生物大分子药物研究前沿

生物大分子药物研究开发前沿 内容第一部分 生物大分子药物及其研发现状第二部分 生物大分子药物传递系统研究进展 第五讲复习思考题 生物技术药物的研发关键环节有哪些 生物技术药物的翻译后修饰方法有哪几种 蛋白质 多肽药物载体型传递系统有哪些 疫苗载体型传递系统有哪些 第一部分 生物大分子药物及其研发现状 生物大分子药物及其现状 生物药物 肽 蛋白质 抗体 核酸 基因 疫苗 糖治疗剂 基于细胞或组织的治疗剂已批准的生物药物 超过250个 包括重组蛋白质 血液产品 单克隆抗体和重组疫苗药物应用最多的为重组蛋白质和抗体主要用于治疗癌症 艾滋病 冠心病 糖尿病和一些罕见的遗传疾病等 年销售额 40亿美元的基因工程药物 至2010年底 FDA共批准250种生物技术药物上市2007年销售额超过40亿美元的药物有16种 基因工程药物占据7种 1 治疗非霍奇金淋巴瘤的anti CD20抗体Rituxan2 治疗乳腺癌的anti EGFRII抗体Herceptin3 治疗肿瘤放化疗后出现的白细胞减少的G CSF4 治疗肺癌 乳腺癌和结直肠癌的anti VEGF抗体Avastin5 治疗类风湿关节炎的anti TNF 抗体Enbrel Remicade 生物制药发展迅速 1982 2008年美国FDA批准的新生物产品 2008年美国处于临床试验的生物技术药物 按产品类型分类按适应症分类 重组生物药物的研发过程 各种天然存在的治疗蛋白质E coli等微生物表达 药效更强的蛋白质工程产品多种表达体系开发应用 突变技术融合蛋白质表达定向进化基因渗入基因敲除 活性提高稳定性增加半衰期增加免疫原性减少 真核哺乳动物细胞为主 一 生物技术药物的研发过程及关键环节 药物的设计 药物的靶点及药物设计药物的生产 表达体系和质量控制药物的评估 药效和毒副作用 一 药物设计 药物靶点研究 探讨致病分子机理 寻找合适的药物治疗新靶点单个靶点的多种生物学功能及精细调控单个靶点的多种存在形式 亚型个体化治疗 针对特异人群的靶向诊断试剂和治疗药物多个信号途径的相互作用 网络病理学从老药中寻找治疗疾病的新靶点 不明确靶点的老药有17 发现老药的新型治疗用途 二 生物药物的生产 高效表达系统生产工艺质量控制 生物制药的生产 表达系统 原核表达真核表达 表达系统 大肠杆菌枯草杆菌青枯病产碱杆菌假单胞菌NPro自身蛋白酶融合技术 NAFT 山德士公司 新微生物表达系统 酵母丝状真菌昆虫 杆状病毒表达系统植物哺乳动物细胞表达系统转基因动物生物反应器 FDA批准的生物药物表达系统 细菌酵母哺乳动物 原核表达系统 大肠杆菌E coli 安全 经典的标准化表达系统 成本低廉 工艺成熟 表达量高简单蛋白质药物生产不可或缺的表达系统2000年后 在欧美新药的研究中比例减少2005年至今美国FDA批准的重组蛋白质药物都是真核表达 缺点 容易形成包涵体 寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构 须变复性处理 易造成活性下降或丧失 提取时需破碎细胞 往往会造成核酸 热原 内毒素或脂多糖的释放 不存在翻译后修饰作用 蛋白质产物不能糖基化 目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基 容易引起免疫反应 真核表达系统 酵母 酿酒酵母Saccharomycescerevisiae 应用最多 限制 糖基化修饰中糖链结构和组成与天然糖蛋白相差甚远 不适用糖链极大影响生物活性的蛋白质 EPO 治疗性抗体等 哺乳动物细胞表达系统 具有准确的转录后修饰功能 表达的蛋白在分子结构 理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子 具有重组基因的高效扩增和表达能力 外源蛋白整合稳定 具有产物胞外分泌功能 便于下游产物分离纯化 