狂犬病毒基础知识与生产工艺

狂犬病毒基础知识及疫苗生产工艺 2016年04月 目录 狂犬病病毒归属于弹状病毒科 Rhabdoviridae 病毒形态是一端平坦或略凹状 另一端为半原形 酷似子弹 故得名弹状病毒 病毒大小75 175nm经组织培养后 病毒的形态多呈两端平坦状的颗粒 单链RNA病毒 狂犬病毒的特点 狂犬病毒形状 狂犬病病毒电镜照片 狂犬病毒对外界的抵抗力很弱 对温度敏感 60 30 60min 100 2min即可灭活 病毒对阳光 紫外线敏感 各种常见的消毒剂如肥皂水 碘酒 3 来苏尔 75 酒精等均可使其灭活 抗生素对其却无灭活作用 狂犬病毒的特点 狂犬病病毒最大的特点是对神经组织的嗜性远远大于其他组织 在神经组织内病毒复制的比率远比在其他组织内高 狂犬病毒的特点 1 狂犬病毒形状为子弹形 一端为椭圆形 另一端平整 2 狂犬病毒具有嗜神经性 主要在中枢神经内繁殖 3 狂犬病毒最初进入伤口时 不进入血液循环 而是在被咬伤的肌肉组织中复制 然后侵入神经系统 4 狂犬病毒在神经轴中的移动速度约5 100mm 天 如一定范围内 10um 2cm 的轴突同时受感染 病毒移行速度甚至会更快 狂犬病毒的特点 野生动物与家畜是狂犬病的传染源 人类狂犬病由狗 猫直接传染者占90 以上 其次为牛 主要是水牛 猪 兔 马 驴骡以及野生动物 狂犬病毒的宿主动物 狂犬病致病机理 一般20 60天从暴露后数天到数年 差别非常大主要的影响因素 感染的病毒数量感染的病毒株暴露的严重程度暴露的部位 一般20 60天1月内发病71 3月内发病87 潜伏期 人用狂犬病疫苗发展史 1882年 巴斯德成功在牛脑中分离到狂犬病毒株 并在兔脑内连续传90代 成为固定毒 1885年 巴斯德尝试研制减毒活疫苗1911年 Semple在巴斯德的研究基础上 研制出脑组织灭活疫苗 1956年 Peck研究制备鸭胚疫苗 DEV 该疫苗在美国和其他国家用作狂犬病暴露后处理并广泛使用了27年 很少观察到严重的副作用 但中和性抗体水平不如脑组织疫苗 1964年 美国研制出人二倍体细胞疫苗 并于1978年开始商品化 目前在美国 加拿大 大多数欧洲国家和几个亚洲国家使用 1984年由法国Merieun研究所研制成功Vero细胞疫苗 国外疫苗发展史 国内疫苗发展史 1949年 羊脑组织疫苗1980年 原代地鼠肾细胞疫苗 淡苗 之后经历了浓缩苗 精致苗 无佐剂纯化苗90年代 引进Vero细胞疫苗2005年6月30日 无佐剂疫苗 人用狂犬疫苗生产工艺 原始种子 3aG4 豚鼠脑内传代 3aG5 地鼠肾细胞传代 4aG 豚鼠脑内传2代 4aG2 建立主代毒种库主代毒种库 4aG2 豚鼠脑内传1代 4aG3 建立主工作毒种库 毒种制备工艺 毒种制备工艺 地鼠 消毒 解剖 取肾 消化 细胞制备 接种病毒 洗换 收获病毒液 灭活病毒 超滤浓缩 纯化 半成品配制 洗瓶 灌装 轧盖 目检 包装 入库 地鼠的挑拣清洗 纯化水4 6遍 注射用水3遍消毒 2 甲醛溶液2遍 0 1 新洁尔灭2遍解剖 扒皮 剪肌 取肾洗肾 消化 0 1 胰蛋白酶每对肾加入3 4ml 置2 8 消化15 18小时 解剖消化工艺 地鼠消毒 解剖地鼠 培养液配制 Hanks 液 营养液 小牛血清 硫酸庆大霉素细胞制备 弃去消化液 洗涤肾块 摇振分散细胞 反复收集数次 细胞培养 37 1 培养90 100小时 细胞制备工艺 细胞培养 地鼠肾细胞 