时出现Smear及非特异性条带的推荐解决方案.doc

PCRQuestion-1电泳时出现Smear，为什么？Answer-1原因建议酶量过多0.5U间隔递减变性时间过短变性时间5sec间隔递增变性温度过低变性温度0.5间隔递增dNTP量过少50M间隔递增Extension时间过长1min间隔递减循环次数过多2个循环间隔递减Template量过多Template量20间隔递减Question-2出现很多非特异性DNA带，为什么？Answer-2原因建议Primer浓度过高0.1M间隔递减Primer的设计不合理改变Primer的位置，增强特异性。设计Primer长度为3035mer，增强特异性。酶量过多0.5U间隔递减循环次数过多2各循环间隔递减Anneal温度过低2间隔递增从室温上升至变性温度（9498）过程中引起的Primer非特异性Annealing采用Hot start法或Cool Start法Extension时间过短1min间隔递增Template量过多Template量20递减Question-3设计PCR用引物时的注意事项？Answer-3可以从以下几个方面考虑：1. 引物长度通常为2025mer。但进行Long PCR时，引物长度应增长为3035mer。2. 二条引物之间不能进行Annealing，对3端的3个碱基需特别注意。3. GC含量在5060，避开局部富含GC或AT，为了使引物和模板稳定结合，3端应避开AT rich结构。4. 避开引物自身形成二级结构。5. 选择Tm温度相互接近的二条引物。Question-4PCR用引物的Tm值的计算方法？Answer-4引物为20mer以下时：Tm2（AT）4（GC）引物为20mer以上时：Tm81.50.41（GC）600/L其中L为引物的长度。在PCR反应过程中选择Annealing温度时，一般为（Tm5）Question-5PCR用引物的使用量？Answer-5合适的终浓度可在0.1M1.0M之间选择。引物的浓度太低时，有时扩增产物太少；引物浓度太高时，比较容易出现非特异性扩增反应。通常模板DNA的量较多或High complexity DNA（例如Human genome DNA）作模板时，引物浓度应低一些；档模板DNA的量较少或Low complexity DNA（例如Plasmid等）作模板时，引物浓度应高一些。Real-time PCR（SYBR Green法）Question-1引物设计注意事项？Answer-11. 引物长度。引物长度推荐1725mer，引物的Tm值为6068，上、下游引物的Tm值应该尽量接近。2. 引物之间的互补性。两条引物之间尽量不要有互补序列，特别是3末端之间不要有3个碱基以上的连续互补，这样可以有效防止由于引物二聚体的形成而造成的扩增效率低下。3. 引物自身的二级结构。为了避免引物自身二级结构（发夹结构）的形成，避免引物内部含有4个以上的互补序列。4. GC含量。GC含量为4060（最好为4555），不要有局部的GC-rich或AT-rich。5. Tm值。Tm值是指50双链DNA解离为单链DNA时的温度（Melting Temperature）。因为只有引物与模板DNA互补之后，才开始延伸反应，所以退火温度必须设定在引物的Tm值之下。而温度过低，容易发生非特异性退火，降低特异性扩增效率。所以，如果有几对候补引物时，为了提高特异性，通常选择Tm值高的引物对。另外如果一对引物的Tm值有差异，要以低Tm值的引物为标准设定退火温度。注意了以上要点进行引物设计，从经验上看退火温度为5565时，能得到良好的结果。当完全没有得到PCR产物时，要继续降低退火温度；当有非特异性产物扩增时，要继续提高退火温度。Question-2怎样判断扩增结果的好坏？Answer-21. 扩增曲线会在多少个循环起峰（即留意Ct值大小）。通常Ct值越小越好，但有时过早出现容易产生非特异性扩增，应引起重视。2. 扩增曲线的形状。理想的曲线形状是倾斜度大的曲线，相反，倾斜度小的曲线是不理想的。3. 通过熔解曲线分析和电泳验证反应特异性。选择只有单一的目的产物扩增的反应条件进行设定。但是如果Tm值较低的副产物难以去除时，也可以通过设定检测条件，只对目的产物进行特异性检测。Question-3怎样通过设定检测条件去除Tm值较低的副产物？Answer-3有时即使进行了条件优化，也很难获得只有单一目的产物的特异性扩增的反应条件，此时如果副产物的Tm值比目的产物的Tm值低很多（得到的熔解曲线的负一次微分曲线（-dF/dT）各Tm值的峰是独立的），也可以通过检测条件的设定，达到除去副产物而只对目的产物进行特异性检测的目的。通常荧光信号检测步骤设定为与延伸反应同步，然而此时目的产物和副产物都呈双链状态，由于SYBR Green的非特异性嵌入双链DNA，目的产物和副产物都会发出荧光，所以必须将检测步骤设定在副产物已经解离，目的产物未解离的温度，此时可以做到只对目