《食品毒理学》实验指导书.doc

前 言食品毒理学（food toxicology）是研究食品中可能存在的、威胁人类健康的有害因素及其预防措施，以提高食品的卫生质量、保护食用者饮食安全的科学。食品毒理学与食品科学联系紧密，在食品的结构，保藏，添加剂使用，代用品推广等过程中都需要食品毒理学的知识来解决“能否使用或食用”或“使用和食用方法是否恰当”等问题，因此它是食品质量与安全专业，食品科学专业等学生必修专业特色课。要求学生要有生物学、生物化学、微生物学、食品营养与卫生等学科的知识基础。本课程任务在于使食品质量与安全专业、食品科学与工程专业的学生掌握食品毒理学的基本理论、基本知识和基本的实验技能，掌握毒理学研究的主要手段即动物实验，能够通过实验动物模型，最终通过外源化学物对实验动物的毒性反应，向人（原型）外推，以期评估外源化学物对人的危害及危险性，从而筛选和预测外源化学物的急慢性毒性和致畸、致癌及致突变性机制研究，完成外源化学物的毒理学安全性评价。实验教学基本要求：要求学生明确实验的目的和意义，理解实验原理，学习毒理学实验中有关动物实验的基本操作技术，掌握实验动物的选则、动物抓取、染毒方法和生物材料的采集、测定和毒性评价等技术。写出完整的实验报告。目 录实验一 动物实验一般操作技术（一）4实验二 动物实验操作技术（二）7实验三 急性毒性实验12实验四 经口LD50测定14实验五 皮肤刺激实验21附件1 实验报告基本内容要求23附件2 实验报告格式24附件3 农药登记毒理学试验方法G验一 动物实验一般操作技术（一）实验学时：3实验类型：操作实验要求：必做一、实验目的通过本次实验使学生掌握健康动物的选择，动物性别的辨认，动物的抓取与固定，动物的编号和分组，动物被毛的去除。二、实验内容 1、动物性别的辨认；2、动物的抓取与固定；3、动物的编号与分组；4、动物被毛的去除。三、实验原理、方法和手段（一）动物性别辨认一般情况下，哺乳类动物性别依据动物的肛门与外生殖器(阴茎或阴道)之间的距离加以区分。雄性要比雌性的距离更长。（二）动物抓取与固定在进行实验时，为了不损伤动物的健康，不影响观察指标，并防止被动物咬伤，首先要限制动物的活动，使动物处于安静状态，工作人员必须掌握合理的抓取固定方法。抓取动物前，必须对各种动物的一般习性有所了解。操作时要小心仔细、大胆敏捷、熟练准确、不能粗暴，不能恐吓动物，同时，要爱惜动物，使动物少受痛苦。四、实验组织运行要求 根据本实验的特点、要求和具体条件，采用以学生自主训练为主的开放模式组织教学。五、实验条件1. 实验动物：雌雄相同数量的健康成年小鼠2. 材料：0.5中性红或品红溶液、3-5苦味酸溶液、煤焦油的酒精溶液、硫化钠、肥皂粉、淀粉、医用手套、剪刀、烧杯六、实验步骤（一） 动物性别辨认大、小鼠雌雄动物肛门与外生殖器间距离如右图所示。（二） 动物抓取与固定1、小鼠小鼠性情较温顺，一般不会咬人，比较容易抓取固定。通常用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠笼盖或其它粗糙表面上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指捏住其双耳及颈部皮肤，将小鼠置于左手掌心、无名指和小指夹其背部皮肤和尾部，即可将小鼠完全固定。在一些特殊实验中，如进行尾静脉注射时，可使用特殊的固定装置进行固定，如尾静脉注射架或粗的玻璃试管。如要进行手术或心脏采血应先行麻醉再操作，如进行解剖实验则必须先行无痛处死后再进行。2、大鼠大鼠的门齿很长，在抓取方法不当而受到惊吓或激怒时易将操作者手指咬伤，所以，不要突然袭击式地去抓它，取用时应轻抓住其尾巴后提起，置于实验台上，用玻璃钟罩扣住或置于大鼠固定盒内，这样即可进行尾静脉取血或注射。如要作腹腔注射或灌胃等操作时，实验者应戴上棉纱手套(有经验者也可不戴)，右手轻轻抓住大鼠的尾巴向后拉，但要避免抓其尖端，以防尾巴尖端皮肤脱落，左手抓紧鼠两耳和头颈部的皮肤，并将大鼠固定在左手中，右手即可进行操作。（三） 动物的编号和分组实验动物常需要标记以示区别。编号的方法很多，根据动物的种类数量和观察时间长短等因素来选择合适的标记方法。1挂牌法：将号码烙压在圆形或方形金属牌上(最好用铝或不锈钢的，它可长期使用不生锈)，或将号码按实验分组编号烙在栓动物颈部的皮带上，将此颈圈固定在动物颈部。该法适用于狗等大型动物。2打号法：用刺数钳(又称耳号钳)将号码打在动物耳朵上。打号前用蘸有酒精的棉球擦净耳朵，用耳号钳刺上号码，然后在烙印部位用棉球蘸上溶在食醋里的黑墨水擦抹。该法适用于耳朵比较大的兔、狗等动物。3针刺法：用七号或八号针头蘸取少量碳素墨水，在耳部、前后肢以及尾部等处刺入皮下，在受刺部位留有一黑色标记。该法适用于大小鼠、豚鼠等。