能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养 可以大规模生产 美国FDA倾向在21世纪都采用真核表达系统生产蛋白质药物 欧美生物制药哺乳动物细胞表达产品 现有的利用哺乳动物细胞表达的药物中有70 是以CHO表达生产的 RonaldA Rader ExpressionSystemsforProcessandProductImprovement BioProcessInternationalJUNE2008 构建的重组CHO细胞生产效率低 产物浓度亦低某些糖基化表达产物不稳定 不易纯化上游构建与下游分离纯化脱节重组细胞培养费用昂贵 自动化水平低下 缺点 研究方向 发展新的强启动子和合适的增强子提高基因剂量的新途径选择载体 宿主的最优组合装配适合于cDNA高效表达的必要元件大规模培养条件和无血清及无蛋白培养条件的探索 CHO细胞表达系统的不足和改进 表达系统发展方向 研发可表达复杂的真核基因的真核微生物系统或改造的原核微生物系统真核表达系统中糖基化系统的重构用作生物反应器的转基因动物系统 动物乳腺生物反应器 利用动物乳腺天然 高效合成并分泌蛋白的能力 在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称 2006年6月 世界上第一个利用乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物 重组人抗凝血酶 ATryn 的上市许可申请获得了欧洲医药评价署人用医药产品委员会批准 2009年获得美国FDA批准上市 三 生物药物的质量控制 新的蛋白质纯度检测指标 化学修饰类型 脱氨基 二硫键错配 氧化存在状态 降解片段 二聚体 多聚体糖基化蛋白质错误折叠 二 生物药物的药效和副作用改善 基因工程改造 现有上市重组药物中基因改造率达30 以上翻译后修饰 一 生物药物的基因工程改造 原则 改变蛋白结构 在不弱化其生物功能及产生新的抗原性基础上优化其药代动力学实例 Lispro 重组人胰岛素B28 B29之间颠换 聚体的可能性降低1 300 起速效作用ReFacto 重组凝血因子VIII为缺失突变体 血友病有较好的疗效注意 基因工程改变序列应非常谨慎 一些很小的变化可能导致蛋白构象的较大变化 诱发免疫反应 二 生物技术药物的翻译后修饰 PEG修饰 聚乙二醇 polyethylene PEG 共价修饰蛋白质糖基化修饰脂肪酸 白蛋白修饰融合蛋白 不同蛋白的不同功能域通过基因工程手段构建成一个蛋白 具有双功能或新的功能 I 生物药物的PEG修饰 增加蛋白质的分子量 减少小分子蛋白药物被肾小管直接过滤清除作用作为屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇 减少免疫原性 减少体内清除率保护蛋白质不易被蛋白酶水解提高溶解性 流动性 延长药物作用 减少毒副作用 已上市的PEG化蛋白药物PEG修饰前后体内半衰期比较 II 生物药物的糖基化修饰 蛋白糖基化是真核生物常见的蛋白质翻译后修饰过程三种形式 N 糖苷 N glycan O 糖苷 O gly2can 糖基磷脂酰肌醇 glycosylphosphatidylinositol GPI 蛋白质经糖基化修饰后产生数千种具有独特生物活性糖蛋白 参与机体生命活动 在蛋白药物表面增加侧链长度 增加蛋白质稳定性 阻碍蛋白酶对蛋白药物的降解使蛋白药物分子量增大 减少了肾小球滤过率 定点突变增加生物药物的糖基化水平 糖基化提高生物药物稳定性 糖基化 干扰素 热变性的敏感性降低糖基化 白细胞介素 5 IL 5 热稳定性增加糖基化 rhEPO 在盐酸胍 加热和pH变化中比去糖基化rhEPO稳定糖基化 rhEPO 免受氧自由基损伤 糖基化增加蛋白质药物的生物活性 减少免疫原性 rhEPO糖基化修饰产物 血浆中的半衰期显著延长 体内活性大大增强 单次注射小鼠时 相当于30 40倍的非糖基化rhEPO活性瘦素加成糖类似物 