具清洗干净，要注意核酸、蛋白及其它可见杂物进入凝胶。琼脂糖应完全熔化呈清澈、透明的液体。5） 溶解琼脂糖时，在微波炉内反复加热23次，且每次加热后要轻轻摇匀，使气泡都跑出。6） 胶染法滴加染料时，要待琼脂糖溶液稍冷再滴加染料，充分摇匀,及时倒入制胶槽,动作要轻,避免产生气泡。若温度过低,则胶冷却后不均一,电泳谱带弯曲。以冷却到不烫手为宜（60左右）。7） 选择合适的梳子，每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1 mm,否则,拔梳板时易损坏凝胶孔底层,导致点样后样品渗漏。8） 要保证胶的凝固时间,确保凝胶形成稳定均一的孔径,经实践发现一般在胶冷却3045 min后即完全凝固，可拔梳子点样电泳。9） 拔梳子时弱不好拔，可滴加一些缓冲液。10） 电泳槽中的电泳缓冲液高度要没过凝胶约1mm。11） 配胶用的缓冲液必须与电泳槽中的缓冲液相统一。12） 电泳时间不是固定的。电泳时可透过透明电泳槽盖观察，一般是前沿指示剂达到每排胶孔距离的2/3处时停止电泳。13） DNA与6上样液（Loading Buffer）的比例应该是5：1。由于小体积溶液不好点样且点样时微量的损失对样品浓度的影响也比较大，因此使用10ul样品混合2ul的6上样液点样。14） 上样缓冲液一般采用甘油增加样品比重,但放置一段时间后会使其沉降不均.因此,使用时应先摇匀后再取用,否则样品会漂移散失.15） 泳缓冲液一般可重复使用多次,但若出现浑浊情况就应及时更换,否则影响电泳分辨率。每次电泳前要将电泳缓冲液重新摇匀,使正负极的PH值基本一致.因为TAE的缓冲容量较小,每次电泳后,两极PH相差较大,阳极呈碱性,阴极呈酸性,这样会造成核酸泳动消失,导致电泳失败。16） 3 GelRed 、3 GenGreen染色液可以大量制备，在室温下避光保存直至用完。而SYBR Green由于其性质不稳定，其3染色液不可长久保存，要现配现用。2问题及讨论1） DNA的降解为保证试验中的平行试验间的可对比性，实验前确认好所需溶液需要的量然后一次配置，试验结果的讨论都是建立在单一变量的基础上。但稀释好的DNA经过一段时间后电泳发现拖带、条带不清晰现象，排除配胶时胶槽不清洁、琼脂糖未完全溶解、梳子没拔好等原因，分析这可能是DNA发生了降解，影响电泳结果。应当在实验的准备阶段，先取若干份DNA母液分别装入EP管中，-20冻存。每隔一段时间（一星期左右）要取出冻存的分装DNA重新稀释浓度。这样既可以兼顾实验的平行性，又能避免由于DNA降解而引起的实验误差。2） 泡染液染色次数GelRed和GenGreen的染料说明书上显示单次使用的3染色液可重复使用 3 次左右。而实际实验时，染第二块胶时条带已经很暗，染第三块时基本看不到条带。经分析，原因可能为点样的DNA浓度很低，因此在染料量偏少的情况下染色效果不佳。因此在实际操作时，60ml的3染色液（含染料12ul）只能染一块胶。3） 染料背景荧光信号背景荧光信号，即胶块本身的亮暗程度，是由于凝胶本身吸收了少量荧光染料而显色。通过分析不同染料的电泳图发现，EB的背景荧光信号较高，而GelRed、GenGreen和SYBR Green I的背景荧光信号都较弱。背景荧光信号低，样品荧光信号高，则对比明显，更容易观察到条带。EB的背景荧光信号较高，可能是因为EB分子容易与琼脂糖分子结合，从而使胶块染色。4） SYBR Green I拖尾问题SYBR Green I有拖尾问题可能与其跟DNA的结合方式有关。SYBR Green I是花菁染料，通过静电吸引与DNA结合,由于DNA带的负电是供电子基团，而此染料带正电，因此相互吸引，并且由于DNA带的负电是供电子基团，荧光增强。而EB、GelRed和GenGreen的染色原理都是直接嵌入DNA碱基对之间。据此推测静电吸引可能会影响DNA的迁移率，因此在胶染法时会出现条带扭曲、拖带的现象，而泡染法时则不会出现此类现象。5） SYBR Green的灵敏度根据文献资料，SYBR Green的灵敏度极高，可检出20pg DNA，高于EB染色法10-25倍19。可是在本实验中没有体现出这么高的灵敏度。经查阅资料，发现SYBR Green I 的最大吸收峰在蓝绿可见光区，而不在紫外区，因此SYBR Green I在蓝盾可见光系列仪器下观测具有更高的灵敏度25。