在实验动物数量少的情况下，也可用于兔、狗等动物。4化学药品涂染动物被毛法：经常应用的涂染化学药品有涂染红色：0.5中性红或品红溶液。涂染黄色：3-5苦味酸溶液。涂染黑色：煤焦油的酒精溶液。根据实验分组编号的需要，可用一种化学药品涂染实验动物动物背部被毛就可以。如果实验动物数量较多，则可以选择两种染料。该方法对于实验周期短的实验动物较合适，时间长了染料易退掉；对于哺乳期的子畜也不适合，因母畜容易咬死子畜或把染料舔掉。5剪毛法：该法适用于大、中型动物，如狗、兔等。方法是用剪毛刀在动物一侧或背部剪出号码，此法编号清楚可靠，但只适于短期观察。6打孔或剪缺口法：可用打孔机在兔耳一定位置打一小孔来表示一定的号码。如用剪子剪缺口，应在剪后用滑石粉捻一下，以免愈合后看不出来。该法可以编至19999号，此种方法常在饲养大量动物时作为终身号采用。 大鼠和小鼠的编号一般都用不同颜料涂染皮毛的方法来标记，常用的涂染化学品如下涂染黄色用35%苦味酸溶液;涂红色用0.5%品红溶液等。前者最常用。在动物固定的不同部位涂上苦味酸斑点表示不同号码。一般习惯在左前腿上为1，腰部为2，在左后腿上为3，在头部为4，在正中为5，在尾基部位6，在右前腿为7，在右侧要不为8，在右后退上为9，不涂染鼠为10。如果试验时动物编号超过10，可在动物同一部位上再涂染另一种涂染剂。标记方法如右图所示。（四） 动物被毛的去除在动物实验中，被毛有时会影响实验操作与观察，因此必须除去。除去被毛的方法有剪毛、拔毛、剃毛和脱毛等。1剪毛法：剪毛法是将动物固定后，先用蘸有水的纱布把被毛浸湿，再用剪毛剪刀紧贴皮肤剪去被毛。不可用手提起被毛，以免剪破皮肤。剪下的毛应集中放在一容器内，防止到处飞扬。给狗、羊等动物采血或新生乳牛放血制备血清常用此法。2拔毛法：拔毛法是用拇指和食指拔去被毛的方法。在兔耳缘静脉注射或尾静脉注射时常用此法。3剃毛法：剃毛法是用剃毛刀剃去动物被毛的方法。如动物被毛较长，先要用剪刀将其剪短，再用刷子蘸温肥皂水将剃毛部位浸透，然后再用剃毛刀除毛。本法适用于暴露外科手术区。4脱毛法：脱毛法是用化学药品脱去动物被毛的方法。首先将被毛剪短，然后用棉球蘸取脱毛剂，在所需部位涂一薄层，23分钟后用温水洗去脱落的被毛，用纱布擦干，再涂一层油脂即可。 适用于狗等大动物的脱毛剂配方为：硫化钠10g，生石灰15g，溶于100ml水中。 适用于兔、鼠等动物的脱毛剂的配方为：. 硫化钠3g，肥皂粉1g，淀粉7g，加适量水调成糊状；. 硫化钠8g，淀粉7g，糖4g，甘油5g，硼砂1g，加水75ml；. 硫化钠8g溶于100ml水中。七、注意事项不要激惹动物，防止被动物咬伤。八、思考题1、 抓拿动物时的注意事项？2、 动物编号的原则？3、 动物被毛的去除方法及注意事项？九、实验报告按“贵州大学实验报告”要求与格式完成实验报告。实验二 动物实验操作技术（二）实验学时：3实验类型：操作实验要求：必做一、实验目的通过本次实验使学生掌握实验动物基本状况，染毒的方法及生物标本的采集二、实验内容 检验实验动物基本状况；学习动物实验的染毒方法；学习动物生物标本的采集。三、实验原理、方法和手段实验动物的基本状况调查（一）实验动物背景资料记录（1）实验动物来源、种类、年龄、性别、原编号、体重、临床症状等。（2）剖检时间、地点，麻醉方法、时间、麻醉者，处死方法、解剖者、记录人、温度、湿度。（3）其他指标：动物剖杀前禁食（不禁水）时间一致，为12h。（二）体表检查一般用于组织学取材的实验动物剖杀前应先隔离检疫710d，用于实验组和对照组动物的病理剖检视不同动物实验的要求而定。剖检前的体表检查项目如下：1 发育状态体格发育是否与年龄、品种相称，各部发育比例是否正常，有无畸形。2 营养状态丰满还是消瘦，检查时可用手抚摸实验动物背、腰部，营养良好时，背腰部厚实，皮肤弹性好。营养不良时，背腰部椎骨突出，肋骨明显。3 精神状态实验动物的自主活动、运动情况，对外界的反应（迟钝或亢进）、步态如何。4 感觉器官眼睛的瞳孔是否清晰等，有无分泌物，眼睑有无发炎及红肿，球结膜颜色变化，有否潮红、苍白、黄染或发绀。5 呼吸系统呼吸动物如呼吸次数、节律、有无呼吸困难；上呼吸道检查如鼻腔分泌物多少、有无喷嚏和咳嗽；必要时可通过听诊检查肺部。6 消化系统采食与饮水观察，包括食欲废绝、减退、亢进和异嗜，口腔黏膜颜色和气味。有无呕吐、腹泻、便秘，肛周有无污物，粪便数量、硬度、颜色、气味等。7 被毛和皮肤检查皮肤颜色、温度、弹性、有无创伤、脓疡、疥癣、湿疹，毛发色泽、疏密、有无脱落。实验动物的给药在动物实验中，为了观察药物对机体功能、代谢及形态引起的变化，常需要将药物注入动物体内。给药的途径和方法多种多样，可根据实验目的、实验动物种类和药物剂型、剂量等情况确定。(一)注射给药法1. 