细胞观察毒种配制接种培养吸附 34 1 培养吸附18 24小时 接种病毒工艺 维持液配制 199 0 2 0 4 人血白蛋白 碳酸氢钠洗涤细胞换维持液病毒培养 34 1 培养96 120小时 洗换工艺 细胞观察收获病毒液 收获标准加液 加维持液取样检定保存 收获液置2 8 保存 待检 细胞瓶置34 1 继续培养96 120小时 多次收获病毒液 加液工艺 收获液检查无菌转入加灭活剂 终浓度甲醛溶液250 g ml灭活过程 灭活罐内混匀 于34 1 恒温灭活18 20小时取样检定 病毒灭活工艺 采用截留分子量为300KD的滤膜超滤浓缩至蛋白质含量在2000 3000 g ml范围内 浓缩倍数为50 10倍 按照病毒收获液体积的0 3 0 6倍的灭菌PBS对浓缩液进行分段洗滤 超滤浓缩工艺 浓缩液离心层析介质为琼脂糖凝胶Sepharose4FF纯化 以pH7 5的PBS洗脱 洗脱液流速240 280ml 分钟 280nm紫外检测 收集第一峰 取样检定 纯化工艺 配方计算 抗原含量 4 5IU ml 蛋白质含量应不高于80 g ml配制 将纯化后原液及终浓度为1 的人血白蛋白 40 g ml的硫柳汞转入合并罐内混匀 取样 配制工艺 西林瓶清洗 灭菌 经超声波清洗后350 5分钟干热灭菌分装 疫苗每支装量不少于标示量轧盖 通过传输带传至轧盖间 自动上机进行加盖封口 灌装工艺 外观检查 双眼平视西林瓶 首先检查装量是否准确 再移至目检台黑 白色底板处检查是否有异物 目检工艺 包装规格 小盒 5瓶 人份中盒 10人份 盒大箱 120人份 箱 包装工艺1 包材喷印按包装指令上内容对小盒 中盒 大箱 合格证进行调试印制 产品批号 生产日期 及 有效期至 印制位置适中 字体应清晰 包装前核对对所有包材印制 产品批号 生产日期 及 有效期至 内容的核对应与包装指令内容一致无误 包装工艺2 装盒 将计数后西林瓶逐一进行标签印制贴附 取5只贴签后西林瓶装入白色盒托 上放一份说明书装入小盒 贴上封口签 取10小盒装入一中盒 贴上封口签 取12中盒装入一大箱 最后放一张产品合格证进行封箱捆扎转入2 8 冷库整齐摆放 包装工艺3 电子监管码生成及贴附对10小盒产品进行一级电子条码扫描生成一个二级条码贴附在对应的中盒包装指定位置 对12中盒产品进行二级电子条码扫描生成两个三级条码贴附在对应的大箱包装指定位置 包装工艺4 1 外观 依法进行检查 结果为无色澄明液体 无异物 2 装量 依法进行装量检查 应不低于标示量1 0ml 剂 3 化学检定 1 pH值 依法进行检测 pH值应为7 2 8 0 2 硫柳汞含量 依法进行硫柳汞含量检测 结果应为30 50 g ml 3 游离甲醛含量 依法进行游离甲醛含量检测 结果不得高于40 g ml 成品检定 4 效价测定 依法检查 放行标准应不低于4 0IU 剂 有效期内标准应不低于2 5IU 剂 5 热稳定性试验 疫苗出厂前应进行热稳定性试验 于37 放置14天后依法进行效价测定 应不低于2 5IU 剂 6 牛血清白蛋白残留量测定 依法进行牛血清白蛋白残留量测定 结果应不高于50ng 剂 成品检定 成品检定 7 抗生素残留量测定 依法进行硫酸庆大霉素残留量测定 结果应不高于50ng 剂 8 地鼠肾细胞蛋白质残留量测定 依法进行地鼠肾细胞蛋白质残留量测定 结果应不高于24 g 剂 9 无菌检查 依法进行无菌检查 结果应符合规定 成品检定 10 异常毒性试验 依