治疗糖尿病小鼠疗效增加10倍 时间维持更长mpl配体加成N 连接糖类似物 明显改善小鼠中血小板生成量和持续时间IgG1糖基化 极大消弱抗体依赖性细胞毒性和补体依赖性细胞毒性R05072759 GA101 第一个进入临床试验的人源化和糖基化CD20单抗 体内外研究疗效优于利妥昔单抗 糖基化提高蛋白类药物的血浆半衰期 EPO的33位和88位糖基化修饰 体内半衰期是未糖基化修饰的3倍 Amgen公司研制已上市 突变体TK tPA 糖基化tPA T103Q 296 299四等位基因替换 延长了体内清除时间 同时保持正常的凝血活性糖基化 IL 3 聚集在细胞外基质中 血浆半衰期提高了2倍 糖基化提高蛋白质药物的靶向治疗作用 葡萄糖脑苷脂酶 GBA 甘露糖结合 靶向肝中的巨噬细胞唾液酸糖蛋白受体与含有末端半乳糖或氮乙酰半乳糖胺的糖蛋白结合 可作为组织特异性蛋白质靶向带有特异性靶向病毒复制位点糖基化干扰素 有可能减小其毒性 III 脂肪酸 白蛋白修饰延长半衰期 SOD 白蛋白 半衰期由5min提高至6h 超氧化物歧化酶 SuperoxideDismutase SOD 白蛋白 GH 半衰期由5min提高至2 3h 生长激素insulindetemir 脂肪酸修饰后的长效胰岛素类似物 NovoNordisk公司研发 2004年5月在瑞士首次上市干扰素 2b 白蛋白 Interferonalfa 2b albumin 修饰的人白蛋白 干扰素 丙肝用药 能延长干扰素的半衰期 IV 融合蛋白 Enbrel Amgen TNF受体和IgG的Fc片段的融合蛋白 含934个氨基酸残基 适应症为风湿性关节 1998年批准 OntakLigand 缺失细胞结合域的白喉毒素与IL 2的N端133个氨基酸残基的融合蛋白 适应症为皮肤T细胞淋巴瘤 1999年上市 AmeviveBiogenIdec LEF 3的CD2与IgG的Fc片段的融合蛋白 适应症牛皮癣 2003年上市 1 抗体药物具有高度特异性 是靶向治疗的基础2 目前批准上市27种抗体药物 临床转化率以及批准成功率都较高3 抗体药物生产条件复杂 不易受仿制的威胁4 已上市的抗体药物具有很高的市场回报率 大大刺激了投资 抗体药物是大分子糖蛋白 结构复杂 不利储存 不能口服 进入体内5 7天才能到达靶位置 2 抗体药物研发费用较高 达10 18亿美元抗体药物单剂用量大 质量标准高 生产成本高昂 价格昂贵Avastin 单个病人年度费用高达4 6万美元 三 抗体药物研发 缺点 抗体自身的抗原性抗体靶抗原的不确定性针对不同表位可能产生完全相反的生物学效应抗体治疗的脱靶 抗体药物临床存在问题 使用剂量大 1克 人 年 抗体生产厂商的年生产规模在几十至几百公斤 年 固定资产投入大 建造年产抗体300 500公斤的工厂 需要4亿 5亿美元投资生产成本高 一般在2000 5000美元 克抗体抗体药物的剂量大多在2 6克 人 年 病人的抗体药费负担在1 4万美元 人 年销售单价低 治疗肿瘤或类风湿关节炎的抗体药物的价格约3000 8000美元 克CHO表达的EPO 其销售单价约200万美元 克抗体类药物是价格最接近生产成本的一类生物技术药物 抗体药物的生产瓶颈 生产成本过高 解决方法 抗体药物靶向药物 抗体核酸小分子 第二部分 生物大分子药物传递系统的研究 蛋白质 多肽药物载体型传递系统研究进展 蛋白质 多肽药物的特点 结构复杂 理化性质不稳定 口服给药易受胃肠道pH 菌群及酶系统破坏 稳定性差分子量大 生物膜穿透性差 吸收难 生物利用度低药理活性高生物半衰期短 体内清除率高 市场上的多肽 蛋白药物制剂及存在的问题 肠溶片和肠溶胶囊优点 患者顺应性好缺点 多肽 蛋白生物利用度低溶液剂和冻干粉针剂优点 疗效确切缺点 稳定性较差多肽 蛋白半衰期短 多次注射给药患者顺应性差靶向性问题 在体内只与特定的受体结合起作用 受体在组织的分布影响多肽的药效 80年代开始国外主要研制的新剂型 非注射途径给药及长效注射剂 