皮下注射 注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入，固定后即可进行注射。一般小鼠在背部或前肢腋下，大鼠在背部或侧下腹部；豚鼠在后大腿内侧、背部等脂肪少的部位；兔在背部或耳根部注射；蛙可在脊背部淋巴囊注射；狗多在大腿外侧注射，拔针时，轻按针孔片刻，防药液逸出。2. 皮内注射 此法用于观察皮肤血管的通透性变化或观察皮内反应。 如将一定量的放射性同位素溶液、颜料或致炎物质、药物等注入皮内，观察其消失速度和局部血液循环变化，作为皮肤血管通透性观察指标之一。3. 肌肉注射 当给动物注射不溶于水而混悬于油或其他溶剂中的药物时，常采用肌肉注射。肌肉注射一般选用肌肉发达、无大血管经过的部位，多选臀部。4. 腹腔注射 此法大小鼠用的较多。5. 静脉注射 是将药液直接注射于静脉管内，使其随着血液分布全身，迅速奏效。但排泄较快，作用时间较短。(二)经口给药法1. 口服法：把药物放入饲料或溶于饮水中让动物自动摄取。此法优点在于简单方便，缺点是不能保证剂量准确。一般适用于对动物疾病的防治或某些药物的毒性实验，制造某些与食物有关的人类疾病动物模型。2. 灌胃法：在急性实验中，多采用灌胃法。此法剂量准确。灌胃法是用灌胃器将所应投给动物的药灌到动物胃内。灌胃器由注射器和特殊的灌胃针构成。小鼠的灌胃针长约45cm，直径为1mm，大鼠的灌胃针长约68cm，直径约1.2mm。灌胃针的尖端焊有一小圆金属球，金属球为中空的。焊金属球的目的是防止针头刺入气管或损伤消化道。针头金属球端弯曲成20左右的角度，以适应口腔、食道的生理弯曲度走向。(三)其它途径给药方法1. 呼吸道给药：呈粉尘、气体及蒸气或雾等状态的药物或毒气，均需要通过动物呼吸道给药。如实验时给动物乙醚作吸入麻醉、用锯末烟雾制作慢性气管炎动物模型等，特别在毒理学实验中应用更为广泛。2. 皮肤给药：为了鉴定药物或毒物经皮肤的吸收作用、局部作用、 致敏作用和光感作用等，均需采用经皮肤给药方法。3. 脊髓腔内给药：此法主要用于锥管麻醉或抽取脑脊液。4. 脑内给药：此法常用于微生物学动物实验，将病原体等接种于被检动物脑内，然后观察接种后的各种变化。5. 直肠内给药：此种方法常用于动物麻醉。兔直肠内给药时，常采用灌肠的胶皮管或用14号导尿管代替。6. 关节腔内给药：此法常用于关节炎的动物模型复制。生物标本的采集采血法实验研究中，经常要采集实验动物的血液进行常规质量检测、细胞学实验或进行生物化学分析，故必须掌握正确的采集血液的技术。采血方法的选择，主要决定于实验的目的和所需血量以及动物种类。（一）、大鼠、小鼠的采血方法1、剪尾采血：需血量很少时常用本法，如作红、白细胞计数、血红蛋白测定、制作血涂片等可与此法。2、眼眶后静脉丛采血：用本法在短期内可重复采血。小鼠一次可采血0.20.3ml，大鼠一次可采血0.51.0ml。3、颈(股)静脉或颈(股)动脉采血：将鼠麻醉，剪去一侧颈部外侧被毛，作颈静脉或颈动脉分离手术，用注射器即可抽出所需血量。大鼠多采用股静脉或股动脉。4、摘眼球采血：此法常用于鼠类大量采血。5、断头采血：用剪子迅速剪掉动物头部，立即将动物颈朝下，提起动物，血液可流入已准备好的容器中。四、实验组织运行要求 根据本实验的特点、要求和具体条件，采用以学生自主训练为主的开放模式组织教学。五、实验条件1. 实验动物：雌雄相同数量的健康成年小鼠2. 材料：体温计、动物称、听诊器、灭菌注射器、灌胃器、灭菌生理盐水、剪刀、镊子、酒精、碘酒、棉花球等六、实验步骤实验动物的基本状况调查（一）实验动物背景资料记录（1） 实验动物来源、种类、年龄、性别、原编号、体重、临床症状等。（2） 剖检时间、地点，麻醉方法、时间、麻醉者，处死方法、解剖者、记录人、温度、湿度。（3） 其他指标：动物剖杀前禁食（不禁水）时间一致，为12h。（二）体表检查1 发育状态2 营养状态3 精神状态4 感觉器官5 呼吸系统6 消化系统7 被毛和皮肤实验动物的给药 (一)注射给药法1. 皮下注射 方法是：注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入，固定后即可进行注射。一般小鼠在背部或前肢腋下，大鼠在背部或侧下腹部；豚鼠在后大腿内侧、背部等脂肪少的部位；兔在背部或耳根部注射；蛙可在脊背部淋巴囊注射；狗多在大腿外侧注射，拔针时，轻按针孔片刻，防药液逸出。2. 皮内注射 方法是：将动物注射部位的毛剪去，消毒后，用皮试针头紧贴皮肤皮层刺入皮内，然后使针头向上挑起并再稍刺入，即可注射药液。注射后可见皮肤表面鼓起一白色小皮丘。3. 肌肉注射 方法是：注射时针头要垂直快速刺入肌肉，如无回血现象即可注射。给大、小鼠作肌肉注射时，选大腿外侧肌肉进行注射。4. 