银屑病与亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态位点A677V关系的....doc

银屑病与亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态位点A677V关系的研究银屑病与亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态位点A677V关系的研究中华皮肤科杂志 1999年第2期第32卷 论著作者：杨维玲王晓慧郑淑云孙智晶王柏秋傅松滨单位：杨维玲王晓慧郑淑云150001 哈尔滨医科大学附属第一医院；孙智晶王柏秋傅松滨哈尔滨医科大学生物遗传学研究室关键词：银屑病；四氢叶酸脱氢酶；聚合酶链反应限制性片段长度多态【摘要】目的探讨银屑病与亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态位点A677V的关系。方法采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性，检测了3个银屑病家系和39例银屑病患者的亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态位点A677V。结果银屑病患者亚甲基四氢叶酸还原酶不耐热缺陷与正常人有显著性差异。结论亚甲基四氢叶酸还原酶A677V突变型与银屑病发病相关。Study on the Relationship Between Psoriasis and the PolymorphicSite A677V of Methylenetetrahydrofolate Reductase GeneYANG Weiling,WANG Xiaohui,ZHENG Shuyun,et al.Department of Dermatology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University , Harbin 150001【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between polymorphic site A667V of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene and psoriasis .Methods PCR -RFLP method was used to detect the polymorphism of MTHFR gene in 3 psoriasis pedigrees and 39 psoriatics.Results Genotype frequencies of the psoriastics were A/A-20.51, A/V=48.72 and V/V=30.76 ;the allelic frequencies were A=0.4487 and V=0.5513.Conclusion There is a significant difference of MTHFR gene thermolabile defect between the psoriatics and the control, and our results demonstrate MTHFR gene is related to A667V mutant.【Key words】 PsoriasisTetrahydrofolate dehydrogenasePCR-RFLP人亚甲基四氢叶酸还原（methylenetetrahydrofolate reductase， MTHFR)基因定位在1P36.3，现已发现严重的MTHFR缺陷与其不耐热变化这两种变异是由基因不同突变引起的，其中不耐热MTHFR缺陷主要由MTHFR677密码子中C被T置换引起，这种突变直接影响MTHFR的活性和耐热性。已有报道脑血管、周围血管、冠状血管疾 病与MTHFR的不耐热变化密切相关。再者亦有报道，银屑病患者高血压和冠心病的相对危险性分别是正常人群的15.4倍和11倍。基于上述，我们以PCRRFLP方法检测了银屑病患者的MTHFR基因多态位点A677V，旨在探讨MTHFR基因多态位点A677V与银屑病发病的关系。材料和方法1.血样来源和基因组DNA提取：银屑病患者及其亲属共48例，其中男27例，女21例，静脉采血56mL，枸缘酸钠抗凝。应用常规酚氯仿抽提法，提取外周血基因组DNA。2.MTHFR基因特定片段的扩增及 TapI 酶切反应：应用提取的患者及正常对照组的基因组DNA为模板，PCR扩增基因组DNA中MTHFR基因。PCR反应总体积为30L，其中含模板200ng,TaqDNA聚合酶1.5U ，4dNTP50mol/L,引物各0.2mol/L, MgCl21.5mmol/L,Tris-HCl 20mmol/L(pH8.3),KCl 25mmol/L,0.05吐温20。应用美国PE公司DNA Thermal Cycler进行PCR扩增。PCR反应条件：94预变性5min；95 30s,62 30s，721min；72延长5min，PCR产物经2琼脂糖凝胶电泳检测结果，取10L PCR产物加入2U TaqI酶，10缓冲液2L , ddH2O 7.8L 65酶切15h，引物P1（NCO351）5- GAAGCAGGGAGCTTTGAGGC-3 ; P2(NCO352)5-CCCATGTCGGTGCATGCCTT-3。3.酶切产物电泳及检测：取10L酶切产物与2L 6加样缓冲液混合后上样于12（交联比=291）非变性聚丙烯酰胺凝胶，350V恒压电泳34h后揭胶，AgNO3染色后观察结果。结果1.2 琼脂糖凝胶电泳检测包含MTHFR基因677密码子的134bp片段PCR扩增产物。2.MTHFR677多态位点电泳图谱：含MTHFR677多态位点的片段酶解后，可分出3种基因型，此位点原有C被T置换后，产生一个TaqI限制性酶切位点，野生型A677/A677序列中无TaqI限制性酶切位点，只见一条电泳带，为134bp；杂合突变型A677/V677可见3条电泳带，分别为134bp、75bp、59bp，纯合突变型V677/V677可见2条电泳带，分别为75bp、59bp。表1银屑病患者亚甲基四氢叶酸还原酶A677V基因型频与等位基因频率组别例数基因型频率等位基因频率A/AA/VV/VAV患者一级亲属906333.33%66.67%银屑病患者398191244.87%55.13%正常对照组7926431060.13%39.87%注：A：野生型，V：突变型银屑病患者纯合突变型（V/V）与正常对照组之间，经2检验，P0.05，有显著性差异；其突变型基因频率（V）与正常对照组之间，经t检验，P0.05，无显著性差异。患者一级亲属纯合突变型（V/V）与正常对照组之间，经2检验，P0.05，无显著性差异；其突变型基因频率（V）与正常对照组之间，经t检验，P0.05，无显著性差异。讨论银屑病是一种以角质形成细胞过度增殖，不完全角化和炎症为特点的慢性皮肤病。目前认为银屑病是由多种因素（包括遗传因素、环境因素、社会心理因素）共同作用引起的病理改变，其确切发病机制尚不清楚。本文从分子生物学角度，研究了银屑病与MTHFR多态位点A677V的关系。结果表明，银屑病患者存在MTHFR不耐热缺陷，提示MTHFRA677V突变型与银屑病发病有一定相关。本实验对银屑病与MTHFR基因多态位点A677V的相关性进行了初步研究，表明银屑病与MTHFR基因多态位点A667V有一定的相关性。黑龙江省科委自然基金资助课题参考文献1Goyette P, Sumner JS,Milos R, et al.Human methylenetetrahydrofolate reductase:isolation of a cDNA,mapping and mutation identification. Nature Genet,1994,7:195200.2Kang SS,Zhou J,Wong PWK, et al.Intermediate homocysteinemia:a thermolabile variant of methylenetetrahydrofolate reductase.Am J Hum Genet，1998,43 :414421.3Goyette P,Frost P, Rosenblatt DS, et al.Seven novel mutations in the methylenetetrahydrofolate reductase gene and genotype/phenotype correlations in severe methylenetetrahydrofolate reductase deficiency. Am J Hum Genet， 1995,56:10521059.4Kang SS,Wong PW, Susmano A, et al.Thermolabile methylenetetrahydrofolate reductase:an inherited risk factor for coronary artery disease. Am J Hum Genet,1991,48:536545.5Kang SS,Passen EL,Ruggie N,et al.Thermolabile de