非注射途径给药 口服 鼻腔 肺部 颊含 直肠 透皮 眼部 阴道等 非注射途径给药的主要屏障是致密的肠上皮细胞膜 胃酸和各种消化酶 即生物膜及酶屏障 研究多肽 蛋白非注射途径给药制剂的重点 提高其对生物膜的通透性和抵抗酶的降解作 主要方法有 化学修饰吸收促进剂脂质体固体微粒 微粒穿过胃肠道上皮的3种可能吸收和转运途径 I paracellularuptake II endocytoticuptakebyenterocytesand III Mcells 载体型传递系统思路 用适当的载体材料包裹 以减少药物与胃肠道中的酶类的直接接触 避免降解载体材料应具有生物黏附性 以利定位释放 提高局部的药物浓度 促进吸收考虑使用吸收促进方法来增加药物对胃肠道上皮细胞的透过性 口服生物大分子药物可通过肠多肽转运系统及Peyer spatches等吸收 载体 实现药物传输之关键 生物可降解材料有PLA PLGA等保护蛋白药物不受降解 延长释放时间 或脉冲释放上市药物 亮丙瑞林 Leuprolideacetate PLGA微球那法瑞林缓释微球注射剂重组人生长因子缓释微球注射剂 生物可降解微球 氨化明胶微球 AGMS 鼻腔给药系统 动物试验表明 干粉状AGMS能够显著提高大鼠鼻腔胰岛素的吸收 药物和微球之间的静电作用被认为是影响药物释放行为的主要因素 pH敏感微球 一种pH敏感结肠定位微球提高了降钙素 CT Calcitonin 的口服生物利用度IL 2 PLGA微球 现有给药方法受剂量依赖的毒性和副作用限制 局部给药的PLGA IL 2微球实现了IL 2的缓释 原位微球 将药物与可生物降解的聚合物溶解在特定的溶剂中形成注射剂 当注入体内后 聚合物随着溶剂的扩散而固化 从而形成微球 达到控制释药的目的 与常规的注射微球和皮下埋植剂相比 原位微球具有制备工艺简单 控释可靠及使用方便的优点 最近 FDA批准了AtrixLab公司生产的亮丙瑞林 leuprolide 缓释注射液 商品名Eligard 经小口径针头皮下注射后在体内形成微球 释放出亮丙瑞林 已用于晚期前列腺癌的姑息治疗 聚合物修饰 PEG修饰 PEGylation 脂质体 Liposome 肺部给药胰岛素脂质体肺脏表面积大 粘膜层薄 血管丛丰富 为蛋白类药物的吸收的好途径 但人体气道的复杂性和呼吸运动的影响使得肺部给药问题重重 Huang等研制的载胰岛素脂质体气雾剂 包封率达40 粒径约1 m 有效增加药物在肺部滞留时间 提高疗效 胰岛素脂质体在小鼠肺泡内均匀分布 DepoFoam IGF 1DepoTech公司开发了缓释多囊脂质体制剂技术 DepoFoam 它是一种脂质体多囊颗粒 每个颗粒内部有含水的药室 能溶解水溶性药物如蛋白质或多肽 室外由脂薄膜包裹 其中 Depol 胰岛素样生长因子 1 IGF 1 可以在体内连续10d释放药物 半衰期达142h 而未包囊的IGF 1仅为4h 胶束 有的肿瘤血管开口较小而脂质体体积过大 故难以通过EPR效应在肿瘤内部产生有效聚集 因此 一些体积较小的传递系统将更有效 如蛋白 聚合物结合物及载药胶束 2 5纳米粒 纳米粒体内分布有一定靶向性缓释特性生物利用度提高药物透皮吸收与细胞内药效发挥 举例 供口服和皮下注射INS聚氰基丙烯酸酯纳米粒体内试验表明降皮下注射INS纳米粒降血糖效果能持续6 72h 而口服INS纳米粒的效果也显著好于未包裹的胰岛素 InternationalJournalofPharmaceutics 288 2005 289 293CaCO3 纳米粒作为胰岛素动物试验结果表明 这一透皮给药系统能显著降低正常和糖尿病大鼠的血糖水平 为开发胰岛素纳米透皮给药系统提供了有力支持 DiabetesTechnolTher2006Jun Vol 8 3 pp 369 74 偶联单抗OX26的壳聚糖 PEG纳米粒的脑靶向研究Z DEVD FMK是一种特异性抑制Caspase酶的多肽 能够减少神经细胞的衰亡 