腹腔注射 方法是：先将动物固定，腹部用酒精棉球擦试消毒，然后在左或右侧腹部将针头刺入皮下，沿皮下向前推进约0.5厘米，再使针头与皮肤呈45 度角方向穿过腹肌刺入腹腔，此时有落空感，回抽无肠液、尿液后，缓缓推入药液。5. 静脉注射 方法是：小鼠、大鼠的静脉注射常采用尾静脉注射。鼠尾静脉共有3根， 左右两侧和背侧各1根，两侧尾静脉比较容易固定，故常被采用。操作时，先将动物固定在暴露尾部的固定器内(可用烧杯、铁丝罩或粗试管等物代替)，用75酒精棉球反复擦试使血管扩张， 并可使表皮角质软化，以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧，使静脉充盈，注射时针头尽量采取与尾部平行的角度进针。开始注射时宜少量缓注，如无阻力，表示针头已进入静脉，这时用左手指将针和尾一起固定起来，解除对尾根部的压迫后，便可进行注射。如有白色皮丘出现，说明未穿刺入血管，应重新向尾部方向移动针头再次穿刺。注射完毕后把尾部向注射侧弯曲以止血。如需反复注射，尽量从尾的末端开始。 一次的注射量为每10g体重0.1-0.2ml。(二)经口给药法1. 口服法：把药物放入饲料或溶于饮水中让动物自动摄取。此法优点在于简单方便，缺点是不能保证剂量准确。一般适用于对动物疾病的防治或某些药物的毒性实验，制造某些与食物有关的人类疾病动物模型。2. 灌胃法：鼠类的灌胃法是用左手固定鼠，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的口腔插入，压迫鼠的头部，使口腔与食道成一直线，将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，可感到轻微的阻力，此时可略改变一下灌胃针方向，以刺激引起吞咽动作，顺势将药液注入。一般灌胃针插入小鼠深度为34cm，大鼠或豚鼠为46cm。常用灌胃量小鼠为0.21ml，大鼠14ml，豚鼠15ml。 狗、兔的灌胃法是先将动物固定，再将开口器的小孔插入动物口中，再慢慢沿上鄂壁插入食道，将灌胃管的外端浸入水中，如有气泡逸出，则说明灌胃管误入气管，需拔出重插。插好后，将注射器连于灌胃管将药液推入。灌胃结束后，先拔出灌胃管，再拿出开口器。一次灌胃能耐受的最大容积兔为80100ml，狗为 200 250ml。(三)其它途径给药方法1. 呼吸道给药：呈粉尘、气体及蒸气或雾等状态的药物或毒气，均需要通过动物呼吸道给药。如实验时给动物乙醚作吸入麻醉、用锯末烟雾制作慢性气管炎动物模型等，特别在毒理学实验中应用更为广泛。2. 皮肤给药：兔和豚鼠常采用背部一定面积的皮肤脱毛后，将一定的药液涂在皮肤上，药液经皮肤吸收。生物标本的采集采血法（一）、大鼠、小鼠的采血方法1、剪尾采血：动物麻醉后，将尾尖剪去约5mm，从尾部向尾尖部按摩，血即从断端流出。也可用刀割破尾动脉或尾静脉，让血液自行流出。如不麻醉，采血量较小。采血结束后，消毒、止血。用此法每只鼠可采血10余次。小鼠可每次采血约0.1ml，大鼠约0.4ml。2、眼眶后静脉丛采血：穿刺采用一根特制的长710cm硬的玻璃取血管，其一端内径为1 1.5mm，另一端逐渐扩大，细端长约1cm即可，将取血管浸入1肝素溶液，干燥后使用。采血时，左手拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并轻轻压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分外突，提示眼眶后静脉丛冲血。右手持取血管，将其尖端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入，当感到有阻力时即停止刺入，旋转取血管以切开静脉丛，血液即流入取血管中。采血结束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。3、颈(股)静脉或颈(股)动脉采血：大鼠股静脉或股动脉采血方法是：大鼠经麻醉后，剪开腹股沟处皮肤，即可看到股静脉，把此静脉剪断或用注射器采血即可，股动脉较深需剥离出，再采血。4、摘眼球采血：采血时，用左手固定动物，压迫眼球，尽量使眼球突出，右手用镊子或止血钳迅速摘除眼球，眼眶内很快流出血液。5、断头采血：用剪子迅速剪掉动物头部，立即将动物颈朝下，提起动物，血液可流入已准备好的容器中。七、注意事项不要激惹动物，防止被动物咬伤。八、思考题1、 记录实验动物的基本情况调查结果，评定实验动物的健康状况。2、 动物实验中，几种注射法给药有何注意事项，各有何优缺点？九、实验报告按“贵州大学实验报告”要求与格式完成实验报告。