其在紫外区300nm380nm也有一个吸收峰，使其染色结果也可以使用紫外光相关设备进行分析。本实验采用的是312nm激发的UV凝胶成像系统，因此达不到SYBR Green I的最大灵敏度。资料显示，SYBR Green I的最佳使用方法是“电泳后浸胶染色”，但是由于其价格昂贵，“浸胶染色”的染料费用很高。所以国内许多实验室使用所谓的“样品预染色方法”，即电泳前将染料直接加入样品中染色，而这种染色方法的灵敏度较低，与EB染色法相当或略低26。本实验并未采用染样品法。而用SYBR Green胶染法及泡染法染色后的凝胶，在紫外光下，显示其灵敏度还是略高于EB，与GelRed 相当。6） GelRed的条带扭曲问题既然跟DNA的结合方法与EB和GenGreen一样，为什么只有GelRed出现了胶染法时浓度较高条带发生扭曲的现象呢？据推测，可能与染料本身的构型和插入DNA位置的不同有关。EB含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合没有碱基序列特异性,直接嵌入DNA碱基对之间,大约每2.5个碱基插入一个EB分子24，这种结合方式对DNA的空间结构影响不大。其他染料由于其构象和插入位置的不同对DNA空间构型的影响也不同，对DNA的迁移率也有不同影响。7） 存在的不足本实验只对标准品1kb的DNA进行了电泳分析。设计的浓度梯度可以较为准确地测出不同染料的灵敏度。但并未对其他的PCR产物或提取的质粒DNA进行电泳分析，尚不能确定使用其他样品进行电泳时染料的效果是否与本实验中的一致。因此所得出的结论只适用与本实验体系中。若要形成标准化操作方案，还需更多的实验论证，或在平时实践中摸索和找出规律。第5章 结 论本文综合比较三种新型染料GelRed、GenGreen、SYBR Green与传统染料EB在琼脂糖凝胶染色中的视觉效果、毒性、对DNA的迁移影响、可重复利用率、稳定性、时间成本以及价格等多方面因素，得出的结论为新型荧光染料GenGreen拥有染色效果佳、性质稳定、无毒性、致突变性低、对DNA的迁移影响小、价格适中等优点，在本实验体系中，GenGreen可以完美地替代EB。致 谢时光荏苒，转眼间我四年的大学生活即将结束，回顾四年，是老师、同学以及社区阿姨的关心和帮助伴我度过了充实而快乐的大学时光。在这里我首先要感谢的是我的导师华子义老师，在整个过程中您给了我很大的帮助。在论文题目制定时，您首先帮助我确定了题目大方向，同时又帮我具体分析，使我最后选择对比不同染料的染色效果，让我在实验时有了具体方向。在具体实验流程制定时，我的思路不是很清晰，经过您的帮忙，让我理顺了实验思路。在完成论文初稿后，您认真查看了我的文章，指出了我存在的很多问题。在此十分感谢您的细心指导。您严谨的科研态度及缜密的逻辑思维让我钦佩，每次听完您的教导之后，我都会认真反思，反思后我都能够从一个新的层面认识自己。能够成为您的学生，我真的感到非常的荣幸；也非常感谢近半年来您对我的淳淳教导。感谢四年来所有的实验课老师们：是你们为我开启了进入实验室的大门，让我有机会进入实验室学习，让我体会到科学世界的丰富多彩。感谢贺燕云老师，是您一步步耐心地指导我如何做实验，如何分析实验结果，并在我实验遇到问题时，不断地鼓励我，让我不要气馁，没有您的悉心指导，我不可能顺利的完成毕业论文，真的非常感谢您！感谢公司的黄彪老师，每当我向您请教实验问题时，您总是耐心的指导我，是教会了我很多实验技巧和实验操作方法。感谢陈媛媛老师，是您一次次不厌其烦地为我们奔波采购实验用品，还帮助我修改实验设计。感谢和我一起并肩努力的陈思迪同学，是你的陪伴和帮助让我顺利地完成毕业论文。我最想感谢的是我的父母。感谢你们二十多年来对我的养育之恩；感谢你们不计回报的爱；感谢你们对我的包容和支持。随着我慢慢长大才知道你们平日的辛苦与不易，你们对我的关心与爱护是我前进的动力，每每实验受挫沮丧之时你们在我脑海中的面容总是我最强的助推剂。由衷的感谢你们！最后，要感谢所有曾经帮助过我的人，谢谢你们，因为有你们的帮助，我的大学生活充实而快乐。也祝愿你们每个人都身体健康、工作顺利。 沈四维 2013.5.27参考文献1高凌云,陈一峰,李一伟.琼脂糖凝胶电泳法的探讨J.福建医科大学学报, 2001, 35(1):93.2潘伟明.琼脂糖凝胶电泳装置及方法的改进J.中山大学学报:自然科学版,2004,24(1