但这一分子无法跨越血脑屏障 BBB 利用亲和素生物素复合物技术 ABC 设计CS PEG OX26纳米粒 其能通过转铁蛋白受体介导的跨膜转运穿过BBB 其他载体 无痛微针Microneedle透皮给药胰岛素 寡核苷酸 蛋白疫苗 DNA疫苗 细胞穿透多肽CellpenetratingpeptideGros等发现Pep 1能有效传递不少多肽 蛋白质药物进入细胞内 而无须进行化学交连 Pep 1在生理条件下稳定 毒性低 对血清不敏感等优点 故可以运用于蛋白多肽类药物传递系统的研究 其可能的机制似乎并不涉及内吞途径 而是一种直接的跨膜行为 可能的跨膜机制 反向胶束 反向胶束转运直接渗透转运吞饮转运 3待解决的问题 如何实现体内药物传输 如何延长药物体内驻留时间 改变蛋白质体内药物动力学和体内分布性质 如何维持制剂过程中的蛋白质结构完整性 如何开发新剂型和新技术 是否适于大生产 成本的问题 疫苗载体型传递系统的研究进展 疫苗免疫是控制微生物传播性疾病的有效手段 甚至被寄予治疗癌症的厚望 传统疫苗存在很多问题 多次免疫 不稳定性 细胞免疫应答差现代疫苗同样存在问题 免疫原性低使用载体传递系统是解决方法之一 微粒载体传递系统 微球可生物降解微球一直是疫苗传递系统研究的重点 将疫苗包裹于微球之中具有很多优势 保护抗原增加抗原递呈细胞 APCs 的摄取缓释作用 近年来的研究热点提高载体材料的亲水性 减缓降解速率以延长药物的释放时间寻找适合的内水相 提高载药量如复乳法提高疫苗在制备或释放过程中的稳定性表面吸附载药 用带负电的载体材料 制成微球后表面吸附带正电的HIV 1Tat疫苗 免疫效果较好如何提高微球穿过粘膜屏障的能力 扩散屏障 肠腔 Peyer氏节 肠系膜淋巴结 对于所产生的抗体强度有很大的影响 纳米粒载体传递系统与非包裹疫苗相比具有以下优势 保护抗原抗原递呈细胞的限制性分布高载药量缓释作用靶向传递作用与微球比较具有以下优势 在粘膜相关的淋巴组织 MALT 的吸收提高几倍到100多倍 且粒径越小则吸收越好 有可能通过小肠上皮细胞的细胞旁路吸收 近年来的研究热点 粒径及电荷的影响细胞模型研究经皮给药 生物黏附载体给药系统生物可降解微粒在粘膜给药中的吸收效率较低 通过使用生物黏附材料 增加微粒在粘膜表面的滞留时间 可以进一步提高微粒的吸收效率 壳聚糖 缺点 a 中性及碱性条件下水溶性差b 在生理pH条件下不带电 因此失去增加细胞旁路转运的能力 优势 a 有较好黏附作用b 可促进细胞旁路转运c 微粒制备条件温和d 高载药量 壳聚糖衍生物主要解决壳聚糖的水溶性问题 同时增加黏附力 增加所带电荷密度等特征 三甲基壳聚糖 TMC pH敏感疫苗传递系统对于口服给药系统来说 引起口服免疫失败的最大原因仍然是胃内的低pH值以及消化道内的蛋白水解酶对疫苗的降解作用 使用pH敏感材料包裹疫苗或对微粒进行包衣 可以使疫苗在较高的pH环境下或定位释放 以减少由于疫苗过早释放所带来的不必要的损失 脂质体及脂质体相关的给药系统 脂质体是具有双层磷脂膜结构的微囊 抗原可以于脂质体相结合或连接到脂质体的表面 由于脂质体的免疫佐剂活性不强 因此可将佐剂和抗原共同包裹或结合到脂质体的表面以提高免疫效力 脂质体相关的给药系统融合脂质体 Fusogenicliposomes 通过融合靶细胞促进包裹药物的细胞内传递囊泡体 Fusogenicvesosomes 用融合脂质体膜包裹阳离子融合脂质体制成囊泡体 Fusogenicvesosomes 将包裹的脂质体直接释放进入抗原递呈细胞的包浆 减少了单纯使用阳离子融合脂质体时 抗原在进入细胞前的释放胆盐体 bilosomes 在胃酸中可有效保护脂质体胆盐是具有穿透效应的天然脂质 还可增加了脂质体的粘膜穿透效力和生物相容性 脂质体 鱼精蛋白 DNA复合物病毒小体 Virosomes 是包含病毒膜蛋白的脂质体复合物 已在欧洲通过审查 将作为对抗A型肝炎病毒和流行感冒的免疫制剂用于鼻腔给药 类病毒颗粒 Virus likepartic