实验三 急性毒性实验实验学时：3实验类型：综合实验要求：必做一、实验目的学习急性实验的设计原则，学会经口灌胃技术，随机分组方法二、实验内容 1、急性毒性实验设计；2、经口灌胃技术；3、实验动物随机分组；三、实验组织运行要求根据本实验的特点、要求和具体条件，采用以学生自主训练为主的开放模式组织教学。四、实验条件1. 实验动物：雌雄相同数量的健康成年小鼠2. 材料：灭菌注射器、灭菌灌胃针、酒精、碘酒、棉花球、镊子、剪刀、医用手套、灭菌生理盐水等五、实验步骤（一）、急性实验的设计原则1对照性原则 对照性原则是要求在实验中设立可与实验组比较，用以消除各种无关因素影响的对照组。实验研究一般都把实验对象随机分设对照。可以采用同体对照，即同一动物在施加实验因素前后所获得的不同结果和数据各成一组，作为前后的对照，或同一动物在施加实验因素的一侧与不施加实验因素的另一侧作左右的对照；也可采用异体对照，即一组施加实验因素，一组不施加实验因素。不作任何实验处理给生理盐水进行比较的对照组称“空白对照或“阴性对照”；施行正常值、标准值处理进行比较的对照组称“标准对照”或“阳性对照”。对照各组均应在同一条件下，否则失去对照意义。2重复性原则 重复性原则是指同一处理要设置多个样本例数。一般估测的样本数：小动物(小鼠、大鼠)每组10-30例：计量资料每组不少于10例，计数资料每组不少于20例。中等动物(豚鼠、家兔)每组8-20例；计量资料每组不少于8例，计数资料每组不少于20例。大动物(犬、猫)每组6-20例；计量资料每组不少于6例，计数资料每组不少于20例。3随机性原则随机性原则就是按照机遇均等的原则进行分组。其目的是使一切干扰因素造成的实验误差尽量减少，而不受实验者主管因素或其他偏性误差的影响。随机化的手段可采用编号卡片抽签法，随机数字表或采用计算机的随机数字键。（二）、经口灌胃技术将受试物配制成溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃内。一般灌胃深度从口至剑突下，最好是利用等容量灌胃法，即受试物配制成不同浓度，实验动物单位体重的灌胃容量相同。大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食4小时(因小鼠消化吸收和代谢速度较快)，均不停饮水。灌胃后24小时提供饲料。经口多次染毒，一般不禁食，但应每日定时染毒。灌胃法优点是剂量准确，缺点是工作量大，并有伤及食道或误入气管的可能。（三）、随机分组方法(1)分组的原则：进行动物实验时，经常需要将选择好的实验动物按研究的需要分成若干组。动物分组应按随机分配的原则，使每只动物都有同等机会被分配到各个实验组与对照组中去，以避免各组之间的差别，影响实验结果，特别是进行准确的统计检验，必须在随机分组的基础上进行。每组动物数量应按实验周期长短、实验类型及统计学要求而定。如果是慢性实验或需要定期处死动物进行检验的实验，就要求选较多的动物，以补足动物自然死亡和认为处死所丧失的数量，确保实验结束时有合乎统计学要求的动物数量存在。(2)建立对照组：分组时应建立对照组。1.自身对照组：是指实验数据而言。实验动物本身在实验处理前、后两个阶段的各项相关数据就分别是对照组和实验组的实验结果，此法可排除生物间的个体差异。2.平行对照组：有正对照组和负对照组两种。给实验组动物某种处理，而给正对照组用同样方法进行处理，但并不采用实验所要求的药物或手段，负对照组则不给任何处理。3.具体分组时，应避免人为因素， 随机把所有的动物进行编号，然后令其双数为组(实验组)，单数为B组(对照组)即可或反之。如果要分若干个组时，应该用随机数字表示进行完全随机分组。六、注意事项不要激惹动物，防止被动物咬伤。小心使用注射器，防止扎伤。七、思考题1、 随机分组的原则及优点如何？2、 灌胃试验的注意事项？3、 急性毒性试验的设计原理？八、实验报告按“贵州大学实验报告”要求与格式完成实验报告。实验四 经口LD50测定实验学时：6实验类型：设计实验要求：必做一、实验目的掌握主要的LD50计算方法和急性毒性分级标准，动物的处死及解剖方法。二、实验内容 1、亚硝酸盐LD50的测定；2、对照组小鼠处死；3、病理解剖；4、脏器测量和称重三、实验原理、方法和手段实验动物处死方法 实验动物的处死方法很多，应根据动物实验目的、实验动物品种（品系）、以及需要采集标本的部位等因素，选择不同的处死方法。无论采用哪一种方法，都应遵循安乐死的原则。安乐死是指在不影响动物实验结果的前提下，使实验动物短时间无痛苦地死亡。处死实验动物时应注意，首先要保证实验人员的安全；其次要确认实验动物已经死亡，通过对呼吸、心跳、瞳孔、神经反射等指征的观察，对死亡作出综合判断；再者要注意环保，避免污染环境，还要妥善处理好尸体。（一）、颈椎脱臼处死法此法是将实验动物的颈椎脱臼，断离脊髓致死，为大、小鼠最常用的处死方法。操作时实验人员用右手抓住鼠尾根部并将其提起，放在鼠笼盖或其他粗糙面上，用左手拇指、食指用力向下按压鼠头及颈部，右手抓住鼠尾根部用力拉向后上方，造成颈椎脱臼，脊髓与脑干断离，实验动物立即死亡。（二）、断头处死法此法适用于鼠类等较小的实验动物。操作时，实验人员用左手按住实验动物的背部，拇指夹住实验动物右腋窝，食指和中指夹住左前肢，右手用剪刀在鼠颈部垂直将鼠头剪断，使实验动物因脑脊髓断离且大量出血死亡。（三）、击打头盖骨处死法主要用于豚鼠和兔的处死。操作时抓住实验动物尾部并提起，用木锤等硬物猛烈打击实验动物头部，使大脑中枢遭到破坏，实验动物痉挛并死亡。（四）、放血处死法此法适用于各种实验动物。具体做法是将实验动物的股动脉、颈动脉、腹主动脉剪断或剪破、刺穿实验动物的心脏放血，导致急性大出血、休克、死亡。犬、猴等大动物应在轻度麻醉状态下，在股三角做横切口，将股动脉、股静脉全部暴露并切断，让血液流出。操作时用自来水不断冲洗切口及血液，既可保持血液畅流无阻，又可保持操作台清洁，使实验动物急性大出血死亡。（五）、空气栓塞处死法处死兔、猫、犬常用此法。向实验动物静脉内注入一定量的空气，形成肺动脉或冠状动脉空气栓塞，或导致心腔内充满气泡，心脏收缩时气泡变小，心脏舒张时气泡变大，从而影响回心血液量和心输出量，引起循环障碍、休克、死亡。空气栓塞处死法注入的空气量，猫和兔为2050ml，犬为90160ml。（六）、过量麻醉处死法此法多用于处死豚鼠和家兔。快速过量注射非挥发性麻醉药（投药量为深麻醉时的30倍），或让动物吸入过量的乙醚，使实验动物中枢神经经过过度抑制，导致死亡。（七）、毒气处死法 让实验动物吸入大量CO2等气体而中毒死亡。病理解剖方法（一）、病理取材基本要求（1） 病理检查应分层次进行，先进行一般外观观察，然后剖检观察，再进行光镜详细检查。（2） 通常选择正常与病变交界处组织，即包括病变本身及病变周围组织。（3） 对照组动物相同器官取材时，选材部位应尽量一致。（4） 肉眼看不到的明显病变时，各试验组选取标本位置应一致。（5） 所选组织应包括脏器全部层次结构或重要结构，如肾应包括皮质、髓质和肾盂。（6） 体积大和分叶的器官，应视不同组织选取多个部位，小器官可整体取材并固定，如淋巴结、扁桃体、甲状腺等。（7） 胃肠标本应将内容物冲洗掉，以免内容物影响组织固定，产生自溶。（8） 所取材料应尽量保持肉眼标本完整性，不宜过厚或过薄，一般厚约35mm，大小为1.52cm2。（9） 切取组织时不要挤压，使用锋利刀具，少用剪刀，勿选用被器械钳压过的部位。（10）标本取材要熟悉，尽可能快的完成整个过程，特别是易自溶的组织，如肠道、脑、腺体等。（11）剖检记录应客观、详细，用形象描述而不能用诊断的病名来代替。（12）同一实验中的对照组和实验组动物应交叉剖检，严格统一各种条件和操作，尽量避免各种可能的干扰因素。（二）、病理剖检基本操作1常用器械及使用方法解剖刀 主要用于切开和分割软组织，刀片宜用血管钳（可持针钳）夹持安装，避免割伤手指。常用的持刀法有以下4种：执弓式、抓持式、执笔式、反挑式。手术剪 用于分离与剪开血管钳 用于分离和钳夹组织，钳夹缝合针和布巾等。手术镊 用于夹持组织，以利于解剖和缝合。拉钩 用于牵引和暴露2基本操作切开 在同一平面上时，先绷紧组织，将刀刃与平面垂直，用力要得当，一次垂直切开，切口整齐而不偏斜，禁止斜切和锯切，以减少损伤。切开多层组织时，一般应按组织层次分层切开，避免损伤深层组织器官。组织分离法 可用锐性分离法，使用刀、剪等锐性器械直接切割，如皮肤、黏膜、精细结构和紧密连结组织的分离；也可用钝性分离法，使用分柄、止血钳、剥离器，手指等分离，如肌肉，疏松结缔组织等的分离。结扎 用丝线打结的方法扎组织和血管，参与缝合器官和皮肤。止血 大量出血导致胸、腹部积血使剖检视野模糊不清，可能会影响和干扰病变的辨别和取材，因此动物剖检有时要求止血。A 纱布块压迫止血法。剖检过程中，为观察病变性质和部位，辨清组织和神经、血管通路，以及对较广泛的毛细血管渗出，可用纱布按压施行短暂性的止血，但不可用纱布来回擦拭血液，以免损伤组织。B 钳夹止血法。先用纱布块止血，看清出血点或血管后用止血钳的尖端垂直对准出血点，迅速而准确的钳夹并捻转，使血管闭塞而止血。C 结扎止血法。用于动脉出血或较大的血管出血。（三）、剖检取材程序1实验动物尸体的固定 通常为仰卧位固定。2剖检顺序 多为先腹腔后胸腔，再脑、脊髓、骨髓、皮肤肌肉等。取材顺序基本与此相同。3检查内容 位置 有无移位、异位 大小 体积增大、缩小或肿大 色泽 整体或局部颜色的增减改变。 附加物 有无出血、积液、粘连。 质地 硬、韧、软等。 切面 多汁、泡沫状、带血、脓汁、干燥等。 中空器官的黏膜面 有无出血、溃疡、增厚、隆起物等。4剖检和取材程度腹腔和腹腔器官沿腹部正中线切开剑突至肛门之间的腹前壁，再沿最低位肋骨分别向左右两侧切开侧腹壁至脊柱两旁，完全暴露腹腔器官。观察有无积液、血液和炎性渗出物，如有则用吸管吸出，测量容积并经离心沉淀涂片检查，必要时作细菌培养。检查粘膜是否光滑，有无充血、瘀血、出血、破裂、脓肿、粘连、肿瘤、寄生虫等，膈的紧张度及有无破裂。（A） 脾脏。检查大小、厚薄、硬度、性状、色泽、有否肥厚、破裂等。然后沿长轴将脾切成两半，切面要平整，检查脾小梁、红髓、滤泡的色泽，切面的出血量。（B） 胰腺。检查胰腺色泽和硬度，切面检查有无出血。（C） 胃肠。检查胃的大小、胃肠道浆膜面的色泽，有无粘连、肿瘤、寄生虫结节。然后沿胃大弯、肠系膜附着部依次剪开胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠。观察胃内有无异物，内容物的气味及性状，除去内容物，检查黏膜颜色，有无充血、出血、化脓。采用边剪开边观察的办法检查肠管，观察肠内容物数量、性状，有无气体、血液、异物、寄生虫，肠黏膜皱壁有无增厚、水肿、充血、粘液量、溃疡、坏死、淋巴组织性状及有无炎症。（D） 肾脏。首先检查肾脏大小、硬度、被膜是否容易剥离，肾表面的色泽、平滑度，有无疤痕、出血变化。然后检查切面皮质和髓质的色泽，有无瘀血、出血、化脓和梗死。注意观察皮质和髓质交界处的切面是否隆突，以及肾盂、输尿管、肾淋巴结的性状，有无肿瘤及寄生虫等。（E） 肝脏。首先检查肝脏大小、被膜性状、边缘厚薄、实质的硬度和色泽，以及肝淋巴结、血管、肝管等的性状。然后作切面，检查切面的出血量、色泽，肝小叶性状、有无脓肿、肝坏死等变化。（F） 肾上腺。观察外形、大小、色泽和硬度，作纵切和横切，检查皮质和髓质的色泽及有无出血。盆腔器官（A）膀胱。检查膀胱的大小、尿量及色泽，黏膜有无出血、炎症和结石等。（B）雄性生殖器官。检查睾丸、附睾、凝固腺、前列腺有无粘连、出血、水肿、积液等。（C） 雌性生殖器官。沿子宫体背侧剪开子宫角，检查子宫内膜的色泽、有无充血、出血、炎症等，观察卵巢和输卵管有无粘连、出血、水肿、积液等。胸腔、口腔及其器官用镊子夹住胸骨剑突，剪断膈肌与胸骨的连结，提起胸骨，在胸椎两侧分别剪断左、右侧胸壁的肋骨，取下整个胸壁，打开胸腔，依次取出胸腺和心脏。将下颌骨的两下颌支内侧与舌连结的肌肉切断，将咽、喉、气管、食道与周围组织分离，用镊子夹住气管向上提起，剪断肺与胸膜的连结韧带，然后将咽、喉、气管、食道连同整个肺脏一并取出。如有积液应观察其数量和性状，尽量吸取，测量容积并涂片，检查胸膜色泽，有无出血、充血或粘连。（A） 心脏。剪开心包膜，暴露心脏，注意心包的光泽度及心包内液体的情况，心脏的大小、外形、心外膜情况。自下腔静脉入口处至右心房作直线剖开，从此直线中点沿心脏右缘剖至心尖部，从距离心尖部与心室间隔右侧1cm处平行地剖至肺动脉；检查右心房、右心室、三尖瓣、肺动脉瓣、腱索有否病变。自左右静脉入口处将左心房直线切开，沿心脏左缘剖至心尖部，再从距离心尖部与心室间隔左侧1cm处平行地剖开左心室的前壁和主动脉，检查二尖瓣、主动脉瓣、腱索有无病变，左心房、左心室内壁有无出血和感染。自冠状动脉口起剪开前降支和旋支，在主动脉根部右侧，于右心室的心外膜找到右冠状动脉主干，先横切一刀，再剪至后降支；观察有无粥样硬化和血栓等。（B） 口腔。检查牙齿的变化，口腔黏膜的色泽、有无外伤、溃疡和白斑，舌黏膜有无出血、外伤及舌苔的情况。（C） 咽喉。观察喉头、会厌软骨黏膜的色泽、淋巴结的性状及喉囊有无积脓。（D） 鼻腔。检查鼻腔和鼻中隔黏膜色泽、有无出血、炎性水肿、结节、糜烂、溃疡穿孔及疤痕等。（E） 下颌及颈部淋巴结。检查下颌及颈部淋巴结的大小、硬度、有无出血和化脓等。（F） 气管。检查气管有无出血、黏液量等。（G） 肺脏。检查肺的色泽、有无出血、炎症、肺气肿、肺萎缩、肿瘤等。（H） 其他器官。胸腺，甲状腺，扁桃体等的色泽、有无粘连、出血、水肿等。颅腔及脑以猴为例，剥离颅顶部软组织，沿眉弓至枕外隆凸上0.5cm处的连线，用弓形锯环绕该线锯开颅骨外板及板障，然后用丁字凿轻轻凿开内板，揭开颅盖，此时可见覆盖于脑表面的硬脑膜，切开硬脑膜暴露脑组织，在距颅骨锯口断端上0.5cm处，从前向后环行剪开硬脑膜，枕部的硬脑膜应保留1.5cm长，防止取脑过程向后推压脑组织时，枕骨断端损坏枕叶脑组织。向后方轻轻揭起硬脑膜及大脑镰，暴露脑组织，用手指从额骨前上方伸入颅前窝，轻轻推压大脑额叶，直至见到筛板上的嗅球为止，切断嗅丝与嗅球的联系，将嗅球与脑一齐拉起，见到视神经和视交叉时立刻停止，在脑底附近依次切断颈内动脉、视神经，再将脑向后拉，可见到垂体及漏斗，继续将脑向后拉起，切断连于脑的脑神经。从脑干腹侧面把手术刀伸入枕骨大孔，切断脊髓，即可将脑取出，用流水冲洗干净备用。新鲜脑很软，易变形和受挫伤，操作过程中必须用手扶托，取出脑后应立刻用纱布包裹，浸泡固定液中保存，以免变形。 检查软脑膜、硬脑膜血管充盈情况，脑回之间的脑沟中液体的数量与色泽，脑表面凸起或凹下的地方是否明显，可用手触膜判定其硬度。用刀将脑做一水平切面，保留胼胝体，暴露侧脑室，注意检查尾状核有无出血、软化灶。侧脑室内容物数量、性质，然后将脑做多处切面，检查有无变化。（四）、脏器测量和称重1 解剖后应迅速将脏器称重，以免水分蒸发造成差异，特别是肾上腺等小器官的称重。2 脏器称重前应尽量将周围脂肪组织和结缔组织剔除，并用滤纸吸去脏器表面血液及体液，特别是肾上腺、甲状腺、前列腺等较小的器官，更要新鲜称重，防止器官干燥失水而重量减轻。3 空腔器官称重前，应清除其腔内液体，如心脏应除去血块。四、实验组织运行要求根据本实验的特点、要求和具体条件，采用以学生自主训练为主的开放模式组织教学。五、实验条件1. 实验动物：雌雄相同数量的健康成年小鼠2. 材料：灌胃器材1套，注射器，苦味酸酒精饱和液，亚硝酸钠，动物称等六、实验步骤 亚硝酸盐经口LD50的测定（一）实验动物的选择和性别鉴定1. 外观：健康动物的外观为体形丰满，发育正常，被毛浓密有光泽且紧贴身体。眼睛明亮，行动迅速，反应灵活，食欲良好。2. 性别鉴定：小鼠的性别主要依据肛门与生殖器之间距离区分，间距大者为雄性，小者为雌性。（二）小鼠灌胃染毒法测定亚硝酸钠半数致死浓度（LD50）1. 实验剂量选择及分组 本实验设计亚硝酸钠464，215，100，46.4mg/kg四个剂量，一个空白对照组。每组4只健康小鼠。2. 实验动物的性别鉴定、编号和称重 每组对本实验组的4只小鼠分别进行性别鉴定、编号和称重。称重感应量需在0.1g以下；编号采用染色法，常用苦味酸饱和液为染料。一般从头部开始编号，头部为1号，按顺时针方向向右前肢为2号，右肋为3号，右后肢为4号，尾部为5号，左后肢为6号，左肋为7号，左前肢为8号，背部为9号，不染色为10号。3. 亚硝酸钠溶液的配制 根据每只小鼠的重量和每组的实验剂量计算出每只小鼠的染毒量，根据灌胃的适量范围用蒸馏水配成0.51.0ml的溶液，进行灌胃。4. 灌胃染毒 将灌胃针与注射器连接后，吸取一定量受试物亚硝酸钠溶液。左手抓住小鼠头和背部皮肤，使鼠呈直力状，右手持注射器，沿小鼠咽喉壁左边经食道将灌胃针插入胃内（深度为34cm），注入受试物亚硝酸钠溶液。5. 观察灌胃后24h的小鼠死亡情况，记录后，根据霍氏LD50表查得亚硝酸盐的LD50值。参考GB156701995 进行，见附件3。实验动物处死与病理解剖（1） 对照组小鼠处死 （二）病理组与对照组解剖对比七、注意事项观察期间每3天称重一次，急性毒性试验可不做病理组织学检查，但对死亡动物应做大体病理学观察，存活动物实验结束时可做大体解剖学观察，肉眼观察到病变时取材做病理组织学检查，以便为下阶段毒性试验剂量选择提供参考材料。八、思考题1、 小鼠灌胃后24h，每组的死亡情况如何？2、 根据LD50表，由死亡数查出亚硝酸盐的LD50值为多少？3、 病理死亡组的小鼠组织器官与健康对照组的组织器官有哪些差异，从病变器官可得到什么启示？九、实验报告按“贵州大学实验报告”要求与格式完成实验报告。实验五 皮肤刺激实验实验学时：3实验类型：验证实验要求：必做一、实验目的掌握皮肤刺激实验的操作及实验观察方法二、实验内容 皮肤刺激实验；评定检测物的皮肤刺激反应分值与皮肤刺激强度分级。三、实验组织运行要求根据本实验的特点、要求和具体条件，采用以学生自主训练为主的开放模式组织教学。四、实验条件1. 试验农药：原药和制剂。2. 试验动物：兔或豚鼠，首选动物为白色家兔。至少4只皮肤完好的健康动物。3. 剂量：一次涂药量为0.5mL或0.5g。以动物自身皮肤做为对照。五、实验步骤1试验前24h将背部毛剪掉，面积约6cm2。2涂上试验农药，再用纱布盖上，以胶布固定或采用其他封闭性盖罩，避免试验动物舔食。3涂敷持续时间一般为4h。试验结束时用水或适当溶剂洗去残留农药，但注意不要损伤皮肤。4根据需要做进一步的观察，以确定反应的可逆性。一般观察期不超过14d。结果评定每一只动物试验结果按表1进行刺激反应评分，计算出平均分值，按表2进行强度评定。表 1皮肤刺激反应评分症状及程度积分A红斑形成无红斑勉强可见明显红斑中等至严重红斑紫红色斑并有焦痂形成B水肿形成无水肿勉强可见水肿隆起轮廓清楚水肿隆起约1mm水肿隆起超过1mm，范围扩大0123401234 总分A+B 表 2皮肤刺激强度分级强度分值无刺激性轻度刺激性中等刺激性强刺激性00.40.51.92.05.96.08.0注：pH2或pH11.5的农药可不进行本试验。六、注意事项对实验动物脱毛